基于網(wǎng)絡藥理學探討身痛逐瘀湯治療腰椎間盤突出癥的作用機制

龍水文 賈育松 李晉玉 孫悅禮 鄭晨穎 白春曉 張 帆 劉楚吟 邸學士 袁巧妹 冉 宇 陳 江 王擁軍

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院骨傷科，北京,100700)

腰椎間盤突出癥(Lumbar Disc Herniation，LDH)是臨床常見的腰椎退行性疾病，其發(fā)病與椎間盤纖維環(huán)破裂、髓核突出刺激壓迫神經(jīng)根密切相關，臨床多表現(xiàn)為腰痛、下肢放射痛及感覺異常[1]。腰椎間盤突出癥屬于中醫(yī)學“腰腿病”“痹癥”范疇，中醫(yī)學認為其發(fā)病與腰部勞損扭挫、風寒濕邪侵襲等因素相關，其病機在于肝腎不足，或有勞損外傷，或感受外邪，以致經(jīng)脈痹阻、氣血運行不暢，不通則痛，痛有定處。

身痛逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，具有活血祛瘀，祛風除濕，通痹止痛的功效，身痛逐瘀湯治療LDH具有良好療效，能有效改善患者疼痛麻木癥狀，提高生命質(zhì)量[2]；但對于身痛逐瘀湯治療LDH的作用機制研究尚不明確。

網(wǎng)絡藥理學是一門運用網(wǎng)絡方法分析藥物和疾病靶點之間協(xié)同作用關系的藥理學分支學科，為研究中藥復方復雜藥效協(xié)同作用機制提供了新策略[3-4]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，挖掘身痛逐瘀湯治療LDH的潛在有效成分、作用靶點及相關分子作用機制，為后期的深入研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 身痛逐瘀湯中藥化學活性成分篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[5]，查找身痛逐瘀湯中川芎、當歸、紅花、沒藥、牛膝、羌活、秦艽、桃仁、香附9味藥的化學成分，因地龍未收錄于TCMSP，通過化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)對其進行檢索補充；方中甘草為使藥，即調(diào)和藥，主要作用為緩和諸藥藥性，其用量小，故對其化學成分不作篩選。依據(jù)中藥的藥代動力學ADME即吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)及排泄(Excretion)過程，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，與類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為篩選條件，選取出中藥活性成分。

1.2 身痛逐瘀湯中藥活性成分靶點預測 通過以上數(shù)據(jù)庫檢索獲取各味中藥活性成分的CAS編號，利用有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(pubchem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)對所檢索出的CAS編號進行搜索得到活性成分的2D分子結構文件，將2D分子結構文件分別導入SwissTargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)，實現(xiàn)活性成分靶點預測[6]，并篩選“Probability值>0”的結果作為最終預測靶點。

1.3 LDH疾病靶點獲取及身痛逐瘀湯治療LDH潛在作用靶點預測 在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、DisGeNET3個疾病靶點數(shù)據(jù)庫輸入疾病名稱“l(fā)umbar disc herniation”進行檢索[7]，將篩選結果匯總，去除重復值保留唯一值，即獲得疾病LDH靶點集。將疾病LDH靶點集與上述身痛逐瘀湯的中藥作用靶點取交集，即得到身痛逐瘀湯治療LDH的潛在作用靶點。

通過SwissTargetPrediction平臺，對篩選出的178個活性成分進行靶點預測，剔除其中無對應靶標的活性成分，對剩余121個活性成分預測并篩選Probability值>0的靶點預測結果。

1.4 中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡構建 將中藥、活性成分、交集靶點信息整理至Excel表格，并將其導入Cytoscape軟件，構建中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡，對中藥、活性成分、交集靶點關系進行可視化分析，探究身痛逐瘀湯治療LDH活性成分的重要性及相關分子作用機制。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構建 將身痛逐瘀湯治療LDH的潛在作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，Organism設置為“Homo sapiens”，將置信度得分設置為“high confidence≥0.7”，隱藏孤立于網(wǎng)絡之外的節(jié)點，進而獲取身痛逐瘀湯治療LDH潛在作用靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，下載保存其TSV格式文件，導入Cytoscape軟件，通過Cytoscape軟件內(nèi)置的網(wǎng)絡分析插件，對其網(wǎng)絡樣式進行設置，并繪制PPI網(wǎng)絡圖，節(jié)點(Node)的大小和漸變顏色反映Degree值的大小。

1.6 基因本體富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析 通過上述PPI網(wǎng)絡構建分析獲得身痛逐瘀湯治療LDH的關鍵靶點，將其導入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，物種及背景設置為“Homo sapiens”，分別進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，篩選排名靠前的基因功能及通路繪制出直觀的柱狀圖與氣泡圖。

