干擾RBL2基因對綿羊卵泡顆粒細胞增殖的影響

陳春路，成 穎，馬曉燕，黨文慶，賈凱琪，郭翔宇，呂麗華

（山西農業(yè)大學 動物科學學院，山西 太谷 030801）

卵泡的生長發(fā)育對于雌性動物的生育能力有重要影響。羊一生可產生100萬個卵泡，但只有不足5%的卵泡最終會發(fā)育成成熟卵泡，超過95%的卵泡會發(fā)生閉鎖，所以降低卵泡閉鎖率對提高動物生殖能力極為重要[1-5]。顆粒細胞（GCs）是卵泡中重要的體細胞，GCs與卵母細胞通過卵母細胞衍生因子之間建立聯(lián)系，顆粒細胞對卵母細胞和卵泡的發(fā)育具有重要作用，進而影響雌性動物的生殖能力[6]。HE等[7]研究表明，顆粒細胞的增殖、分化、凋亡和激素分泌與卵泡的正常發(fā)育與閉鎖密切相關。對于牛[8]、大鼠[9]、綿羊[10]的研究都證實，卵泡閉鎖的重要原因是顆粒細胞的凋亡。人視網膜母細胞瘤基因（Retinoblastoma，RB）是一個發(fā)現(xiàn)較早的抑癌基因,因其首先在視網膜母細胞瘤中被發(fā)現(xiàn)而命名。相關研究表明[11-13]，RB基因家族與肺癌、前列腺癌和神經膠質母細胞瘤等較多腫瘤的發(fā)生有關。RB蛋白是腫瘤抑制因子,在細胞周期調節(jié)以及細胞分化、衰老和凋亡中起關鍵作用，但是其功能在絕大多數(shù)腫瘤中喪失[14]。視網膜母細胞瘤樣蛋白2（Retinoblastoma-like protein-2，RBL2/p130）是RB家族中一個關鍵腫瘤抑制因子，可影響正常的細胞周期[15-18]，且具有抗凋亡的功能[18]。CHEN等[19]研究表明，下調LINC00899可通過RBL2影響FOXO通路，抑制脊髓室管膜瘤細胞的侵襲和遷移。ZHU等[15]通 過miR-17-5p與RBL2的 靶 標 關 系，提 高miR-17-5p的表達量來降低細胞中RBL2表達，從而影響正常的細胞周期，起到促進細胞增殖的作用。SHI等[20]研究表明，在腎癌細胞中，TGF-β能夠誘導RBL2表達，抑制癌細胞增殖。然而，RBL2對綿羊卵泡顆粒細胞增殖的影響還不清楚。

本研究通過在綿羊卵泡顆粒細胞中轉染siRBL2，闡明干擾RBL2對綿羊卵泡顆粒細胞增殖、凋亡、抗氧化及類固醇類激素合成的影響，旨在為解析促進卵泡發(fā)育機理提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

在山西省太谷區(qū)某屠宰場采集150只大尾寒羊卵巢，將卵巢保存在4℃含1%雙抗的DPBS中，用75%酒精清洗2次，再用滅菌的DPBS將殘余酒精沖掉，用滅菌的眼科剪將卵泡剪下，待后續(xù)試驗使用。

1.2 主要試劑

DMEM/F12（武漢博士德生物工程有限公司），胎牛血清（賽澳美細胞技術有限公司），Lipofiter3.0（漢恒生物科技有限公司），RNAiso Plus和反轉錄試劑盒（大連TaKaRa公司）,雙抗（北京索萊寶科技有限公司），CCK8試劑盒（MedChem Express）,ELISA檢測試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，江蘇），PerfectStart?Green qPCR SuperMix（北京全式金生物有限公司，北京），RBL2干擾RNA（siRBL2）片段以及siRNA NC（上海吉瑪制藥技術有限公司，上海），合成的RNA序列如表1所示。

