奧美拉唑原料藥微生物限度檢查法的方法學(xué)驗(yàn)證

王琪 黃臻輝

（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240）

奧美拉唑作為質(zhì)子泵抑制劑，有較強(qiáng)的抑制胃酸作用，主要用于治療十二指腸潰瘍和卓-艾綜合征，也可用于胃潰瘍和反流性食管炎[1]。其療效優(yōu)于H2受體拮抗劑及前列腺素E2、硫糖鋁、膠體鉍及大劑量抗酸劑，可迅速改善消化性潰瘍和反流性食管炎的癥狀。由于中國藥典2020年版中尚未收入其微生物限度檢查項(xiàng)，故通過驗(yàn)證確立其微生物檢查方法。

1 材料和方法

1.1 儀器

Sanyo MIR253恒溫培養(yǎng)箱、SANYO MLS-3750高壓蒸汽滅菌柜（三洋電機(jī)株式會(huì)社）；JY-5002型電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆?；HTY-601集菌儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；ESCO ClassⅡBSC生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）；HWS-24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 樣品、培養(yǎng)基與試劑試液

奧美拉唑原料藥（批號(hào)YF1203003、YF1203008、YF1112017，分別簡稱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，浙江金華康恩貝生物制藥有限公司）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA批號(hào)201119）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA批號(hào)201119）（上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；胰酪大豆胨瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基（TSA批號(hào)135025-201804）、沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基（SDA批號(hào)135013-201703）（中國食品藥品檢定研究院）； 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB批號(hào)201112，默克化工技術(shù)（上海）有限公司）；0.2、0.1和0.01 mol/L無菌NaOH溶液，0.9%無菌NaCl溶液，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（均為實(shí)驗(yàn)室自配，經(jīng)121 ℃、15 min滅菌后使用）。

1.3 菌種與菌液制備

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B）10104、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501、白色假絲酵母（Candida albicans）CMCC（F）98001、黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003菌種均由上海市食品藥品檢驗(yàn)所提供。參照中國藥典2020年版四部通則1105的方法培養(yǎng)菌種，制備成菌懸液或孢子懸液。

1.4 驗(yàn)證方法

1.4.1 培養(yǎng)基適用性檢查

采用涂布法，分別將1×103CFU/mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母和黑曲霉0.1 mL涂布在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基及其對(duì)照培養(yǎng)基上，將1×103CFU/mL的白色假絲酵母和黑曲霉0.1 mL涂布在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基及其對(duì)照培養(yǎng)基上，按中國藥典2020年版四部通則1105規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)[2-5]，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。

1.4.2 供試品稀釋劑的選擇及供試液的制備

由于奧美拉唑不溶于水，分別選擇0.01、0.1、0.2 mol/L三個(gè)濃度的無菌NaOH溶液做溶解性試驗(yàn)，挑選出適宜濃度的NaOH溶液作為稀釋劑，并確定該濃度溶液不會(huì)對(duì)試驗(yàn)造成干擾[2-5]。按平皿法，取溶解性試驗(yàn)確定后的濃度的無菌NaOH溶液10 mL，分別加入上述5種1×104CFU/mL的試驗(yàn)菌株0.1 mL，混勻作為稀釋劑組。然后取1 mL分別傾注15～20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿。同法測(cè)定，用0.9%無菌NaCl溶液替代稀釋劑，加入相應(yīng)的試驗(yàn)菌，作為菌液組。按中國藥典2020年版四部通則1105規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)后，取均值并計(jì)算回收率。

回收率=稀釋劑組菌落數(shù)/菌液組菌落數(shù)。

取每批供試品10 g加入到0.1 mol/L無菌NaOH溶液200 mL中，混勻后，作為1∶20供試液，進(jìn)行3次獨(dú)立平行微生物限度檢查試驗(yàn)。

1.4.3 平皿法

取供試液10 mL，分別加入上述5種1×104CFU/mL的試驗(yàn)菌株0.1 mL，混勻。然后取1 mL分別傾注15～20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，按中國藥典2020年版四部通則1105規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)作為試驗(yàn)組。同法測(cè)定，用0.9%無菌NaCl溶液替代供試液，加入相應(yīng)的試驗(yàn)菌，作為菌液組；測(cè)定供試液本底菌菌落數(shù)，作為供試液對(duì)照組。培養(yǎng)后對(duì)菌落計(jì)數(shù)，取均值并計(jì)算回收率[5-9]。