1.7 細胞實驗

1.7.1 實驗細胞 人髓核細胞(Sciencell公司，美國，貨號：4800)。

1.7.2 藥物 所需藥材由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中藥房提供，包括：秦艽3 g、川芎6 g、桃仁9 g、紅花9 g、甘草6 g、羌活3 g、沒藥6 g、當歸9 g、香附3 g、牛膝9 g、地龍6 g。根據(jù)體表面積法確定給藥劑量，選用大耳兔制備中藥含藥血清，課題前期研究利用噻唑藍溴化四唑(MTT)比色法篩選出身痛逐瘀湯含藥血清最佳的給藥濃度為15%，干預時間為24 h。

1.7.3 主要試劑與儀器 高效放射免疫沉淀法(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)組織/細胞裂解液(Thermo公司，美國，貨號：89900)；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(Beyotime公司，貨號：C1063)；胎牛血清(Sciencell公司，美國，貨號：0010)；胰酶/乙二胺四乙酸(Ethylene Diaminetetraacetic Acid，EDTA)(Sciencell公司，美國，貨號：0103)；兔核因子κB p65多克隆抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab16502)；兔基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)-13多克隆抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab39012)；兔胱天蛋白酶-3多克隆抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab13847)；兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenas，GAPDH)單克隆抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab181602)。流式細胞儀(Beckmam，美國，型號：Cytomics FC500)；發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE，英國，型號：GeneGnome XRQ)；蛋白電泳儀(Bio-rad，美國，型號：PowerPac)；全自動酶標儀(BioTek，美國，型號：Synergy H1)；醫(yī)用恒溫靜水壓壓力罐(柳根哲教授設計，專利號：ZL201520108857.5)。

1.7.4 分組與造模 本研究分為2組，即單純壓力組和經(jīng)身痛逐瘀湯血清干預的中藥組。實驗采用10 mL注射器為實驗容器，將3代髓核細胞鋪片，與培養(yǎng)基共同裝入其中，密封注射器的頭部保持密閉性；將注射器放置于壓力罐中，分別作用2 h、4 h、6 h。將人髓核細胞復蘇后，進行傳代培養(yǎng)，根據(jù)前期課題組研究結果選取第3代髓核細胞進行實驗。將髓核細胞放入醫(yī)用恒溫靜水壓壓力罐，設置1 MPa壓力進行造模。

1.7.5 細胞凋亡檢測 使用Annexin V-FITC/Propidium Iodide凋亡試劑盒進行雙染檢測：1)洗滌、胰酶消化貼壁細胞，收集靜水壓作用后的髓核細胞，以1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心5 min，吸去上清。2)加入磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate Buffer Saline，PBS)0.5 mL重懸細胞；計數(shù)選取10萬重懸細胞，離心后棄上清。3)195 μL Annexin V-FITC結合液浸潤重新重懸細胞，調(diào)節(jié)濃度。4)加入5 μL Annexin V-FITC混勻，20～25 ℃室溫下避光孵育10 min。5)可重復操作重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶染色(Propidium Iodide，PI)混勻，避光孵育后上機檢測。

1.7.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測 樣本離心后棄上清，潤洗2次后加入RIPA裂解液，置于冰上裂解，之后以16 000×g,離心10 min；吸取上清進行含量測定；采用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法測定樣本濃度后，進行電泳、轉(zhuǎn)膜及顯影，將樣本加入樣孔中，按照濃縮膠80 V/分離膠120 V恒壓電泳，將凝膠半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉，封閉1 h后清洗3次；加入稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜。次日洗膜3次，加入二抗孵育，2 h后加入洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween，TBST)清洗，應用顯影儀對膜進行顯影成像。

2 結果

2.1 身痛逐瘀湯中藥化學成分篩選結果 共得到178個符合條件的活性成分，剔除其中無對應靶標的活性成分，最終得到121個活性成分，其中川芎4個、當歸2個、地龍17個、紅花19個、沒藥20個、牛膝14個、羌活10個、秦艽2個、桃仁18個、香附15個。

2.2 身痛逐瘀湯作用靶點預測及其治療LDH潛在作用靶點的預測 共獲得871個身痛逐瘀湯活性成分作用靶點，獲得438個LDH疾病相關靶點。身痛逐瘀湯治療LDH的交集靶點75個。見圖1。

圖1 身痛逐瘀湯與LDH疾病靶點匹配韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡構建與分析 中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡由175個節(jié)點、921條邊組成，以Degree值大小進行排序，其中β-谷固醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)、木犀草素(Luteolin)、黃芩素(Baicalein)排名靠前，說明其在身痛逐瘀湯治療LDH過程中發(fā)揮重要作用。見圖2。