表1 siRBL2和NC序 列Tab.1 siRBL2 and NC sequences

1.3 試驗方法

1.3.1 綿羊卵泡顆粒細胞的收集與培養(yǎng) 選擇直徑為3～5 mm的卵泡，剪下后用75%的酒精消毒后置于DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中，再用細胞刮及1 mL的無菌注射器將卵泡顆粒細胞刮出，于1 000 r/min離心5 min，棄上清后收集顆粒細胞，用無菌PBS重懸后離心，重復清洗3次。清洗后用DMEM/F12基礎培養(yǎng)基+1%雙抗+10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸混勻，并將懸液分裝于不同規(guī)格的培養(yǎng)皿中。

1.3.2siRBL2的轉染 將卵泡顆粒細胞接種于6孔板中，待細胞融合率達到60%～70%時，用Lipofiter 3.0分別將siRNA NC和siRBL2轉染到綿羊卵泡顆粒細胞中，6 h后，采用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后進行基因水平和類固醇類激素水平的檢測。

1.3.3 引物設計 采用NCBI中Primer-BLAST在線軟件設計RBL2、細胞增殖、凋亡、抗氧化及類固醇類激素合成相關基因的引物，選擇β-actin為內參基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 基因引物序列Tab.2 Gene primer sequences

續(xù)表2基因引物序列Tab.2（Continued）Gene primer sequences

1.3.4 qRT-PCR反應 總RNA提取和反轉錄為cDNA的過程均按照TaKaRa公司的產品說明書操作。反轉錄合成cDNA的過程參照PerfectStart?Green qPCR SuperMix說明書進行。反應體系為10.0 μL：上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、5.0 μL的2×PerfectStart?Green qPCR SuperMix和4.6 μL Nuclease-Free Water。反應程序按照說明書上的3步法進行。

1.3.5 CCK8檢測 采用CCK8試劑盒檢測細胞存活率。將顆粒細胞接種于96孔板中，待細胞融合率達到60%～70%時，用Lipofiter 3.0將siRNA NC和siRBL2轉 染 顆 粒 細 胞，6 h后，將DMEM/F12換成完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)0、12、24、36、48 h后，更換完全培養(yǎng)基，每孔加入10.0 μL的CCK8，37℃孵育4 h，用酶標儀測定450 nm處的OD值，計算轉染后不同時間段的細胞存活率。

1.3.6 ELISA細胞接種于6孔板中，轉染siRBL2后48 h收上清。加入樣品和標準品，37℃孵育30 min，洗板5次后加入酶標試劑，37℃孵育30 min，洗板5次后，37℃顯色10 min，終止反應，15 min之內讀取樣品OD值。采用標準曲線計算出樣品中E2和P4實際濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量（取3次計算的平均值）。所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示。在SPSS 22.0中運用t檢驗和單因素（ANOVA）方差分析差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 siRBL2轉染效率的檢測

合成的siRBL2的轉染效率如圖1所示，與空白對照組相比，siRBL2的表達量顯著下降（P＜0.01），說明干擾效果較好。

圖1 siRBL2轉染效率檢測結果Fig.1 siRBL2 transfection efficiency test results

2.2 siRBL2對細胞周期相關基因的影響

干擾RBL2后檢測細胞周期相關基因的表達量，結果如圖2所示。

圖2 siRBL2對綿羊卵泡顆粒細胞周期相關基因表達的影響Fig.2 Effects of siRBL2 on cycle-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

從 圖2可 以 看 出，F(xiàn)OXO3a和CCND1的 表 達量顯著升高（P＜0.05），P21和P27這2個基因的表達量顯著下降（P＜0.05）。表明干擾RBL2可能對細胞增殖有促進作用。

2.3 干擾RBL2對凋亡相關基因的影響

干擾RBL2檢測細胞凋亡相關基因，結果如圖3所示，與空白對照組相比，BCL-2的表達量差異不顯著，但有升高的趨勢；BAX、BAD和Caspase3基因的表達水平顯著下降（P＜0.05），BCL-2/BAX的值極顯著上升（P＜0.05）。說明干擾RBL2可能抑制細胞凋亡。

