山羊β防御素124定位及過表達(dá)附睪頭上皮細(xì)胞系的建立

黃鑫蕓，張俊梅，邰苗苗，2，孟繁榮，任有蛇，張春香，2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.河南省農(nóng)墾發(fā)展服務(wù)中心，河南 鄭州 450003）

β防御素是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)一類重要的內(nèi)源性且具有先天免疫作用的抗菌肽。在雄性動(dòng)物生殖器官中表達(dá)的β防御素種類最多，且具有明顯的物種差異[1-6]。人[1]、鼠[2]、豬[4]、綿羊[5]和山羊[6]生殖器官中分別表達(dá)有38、35、29、34、32種防御素，它們不僅發(fā)揮抗菌作用[7]，同時(shí)也在精子成熟過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。β防御素124（BD124）是羊附睪頭中表達(dá)量最高的β防御素[5-6]，附睪頭BD124是山羊23種組織中表達(dá)量最高的β防御素[10]，對(duì)于揭示其生物學(xué)功能具有重要意義。2015年，張春香等[11]用生物信息學(xué)方法預(yù)測出山羊附睪頭BD124有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能具有生物調(diào)節(jié)作用?；蜻^表達(dá)和敲減等方法是研究蛋白質(zhì)功能的主要方法[12-13]。2014年，KIM等[14]將商業(yè)化BD124過表達(dá)質(zhì)粒載體BD124-DDK-Myc轉(zhuǎn)染到前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BD124過表達(dá)增加了細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6（IL-6）和12（IL-12）的表達(dá)。2020年，孟繁榮等[15]用BD124敲減的RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染山羊附睪頭細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BD124通過調(diào)控p38MAPK/AP1通路影響先天性免疫。目前，尚未見有山羊BD124過表達(dá)載體構(gòu)建的報(bào)道。

本研究首先對(duì)附睪頭上皮細(xì)胞進(jìn)行BD124定位，并進(jìn)一步進(jìn)行BD124過表達(dá)載體及過表達(dá)附睪頭上皮細(xì)胞系構(gòu)建，旨在深入研究其生物學(xué)功能，為BD124抗菌肽產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試太行山羊附睪頭上皮細(xì)胞系和pEX1-EGFP-BD124質(zhì)粒由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物繁殖實(shí)驗(yàn)室提供，鼠源BD124單克隆抗體和兔源多克隆抗體由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院羊繁殖生理研究課題組制備。DAPI、FITC-羊抗鼠IgG、無菌PBS購自博士德生物工程有限公司，NotⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶購自Takara生物工程公司，DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶購自賽默飛世爾科技公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，重組克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

主要儀器設(shè)備有TCS SP8激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡儀器有限公司），Odyssey?CLX雙色近紅外成像系統(tǒng)（美國LI-COR Biosciences）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山羊BD124蛋白定位方法 用1%多聚賴氨酸包被直徑為12 mm的細(xì)胞爬片，將包被后的細(xì)胞爬片放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，隨后用太行山羊附睪頭上皮細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞生長1 d后，取出細(xì)胞爬片，用PBS沖洗3次，每次5 min。用4%多聚甲醛固定30～40 min后用PBS洗滌，用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液煮沸5 min，室溫冷卻后用PBS洗滌，37℃恒溫條件下用山羊血清封閉1 h后甩掉封閉液，在樣品孔滴加BD124單克隆抗體（1∶100）稀釋液后4℃孵育過夜。設(shè)置PBS孵育組為對(duì)照，第2天取出孵育組細(xì)胞爬片后在37℃復(fù)溫1 h，再用PBS洗滌，滴加FITC-IgG二抗（1∶100）后用錫箔紙包裹，37℃恒溫箱孵育30 min，PBS洗滌后滴加40 μL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），錫箔紙包裹后37℃孵育10 min，PBS洗滌，最后用抗熒光衰減劑封片，用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.2BD124過表達(dá)載體構(gòu)建 以pEX1-EGFPBD124質(zhì)粒為模板，用添加LV5的EF-aF//綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）和嘌呤霉素（Puromycin，Puro）載體NotⅠ和BamHⅠ酶雙側(cè)同源序列的引物序列（表1）擴(kuò)增山羊BD124的全長序列。擴(kuò)增體系組成（50 μL）：10×Buffer（＋Mg2＋）5.0 μL、上下游引物和dNTP各1.0 μL、模板1.0 μL、DNA聚合酶0.3 μL、ddH2O 40.7 μL；PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后切膠回收備用。用內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ酶將穿梭質(zhì)粒LV5載體線性化。酶切體系組成（25 μL）：BamHⅠ和NotⅠ酶各0.5 μL、LV5質(zhì)粒模板7.0 μL、10×Buffer 3.0 μL和ddH2O 14.0 μL，37℃孵育2 h后回收線性化LV5載體。按重組克隆試劑盒說明書將BD124克隆到LV5載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)16 h。挑取陽性克隆后搖菌并保存菌液。抽取20.0 μL菌液送北京華大基因公司測序，確認(rèn)測序結(jié)果與山羊BD124質(zhì)粒序列一致后，用陽性克隆菌液搖菌后進(jìn)行質(zhì)粒提取備用，即為LV5-BD124重組穿梭質(zhì)粒，將BamHⅠ和NotⅠ雙酶切質(zhì)粒采用瓊脂糖電泳鑒定。

