正交法優(yōu)化黃芩愈傷組織誘導條件

王玉芬，姚東作，馬海會，牛顏冰，王德富

（山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801）

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）為唇形科（Lamiaceae）黃 芩 屬（Scutellaria）多 年 生 草 本 植物[1]，以干燥根入藥，已有數(shù)千年的歷史。其化學成分有黃酮類、揮發(fā)油、萜類和多糖等，主要活性成分為黃酮類化合物，包括黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素、含黃芩苷、野黃芩素和野黃芩苷[2-3]?，F(xiàn)代藥理學實驗表明，黃芩有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、保護腦組織、心腦血管和保肝等作用[4-5]，在臨床上多與其他藥物聯(lián)合使用。近年來，黃芩市場需求量大幅增長，野生資源極度匱乏，不能滿足市場需求，而人工栽培黃芩受遺傳和環(huán)境因素影響，其種質(zhì)差異較大，農(nóng)藥殘留，連作障礙，藥效成分含量偏低及其不穩(wěn)定性已成為黃芩栽培過程中的最大問題[6]。

植物組織培養(yǎng)技術是一種很好的替代途徑，自1902年HABERLANDTZ提出細胞全能性學說以來，組織培養(yǎng)得到了迅速發(fā)展，技術也日趨完善[7]。通過組織培養(yǎng)技術可以消除由遺傳差異帶來的影響，同時具備生長周期短、代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)條件可調(diào)控、沒有外界環(huán)境條件限制等優(yōu)勢，已成為諸多藥用植物獲取天然藥用成分的途徑之一。高山林等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩節(jié)間是誘導愈傷的最佳外植體，其次是節(jié)和葉片。齊香君等[9]以黃芩帶節(jié)莖段為外植體進行愈傷組織誘導，發(fā)現(xiàn)黑暗處理下愈傷組織顏色呈淡黃色，褐化率低，生長良好。吳曉玲等[10]以黃芩的子葉、真葉和下胚軸為材料誘導黃芩愈傷組織，發(fā)現(xiàn)真葉為最佳外植體，MS+0.5 mg/L 2,4-D+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最優(yōu)培養(yǎng)基。萬貴香等[11]探究不同濃度外源激素的添加對黃芩愈傷組織中有效成分的影響，發(fā)現(xiàn)單獨添加2，4-D會影響黃芩愈傷組織的生長，且會加重褐化程度。

目前，關于黃芩愈傷組織的誘導已有諸多報道，但大部分研究多采用的激素組合為6-BA和NAA，外植體也多選擇為莖段[12-13]。為進一步探究2，4-D單獨或與其他激素組合使用在黃芩愈傷組織誘導中的作用及對根、莖段和葉片的誘導情況，本試驗以黃芩根、莖段和葉片為材料，設立6-BA、NAA和2,4-D等3種激素不同濃度單因素及正交試驗處理，探究6-BA、NAA和2，4-D單獨或復配對黃芩愈傷組織誘導和生長的影響，進而篩選出適合黃芩愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基配方，旨在為黃芩等其他藥用植物愈傷組織誘導和優(yōu)化體系的建立提供一定經(jīng)驗借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇生長4周齡、長勢良好的黃芩組培苗，取黃芩葉片（約0.5 cm2）、莖段（約1 cm）和根部（約1 cm）為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗設計 將處理好的黃芩外植體（葉片、莖段和根）分別接種于添加不同質(zhì)量濃度6-BA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和2，4-D（0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的MS固體培養(yǎng)基上，每個處理10皿，每皿接種5個外植體，3次重復。隨時觀察其生長狀況，14 d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導率并分析其生長狀態(tài)。

1.2.2 6-BA和NAA雙因素試驗設計 在單因素試驗基礎上，確定6-BA、NAA兩激素的作用濃度范圍以及誘導黃芩外植體形成愈傷組織的最佳濃度，其因素水平如表1所示，共9個處理。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每個處理10皿，每皿接種6個外植體，3次重復。隨時觀察其生長狀況，28 d后統(tǒng)計其愈傷組織誘導率及生長情況。

表1 6-BA和NAA試驗設計Tab.1 6-BA and NAA experimental design

1.2.3 正交試驗設計 在單因素試驗基礎上，以6-BA、NAA和2，4-D為 條 件 進 行3因 素3水 平L9（33）正交試驗（表2），考察黃芩外植體在不同條件下的誘導情況，明確6-BA、NAA和2，4-D的不同水平對黃芩外植體（誘導率高的外植體）誘導的影響，篩選誘導黃芩外植體形成愈傷組織的最優(yōu)條件。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每個處理10皿，每皿接種5個外植體，3次重復。隨時觀察其生長狀況，28 d后統(tǒng)計黃芩愈傷組織誘導率及生長情況。

表2 正交試驗設計Tab.2 Orthogonal design

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得試驗數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0軟件處理，采用極差和方差分析各因素對正交試驗結(jié)果是否有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA、NAA、2,4-D愈傷組織誘導的單因素試驗結(jié)果