圖3 siRBL2對綿羊卵泡顆粒細胞凋亡相關基因表達的影響Fig.3 Effects of siRBL2 on apoptosis-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

2.4 干擾RBL2對抗氧化相關基因的影響

轉染siRBL2后檢測抗氧化相關基因的表達量，結果表明（圖4），CAT和SOD2基因的表達量顯著上升（P＜0.05），提示siRBL2可能有助于提高綿羊卵泡顆粒細胞的抗氧化能力。

圖4 siRBL2對綿羊卵泡顆粒細胞抗氧化相關基因表達的影響Fig.4 Effects of siRBL2 on antioxidation-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

2.5 細胞增殖能力的檢測

用siRNA NC和siRBL2轉染顆粒細胞，分別在0、12、24、36、48 h用酶標儀測定450 nm處的吸光度，計算細胞存活率，結果顯示（圖5），轉染后12 h，siRBL2對細胞活力影響不顯著，轉染24、36、72 h后差異顯著（P＜0.05）。說明siRBL2可能促進綿羊卵泡顆粒細胞的增殖。

圖5 CCK8檢測細胞增殖結果Fig.5 Cell proliferation detected by CCK8

2.6 siRBL2對類固醇類激素合成的影響

細胞轉染48 h后收集上清，檢測E2和P4水平，結果表明（圖6、7），E2水平顯著上升（P＜0.05），P4水平顯著下降（P＜0.05）。同時采用qRT-PCR檢測類固醇激素合成相關基因的表達量，結果顯示（圖8），3β-HSD和STAR基因的表達量顯著下降（P＜0.05），CYP11A1的表達量差異不顯著，但有下降趨勢；CYP19A1的表達量顯著上升（P＜0.05）。說明干擾RBL2能夠提高E2水平，降低P4水平。

圖6 siRBL2對綿羊卵泡顆粒細胞中雌激素（E2）水平的影響Fig.6 Effects of siRBL2 on the level of estrogen（E2）in sheep follicular granulosa cells

圖8 siRBL2對類固醇類激素合成相關基因的影響Fig.8 Effects of siRBL2 on genes related to steroid hormone synthesis

圖7 siRBL2對綿羊卵泡顆粒細胞中孕激素（P4）水平的影響Fig.7 Effects of siRBL2 on the level of progesterone（P4）in sheep follicular granulosa cells

3 結論與討論

卵泡的發(fā)育狀態(tài)對雌性動物的生殖能力具有重要影響且受多種因素調控。雌性動物的大部分卵泡會發(fā)生閉鎖，只有少數(shù)卵泡可發(fā)育至正常排卵，而顆粒細胞是卵泡中具有重要功能的體細胞。顆粒細胞通過間隙連接為卵母細胞提供營養(yǎng)并進行信號轉導，特別是雌激素和黃體酮等類固醇激素，對卵泡的生長發(fā)育起到重要作用[21]，所以顆粒細胞的凋亡對卵泡閉鎖具有重要影響。卵巢中類固醇類激素主要在顆粒細胞和卵泡膜細胞中產生[22]。在卵巢中，卵泡外部的膜細胞能夠分泌雄激素，雄激素被顆粒細胞芳香化為雌二醇，在此轉化過程中作為編碼雌激素合成酶的CYP19A1基因起到至關重要的作用[23]。研究表明，雌激素能夠促進顆粒細胞的增殖，抑制顆粒細胞的凋亡[24]。在山羊中，雌激素的產生能夠提高山羊卵泡顆粒細胞的活性[25]。干擾RBL2后雌激素水平明顯上升，同時CYP19A1基因的表達量上升，表明干擾RBL2能夠促進雌激素的合成，進而對綿羊卵泡顆粒細胞增殖產生影響。卵泡發(fā)育后期，促黃體素會導致雌激素水平下降、顆粒黃體細胞分泌的孕激素水平升高，STAR、CYP11A1、3β-HSD基因的表達水平較高[26]。高濃度的孕激素能夠促進子宮內膜癌細胞[27]和卵巢癌細胞[28]的凋亡，抑制細胞增殖。孕激素可能通過FOXO通路對細胞增殖和凋亡產生影響。與對照組相比，干擾RBL2后孕激素的水平顯著下降，3β-HSD和STAR基因表達量顯著下降，CYP11A1基因的表達量差異不顯著，但有下降的趨勢。因此，低濃度的孕激素可能對綿羊卵泡顆粒細胞的增殖有促進作用。