1.2.3 LV5-BD124過表達(dá)載體慢病毒包裝 在6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T細(xì)胞，在融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化離心收集后細(xì)胞，加入2 mL含DMEM的完全培養(yǎng)基，輕輕吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液。將該懸液接種到10 cm的培養(yǎng)皿中，加入12 mL完全培養(yǎng)基后在37℃、5%濃度的CO2環(huán)境下培養(yǎng)過夜。將4.5 μg重組穿梭質(zhì)粒LV5-BD124、4.5 μg包裝質(zhì)粒（pRev+pMDL+pVSV-G，比例為2∶5∶3）和20.0 μL Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑與1.2 mL無血清DMEM混勻，室溫放置30 min，滴加到239T細(xì)胞后加入5 mL無血清DMEM，37℃、5%CO2下孵育6 h，吸出棄上清后用12 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集上清，過濾后4℃下20 000 r/min超速離心2 h，分裝后在-80℃保存?zhèn)溆?。用有限稀釋法進(jìn)行病毒滴度檢測。

1.2.4 LV5-BD124慢病毒載體侵染條件優(yōu)化 將對(duì)數(shù)生長期山羊附睪頭上皮細(xì)胞鋪到96孔板中用于篩選最佳病毒侵染濃度和最佳侵染體系，侵染體系分為添加0、5.0 μg/mL Polybrene（聚凝胺）2組，慢病毒添加設(shè)定MOI值（侵染病毒數(shù)目與細(xì)胞數(shù)量的比值）為1、10、100等3個(gè)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)40%時(shí)，用包裝好LV5-BD124慢病毒進(jìn)行侵染，每組3個(gè)重復(fù)，24 h后換成完全培養(yǎng)基，72 h后拍照觀察熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.5 重組LV5-BD124病毒載體過表達(dá)效果分析 選擇最佳慢病毒載體濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。采用24孔板，設(shè)置LV5-BD124過表達(dá)組（LV5-BD124）、LV5空載體組（LV5-NC）和對(duì)照組（Blank），侵染后96 h收集細(xì)胞用于提取mRNA并進(jìn)行BD124熒光定量分析（引物如表1所示）。120 h后收集細(xì)胞用于提取蛋白，Western blot檢測BD124蛋白過表達(dá)情況，一抗孵育濃度1∶2 000，熒光二抗孵育濃度1∶20 000，獲取圖像后用Image Studio軟件分析灰度值。

表1 PCR所用引物Tab.1 Primes for PCR

1.2.6 重組LV5-BD124過表達(dá)上皮細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)系建立 重組LV5-BD124過表達(dá)載體侵染附睪上皮細(xì)胞72 h后吸出培養(yǎng)基，用PBS沖洗。參考邰苗苗等[16]的方法更換為含有嘌呤霉素2.0 μg/mL不含青鏈霉素雙抗的完全培養(yǎng)基進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選，胰酶消化72 h后，收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行第2次篩選，直至細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0中的ANOVA程序分析熒光定量和蛋白灰度值，用Duncan法多重比較后采用GraphPad Prism 5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 附睪頭上皮細(xì)胞BD124蛋白定位