在激素6-BA處理下（圖1-A），有且只有莖段在質(zhì)量濃度為1.0、1.5、2.0 mg/L時可誘導出愈傷組織，誘導率分別為67.3%、87.3%和36.0%。在激素NAA處理下（圖1-B），莖段均可誘導產(chǎn)生愈傷組織，誘導率分別為34.7%、63.7%、71.3%和72.0%；葉在低質(zhì)量濃度（0.5、1.0 mg/L）下可誘導，誘導率分別為3.3%和4.9%，根仍無誘導發(fā)生。在激素2，4-D處理下（圖1-C），根、莖段和葉片均可誘導產(chǎn)生愈傷組織，其中莖段誘導率顯著高于根和葉片，均高于90%；在0.1 mg/L時，莖段有最大誘導率，可達98.3%。

圖1 6-BA、NAA和2，4-D不同濃度對黃芩根、莖和葉的誘導率Fig.1 Induction rate of different concentrations of 6-BA，NAA，and 2，4-D on the roots，stems，and leaves of Scutellaria baicalensis

在激素6-BA處理下，黃芩愈傷組織呈淡黃色至黃棕色，并伴隨長根和出芽現(xiàn)象。在NAA處理下，愈傷組織為淡黃色，黏性，分化程度較低，但在2.0 mg/L時已有褐化趨勢，結(jié)構(gòu)致密，為黃褐色，故此濃度不適合進行誘導。在2，4-D處理下，低濃度下愈傷組織為乳白色，結(jié)構(gòu)致密，質(zhì)地較硬；隨濃度增加，顏色逐步加深，質(zhì)地逐步變軟，水漬化程度加深；在激素濃度為2.0 mg/L時，褐化程度最嚴重，呈灰褐色。綜上，結(jié)合愈傷組織誘導率及其生長狀態(tài)，選用莖段為外植體，以1.0、1.5、2.0 mg/L的6-BA；0.5、1.0、1.5 mg/L的NAA和0.05、0.15、0.25 mg/L的2，4-D進行雙因素和正交試驗。

2.2 6-BA和NAA愈傷組織誘導的雙因素試驗結(jié)果

6-BA和NAA組合愈傷組織誘導的雙因素試驗結(jié)果如表3所示。

表3 6-BA和NAA組合試驗結(jié)果Tab.3 6-BA and NAA combination test results

在單因素試驗基礎上，以黃芩莖段為材料，不同質(zhì)量濃度的6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）進行雙因素試驗，共9個處理（表3）。9個不同處理均能誘導產(chǎn)生黃芩愈傷組織，且顏色為淡綠色或黃綠色，結(jié)構(gòu)緊密，質(zhì)地較硬，但伴隨有不同程度分化現(xiàn)象（圖2）。當6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，黃芩愈傷組織誘導率相對較高；NAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，黃芩愈傷組織分化程度較高，芽增殖系數(shù)大，NAA質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，愈傷組織誘導率最高，為81.11%。雖然9個處理均能誘導黃芩莖段形成愈傷組織，但都表現(xiàn)出不同程度的分化長芽現(xiàn)象，不適合進行繼代培養(yǎng)。因此，6-BA和NAA在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均不適合進行黃芩愈傷組織誘導，但可用于黃芩無菌苗繼代過程中芽的增殖，培養(yǎng)基選擇為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA或MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA。

圖2 6-BA和NAA激素組合對黃芩莖段的誘導情況Fig.2 Induction of 6-BA and NAA hormone combination on the stem segments of Scutellaria baicalensis

2.3 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎上，確定外植體為莖段，同時以6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）、NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和2，4-D（0.05、0.15、0.25 mg/L）為條件，設計3因素3水平的正交試驗，共9組，正交試驗結(jié)果如表4所示，9個處理均能成功誘導出愈傷組織，其中MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.25 mg/L 2，4-D的愈傷誘導率最高，為94.16%。由極差R分析可知，6-BA對黃芩莖段誘導愈傷組織的影響最大且差異顯著（P＜0.05，表5），2，4-D次之，NAA影響最小，后二者差異不顯著。由均值K值分析可知，6-BA的K值大小為K1＞K2＞K3，說明隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，黃芩愈傷組織誘導率逐步降低，激素最佳作用質(zhì)量濃度為1.0 mg/L；NAA的K值大小為K2＞K1＞K3，說明隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，黃芩愈傷組織的誘導率呈先升高后降低的趨勢，最佳作用質(zhì)量濃度為1.0 mg/L；2，4-D的K值大小為K2＞K3＞K1，說明隨著2，4-D質(zhì)量濃度的增加，黃芩莖段愈傷組織的誘導率呈先升高后降低的趨勢，激素最佳作用質(zhì)量濃度為0.15 mg/L。故以莖段為外植體，理論最佳試驗處理條件為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.15 mg/L 2，4-D，而在本試驗中，實際得到的最佳試驗組合為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.25 mg/L 2，4-D，激素2，4-D濃度稍有不同。此外，由圖3可知，除7、8號培養(yǎng)基（圖3-7、8）誘導的愈傷組織發(fā)生褐化、顏色呈黃棕色外，其他處理誘導的愈傷組織均生長良好，且顏色呈淡黃色或黃綠色，結(jié)構(gòu)較疏松，無明顯分化現(xiàn)象，可用于繼代培養(yǎng)。