回收率=（試驗(yàn)組-供試液對(duì)照組）/菌液組。

1.4.4 薄膜法

取1∶20供試液20 mL過濾（濾膜孔徑為0.45 μm），用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，沖洗量分別為50、100、150 mL，然后分別加入上述5種1×103CFU/mL的試驗(yàn)菌0.1 mL，抽濾，取膜，貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基上作為試驗(yàn)組；同法測(cè)定，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，加入相應(yīng)的試驗(yàn)菌，作為菌液組。按3個(gè)沖洗量測(cè)定供試液本底菌菌落數(shù)，作為供試液對(duì)照組。按中國藥典2020年版四部通則1105的規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，平行制備2個(gè)平皿。培養(yǎng)后對(duì)菌落計(jì)數(shù)，取均值并計(jì)算回收率[5-9]。

回收率=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試液對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基適用性檢查

5種試驗(yàn)菌在兩種培養(yǎng)基上的回收率均在0.5～2范圍內(nèi)（表1、2），符合藥典規(guī)定，可用于供試品的方法適應(yīng)性試驗(yàn)。

表1 培養(yǎng)基適用性檢查1

表2 培養(yǎng)基適用性檢查2

2.2 稀釋劑的選擇

選取批號(hào)為YF1203003的奧美拉唑1 g進(jìn)行溶解性試驗(yàn)，結(jié)果表明，其在0.1 mol/L的無菌NaOH溶液20 mL中溶解良好（表3），可作為奧美拉唑稀釋劑；各試驗(yàn)菌在此濃度稀釋劑中的回收率均在0.5～2范圍內(nèi)，并確認(rèn)其對(duì)各微生物均無生長抑制作用（表4）。

表3 奧美拉唑在不同濃度、不同體積NaOH溶液中的溶解性

表4 各試驗(yàn)菌在稀釋劑中的回收率

2.3 平皿法試驗(yàn)

采用平皿法進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，單從需氧菌總數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)奧美拉唑原料藥供試液對(duì)銅綠假單胞菌和白色假絲酵母的生長有明顯的抑制作用，而對(duì)其余3種試驗(yàn)菌的生長均無抑制作用（回收率均在0.5～2的范圍內(nèi)）（表5），故需采用薄膜過濾法再次進(jìn)行驗(yàn)證。

表5 平皿法檢測(cè)各試驗(yàn)菌在供試液中的回收率

2.4 薄膜法試驗(yàn)

采用3種不同體積的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜后，5種受試微生物的回收率均在0.5～2的范圍內(nèi)（表6～8），表明薄膜法對(duì)微生物的生長均無影響。為盡量避免濾膜上的微生物可能受損傷，最終選擇最小沖洗量即50 mL/膜作為奧美拉唑微生物限度檢查的沖洗量。

表6 需氧菌（細(xì)菌）在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上的方法適用性試驗(yàn)

表7 需氧菌（真菌）在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上的方法適用性試驗(yàn)

表8 真菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的方法適用性試驗(yàn)

3 討論

經(jīng)兩次試驗(yàn)驗(yàn)證，從平皿法試驗(yàn)結(jié)果可以看出奧美拉唑?qū)瘘S色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和黑曲霉的生長均無抑制作用，但對(duì)銅綠假單胞菌和白色假絲酵母的生長有一定的抑制作用。采用薄膜法可消除其對(duì)一些微生物生長的抑制作用，表明薄膜法適用于奧美拉唑原料藥的微生物限度檢查[10]。

日常檢驗(yàn)中，可用10 g奧美拉唑原料藥溶解于200 mL 0.1 mol/L的無菌NaOH溶液中，制成1∶20的供試液，取供試液20 mL，過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液50 mL沖洗濾膜，可去除奧美拉唑?qū)︺~綠假單胞菌和白色假絲酵母生長的抑制作用，使微生物限度試驗(yàn)?zāi)苷＿M(jìn)行。

我們的研究結(jié)果顯示，奧美拉唑?qū)︺~綠假單胞菌和白色假絲酵母生長有一定的抑制作用，但其確切的作用機(jī)理尚不明確，還有待繼續(xù)研究探索。