采用共聚焦激光顯微技術(shù)用單克隆抗體對(duì)附睪頭上皮細(xì)胞BD124蛋白進(jìn)行免疫熒光定位，結(jié)果如圖1所示，山羊BD124蛋白在細(xì)胞核周圍高度聚集，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有分布；而對(duì)照組無熒光信號(hào)，結(jié)果可靠。

圖1 山羊附睪頭上皮細(xì)胞BD124的免疫定位Fig.1 Immunolocalization of BD124 in the epididymal caput epithelial cells of goats

2.2 BD124過表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

2.2.1 LV5-BD124過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建LV5-BD124過表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖2所示，在200 bp和8.0 kb附近可見2條清晰條帶，與山羊BD124 CDS區(qū)片段長度207 bp相符，與LV5載體9.3 kb的片段長度基本相符。

圖2 LV5-BD124載體雙酶切膠Fig.2 Double enzyme digestion of LV5-BD124 vector

菌液測序結(jié)果如圖3所示，經(jīng)比對(duì)，測序結(jié)果與NCBI中山羊BD124的CDS區(qū)序列（KC763800.1）完全一致。說明BD124已成功克隆到LV5穿梭質(zhì)粒載體中。用LV5-BD124穿梭質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收集病毒，采用有限稀釋法測定LV5-BD124慢病毒載體的病毒滴度為3.0×108TU/mL。

圖3 LV5-BD124載體雙酶切測序結(jié)果Fig.3 Sequencing map of double enzyme digestion of LV5-BD124 vector

2.2.2 LV5-BD124慢病毒載體侵染條件優(yōu)化 山羊附睪頭上皮細(xì)胞在LV5-BD124慢病毒載體侵染72 h后熒光表達(dá)情況如圖4所示，添加5 μg/mL Polybrene的侵染體系可極大提高侵染效率，且當(dāng)MOI值為100時(shí)，本體系中具有熒光的陽性細(xì)胞數(shù)超過80%。后續(xù)試驗(yàn)均采用本侵染體系和MOI值。

圖4 LV5-BD124慢病毒載體侵染72 h熒光情況Fig.4 The fluorescence intensity after 72 h of LV5-BD124 lentivirus vector infection

2.2.3 重組LV5-BD124過表達(dá)效果分析 熒光定量PCR結(jié)果和Western blot蛋白定量結(jié)果如圖5所示。圖5-A結(jié)果顯示，LV5-BD124轉(zhuǎn) 染96 h后山羊附睪頭上皮細(xì)胞BD124 mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；圖5-B中Western blot結(jié) 果 顯 示，LV5-BD124慢 病 毒 載體侵 染120 h后，BD124蛋 白條帶比空白對(duì)照和空載體對(duì)照組的蛋白條帶更深更粗；圖5-C灰度值分析顯示，LV5-BD124慢病毒侵染后，BD124蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），說明經(jīng)重組LV5-BD124慢病毒載體侵染后BD124蛋白在山羊附睪頭上皮細(xì)胞中過表達(dá)。

圖5 LV5-BD124侵染后BD124 mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of BD124 mRNA and protein after LV5-BD124 infection

2.3 BD124過表達(dá)附睪頭上皮細(xì)穩(wěn)轉(zhuǎn)系的建立

BD124過表達(dá)附睪頭上皮細(xì)胞系的建立過程如圖6所示，重組LV5-BD124載體侵染附睪上皮細(xì)胞24 h后，從綠色熒光表達(dá)情況可以看出，BD124首先圍繞細(xì)胞核形成熒光圈，但細(xì)胞核區(qū)內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)，支持BD124蛋白定位結(jié)果；侵染72 h后細(xì)胞融合度達(dá)80%，熒光強(qiáng)度增加，經(jīng)2 μg/mL嘌呤霉素2次篩選后，陽性細(xì)胞密度高而且熒光強(qiáng)度增加。第2次傳代培養(yǎng)后120 h，陽性細(xì)胞形態(tài)和熒光強(qiáng)度正常，可以正常傳代。

圖6 BD124過表達(dá)附睪頭上皮細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)系建立Fig.6 Construction of BD124 overexpressed stable cell strain of epididymal caput epithelial cells