圖3 6-BA、NAA和2，4-D激素組合對黃芩莖段的誘導情況Fig.3 Induction of 6-BA，NAA and 2，4-D hormone combination on the stem segments of Scutellaria baicalensis

表4 正交試驗結(jié)果分析Tab.4 Orthogonal test analysis

表5 方差分析Tab.5 Variance analysis

3 結(jié)論與討論

自1958年第1例植物離體培養(yǎng)成功以來，植物組織培養(yǎng)技術飛速發(fā)展，藥用植物組織培養(yǎng)也隨之發(fā)展。影響植物組織培養(yǎng)的因素有很多，包括培養(yǎng)基中大量元素（C、N、P和K源）和微量元素、外植體、植物激素和培養(yǎng)條件（溫度、光照和濕度等）等[15-16]。相關研究表明，6-BA的添加會提高多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）的活性，而黃芩苷作為黃芩的主要活性成分，其結(jié)構(gòu)上存在多個酚羥基，極易被POD氧化，從而導致愈傷組織發(fā)生褐化現(xiàn)象，影響其生長[17-18]。本試驗發(fā)現(xiàn)，黃芩愈傷組織隨著6-BA質(zhì)量濃度增加，其褐化現(xiàn)象會愈發(fā)嚴重，生長停滯，與前人研究結(jié)果一致。生長素類激素，如IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）和NAA在植物組織培養(yǎng)中多用于誘導植物產(chǎn)生不定根[19]。本研究也得到類似的結(jié)果，3種外植體在NAA作用下均可發(fā)生不同程度的生根現(xiàn)象，且外植體稍有膨大，原因可能是由于NAA刺激了愈傷相關基因的表達。在2，4-D誘導黃芩愈傷組織試驗中，發(fā)現(xiàn)低濃度下愈傷組織呈乳白色，而高濃度下愈傷組織呈黃褐色，褐化嚴重，說明低濃度2，4-D適合誘導愈傷組織，高濃度2，4-D則抑制生長，這與武羿君等[20]的研究結(jié)果一致，高濃度下細胞分裂速度快，生長不均衡，易褐化死亡。

在植物愈傷組織培養(yǎng)中，不同濃度和類型的激素組合對愈傷組織的誘導情況均有差異。在本研究中，6-BA和NAA誘導的愈傷組織呈淡綠色，結(jié)構(gòu)致密，發(fā)生分化，這與孟書亦[13]、羅毓健[21]研究結(jié)果不同。本研究前期愈傷組織表現(xiàn)為整體膨大，呈淡綠色，無分化現(xiàn)象，而20 d之后，綠色芽點開始出現(xiàn)，產(chǎn)生分化，可能是由環(huán)境和內(nèi)外源激素共同影響所致。在正交試驗中，黃芩愈傷組織呈淡黃色，生長良好，增殖迅速，無分化現(xiàn)象。方差分析表明，2，4-D對誘導黃芩愈傷組織的產(chǎn)生無顯著影響，但結(jié)合雙因素結(jié)果可知，添加2，4-D能顯著提高黃芩愈傷組織的誘導率，且極大降低分化程度，故認為添加低質(zhì)量濃度的2，4-D對黃芩愈傷組織的誘導作用明顯。2.0 mg/L 6-BA處理發(fā)生明顯褐化，推測應當是較高濃度6-BA和2，4-D共同作用從而提高多酚氧化酶活性，導致生長不均衡，發(fā)生褐化現(xiàn)象。

關于黃芩愈傷組織褐化問題，也是植物組織培養(yǎng)的普遍問題，已有諸多研究。一方面可以調(diào)節(jié)外源激素的種類和濃度，另一方面也可通過添加微量Vc（抗壞血酸）、CA（檸檬酸）、AC（活性炭）、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和活性炭來減緩[22-23]，但不同抗褐變劑對不同植物材料作用效果有所差異。目前，黃芩愈傷組織的誘導體系已初步建立，但激素之間的相互作用機制還尚未可知，科學界已對某些植物的誘導機制進行了揭示，如擬南芥愈傷組織的中層細胞具有干細胞特征，其屬性由特征轉(zhuǎn)錄因子WOX5/7維 持，WOX5/7通過與PLT和ARR12蛋白結(jié)合調(diào)控內(nèi)源生長素或細胞分裂素的產(chǎn)生，進而調(diào)控愈傷組織的進一步分化和器官再生[24-25]。但關于黃芩愈傷組織是如何通過植物激素調(diào)控其狀態(tài)及分化還需進一步研究。

本試驗以黃芩根、莖段和葉片為材料進行黃芩愈傷組織誘導試驗，結(jié)果表明，誘導黃芩愈傷組織的最適外植體依次為莖段＞根＞葉片，適合分化長芽的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，適合誘導愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.25 mg/L 2，4-D。結(jié)果可為后續(xù)利用黃芩愈傷組織進行大規(guī)模培養(yǎng)和活性成分的直接生產(chǎn)奠定基礎。