RBL2/p130蛋白屬于RB蛋白家族成員，該家族成員還包括RB1/p105和RBL1/p107蛋白，它們都能夠影響細胞周期，并且可影響細胞的生長發(fā)育[18]。細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）是RBL2/p130磷酸化的主要激酶，同時RBL2/p130能夠與E2F4相結合形成異二聚體，對下游基因的轉錄產生影響[29-30]。FOXO3a是FOXO家族中一個重要的轉錄因子，不同動物卵泡發(fā)育過程中均有FOXO家族基因的表達。FOXO信號通路在細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。降低FOXO3a的表達量能夠促進鵝卵泡顆粒細胞增殖[31]，F(xiàn)OXO3a也可參與 豬[32]、大 鼠[33]、耗 牛[34]、雞[35]卵 泡 顆 粒 細 胞 的 生 長發(fā)育。CHEN等[19]研究表明，下調RBL2能夠激活FOXO通路，促使FOXO表達量明顯上升，而下游的P21和P27基因的表達量顯著降低，可影響細胞周期并促進細胞增殖。CCND1是細胞增殖的標志性 基 因[36]。LU等[37]和WANG等[38]研 究 表 明，miR-17-92簇可能通過靶向RBL2影響小鼠胚胎肺上皮細胞的增生和脂肪細胞的分化。干擾RBL2后，F(xiàn)OXO3a和CCND1基因的表達量顯著上升，細胞周期相關基因P21和P27基因的表達量顯著下降。因此，干擾RBL2可能對細胞增殖有促進作用。

BCL-2家 族 中有抗凋亡因子BCL-2、BAX和BAD。相關研究表明，BCL-2/BAX的值對細胞凋 亡 非 常 重 要[39-41]。GUO等[42]和LI等[43]研 究 表 明，BCL-2/BAX的值升高時，對細胞凋亡有抑制作用；反之，對細胞凋亡有促進作用。干擾RBL2后，BCL-2基因的相對表達量升高，BAX和BAD基因的相對表達量降低，而BCL-2/BAX的值顯著上升。同時，Caspase基因家族也與細胞凋亡密切相關。在干擾RBL2后，Caspase3的表達量顯著下降。上述研究表明，干擾RBL2可能對綿羊卵泡顆粒細胞凋亡有抑制作用。

活性氧（ROS）對維持細胞正常內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。氧化應激時，細胞中會產生大量ROS，對細胞造成嚴重影響。而過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶2（SOD2）作為抗氧化酶能夠參與氧化應激反應，修復細胞中氧化應激帶來的損傷。大量研究表明，在大鼠[44]、小鼠[45]、綿羊[46]的睪丸間質細胞中，通過不同途徑調控氧化應激均有可能影響細胞周期，對細胞的增殖和凋亡產生影響。本試驗干擾RBL2后檢測抗氧化相關基因CAT和SOD2，結果顯示，CAT和SOD2的表達量顯著上升。MC-LR能夠誘導顆粒細胞氧化應激，對卵泡的正常發(fā)育產生影響，進而影響雌性動物的生殖能力[47]。因此，干擾RBL2可能提高抗氧化酶相關基因的表達來促進綿羊卵泡顆粒細胞的增殖。

綜上所述，干擾RBL2可能在細胞周期、細胞凋亡、抗氧化及類固醇類激素合成中對綿羊卵泡顆粒細胞產生影響，進而促進綿羊卵泡顆粒細胞的增殖。