3 結(jié)論與討論

BD124在山羊附睪頭細(xì)胞中高表達(dá)，附睪頭是精子成熟的主要場所，高表達(dá)BD124蛋白在附睪頭發(fā)揮的生物學(xué)功能應(yīng)進(jìn)行深入研究。據(jù)研究報(bào)道，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位與生物學(xué)功能的預(yù)測有密切關(guān)系[17-18]。張春香等[11]用生物信息學(xué)方法進(jìn)行BD124亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能在線粒體中表達(dá)，但用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位是根據(jù)提供的BD124氨基酸序列使用特定算法進(jìn)行預(yù)測，只能作為一個(gè)參考。

本研究中，采用BD124單克隆抗體細(xì)胞免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)，BD124在附睪頭上皮細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可以表達(dá)，另外用LV5-BD124慢病毒載體侵染細(xì)胞后，最初在細(xì)胞核膜周圍形成一個(gè)BD124蛋白環(huán)，隨著時(shí)間延長蔓延至整個(gè)細(xì)胞。上述結(jié)果與KIM等[14]用BD124過表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞后BD124蛋白分布結(jié)果一致，說明BD124除具有防御素本身的抗菌作用外，還具有其他生物學(xué)功能。孟繁榮等[15]研究結(jié)果也證實(shí)，BD124敲減后可引起附睪頭細(xì)胞細(xì)胞因子基因和蛋白表達(dá)的變化。但BD124與何種配體相互作用激活下游信號(hào)通路，仍需進(jìn)一步深入研究。

BD124蛋白定位雖可預(yù)測該蛋白的功能，但運(yùn)用基因過表達(dá)或敲除技術(shù)構(gòu)建基因過表達(dá)或敲除體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型則是研究其生物學(xué)功能的主要方法[19-21]。常用的構(gòu)建過表達(dá)載體的方法有2種：質(zhì)粒載體法和病毒載體法。其中，質(zhì)粒載體法在實(shí)驗(yàn)中使用較多[22-24]，較為簡單，但缺點(diǎn)是在有些細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率比較低，且附睪頭細(xì)胞是質(zhì)粒載體難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。前期試驗(yàn)中已構(gòu)建了過表達(dá)pEX1-EGFP-BD124質(zhì)粒載體，嘗試了不同的脂質(zhì)體、細(xì)胞比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間和多種轉(zhuǎn)染試劑，但轉(zhuǎn)染效率始終非常低。參考KIM等[14]將商業(yè)化的過表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞系中的成功案例，本試驗(yàn)將pEX1-EGFP-BD124轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，熒光表達(dá)效果較好，說明質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。

慢病毒是一類能高效整合并長期穩(wěn)定表達(dá)長片段外源性目的基因，生物安全性高且可操控性強(qiáng)的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體，可高效侵染神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型細(xì)胞，成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體，同時(shí)也是現(xiàn)代體內(nèi)基因治療首選載體[25-28]。用Polyfect-V脂質(zhì)體介導(dǎo)慢病毒空載體侵染山羊附睪上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率較高，說明慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)入附睪頭上皮細(xì)胞。因此，本試驗(yàn)選擇了攜帶2個(gè)標(biāo)記基因GFP和Puro的LV5載體。GFP表達(dá)一方面可用于對(duì)包裝病毒進(jìn)行滴度測定，也可用于檢測陽性細(xì)胞數(shù)量和檢測轉(zhuǎn)染效率。Puro基因在陽性細(xì)胞中表達(dá)，未侵染成功的細(xì)胞則被嘌呤霉素殺死[16]，大部分試驗(yàn)采用單次篩選法[27-28]。本試驗(yàn)采用嘌呤霉素進(jìn)行2次篩選提高以BD124過表達(dá)的陽性細(xì)胞純度，傳代等過程處理后過表達(dá)附睪頭上皮陽性細(xì)胞的過表達(dá)能力仍然很好保持，說明成功構(gòu)建了BD124過表達(dá)附睪頭上皮細(xì)胞系。BD124過表達(dá)將引發(fā)的細(xì)胞信號(hào)通路變化有待深入探究，同時(shí)也需進(jìn)一步分析比較BD124敲減后與過表達(dá)后通路的變化，以期為將來科學(xué)開發(fā)利用BD124奠定理論基礎(chǔ)。