圖2 中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡

2.4 身痛逐瘀湯治療LDH關鍵作用靶點的PPI網(wǎng)絡構建 獲取滿足篩選條件的關鍵作用靶點69個。PPI網(wǎng)絡中有69個節(jié)點，447條邊，節(jié)點平均Degree值為13.0，其中STAT3、IL6、VEGFA、MAPK1、TP53、MMP9、AKT1、JUN、TNF、HRAS、MMP13等排列靠前。見圖3。

圖3 身痛逐瘀湯治療LDH關鍵作用靶點的PPI網(wǎng)絡

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析結果 GO分析中得到生物過程(Biological Process，BP)相關條目366條，其中包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter)、細胞增殖的正調(diào)控(Positive Regulation of Cell Proliferation)、信號轉(zhuǎn)導(Signal Transduction)、凋亡過程的負調(diào)控(Negative Regulation of Apoptotic Process)等；分子功能(Molecular Function，MF)相關條目66條，其中涉及蛋白質(zhì)結合(Protein Binding)、ATP結合(ATP Binding)、同種蛋白質(zhì)結合(Identical Protein Binding)、鋅離子結合(Zinc Ion Binding)、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(Serine-type Endopeptidase Activity)等分子功能；細胞組分(Cell Component，CC)相關條目43條，包括質(zhì)膜、細胞質(zhì)、細胞核、細胞質(zhì)溶膠、胞外區(qū)等。見圖4。

圖4 GO富集分析BP、CC、MF結果

KEGG信號通路富集結果顯示，身痛逐瘀湯治療LDH涉及的信號通路150余條，篩選身痛逐瘀湯治療LDH關鍵作用靶點的主要相關信號通路，包括：癌癥通路、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B，PI3K/AKT)信號通路、核因子κB信號通路、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)信號通路、叉頭框O(Forkhead Box O，F(xiàn)oxO)信號通路等。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析結果

2.6 細胞凋亡檢測 隨著靜水壓作用時間的增加，2組細胞的凋亡率增高；與單純壓力組比較，中藥組凋亡率明顯有所下降(P<0.05)。見圖6。

圖6 髓核細胞凋亡情況

2.7 核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表達情況 在1 MPa壓力作用下，單純壓力組核因子κB p65蛋白水平在4 h時明顯增加，之后蛋白表達量明顯下降，而MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表達水平隨時間增加而上升。在同一作用時間下，中藥組核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3的蛋白表達水平明顯低于單純壓力組(P<0.05)。經(jīng)身痛逐瘀湯含藥血清干預后核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表達受到抑制。見圖7。

圖7 核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表達情況

3 討論

身痛逐瘀湯源自《醫(yī)林改錯》，是古代經(jīng)典名方之一，易騰達等[8]學者在原方基礎上剔除五靈脂(因該藥自1990年后未收入《中華人民共和國藥典》)，建議身痛逐瘀湯臨床組方如下：秦艽、川芎、桃仁、紅花、甘草、羌活、沒藥、當歸、香附、牛膝、地龍；身痛逐瘀湯全方共奏活血祛瘀、祛風除濕、通痹止痛之功。該方在骨科領域運用廣泛，對治療LDH具有良好療效。LDH的發(fā)病與椎間盤退變密切相關，有研究表明力學載荷、細胞凋亡和炎癥介質(zhì)等是促使椎間盤退變的主要危險因素[9]?，F(xiàn)代相關研究發(fā)現(xiàn)，該方藥理作用廣泛，不僅具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，還有營養(yǎng)保護神經(jīng)，降低骨骼肌微損傷，延緩椎間盤退變等作用，身痛逐瘀湯可能通過多種作用途徑治療LDH[10-11]。

本網(wǎng)絡藥理學研究中，根據(jù)中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡分析結果顯示，β-谷固醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)、木犀草素(Luteolin)、黃芩素(Baicalein)度值較高，說明其在治療LDH過程中可能發(fā)揮重要作用。在對身痛逐瘀湯藥物活性成分的篩選中，可以發(fā)現(xiàn)上述活性成分廣泛分布于身痛逐瘀湯的多味藥物中，其中β-谷固醇存在于當歸、紅花、沒藥、羌活、秦艽、香附、牛膝、桃仁中，研究顯示，β-谷固醇具有的抗炎作用明確，其可通過調(diào)節(jié)吞噬細胞功能來抑制促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生進而改善類風濕炎癥[12]；通過抑制核因子κB的活化來減輕右旋糖酐硫酸鈉誘導的結腸炎[13]；通過抑制p38、胞外信號調(diào)節(jié)激酶和核因子κB通路，降低白細胞介素6(Interleukin，IL-6)、TNF-α等相關炎癥介質(zhì)來影響小膠質(zhì)細胞活性、抑制神經(jīng)炎癥從而延緩神經(jīng)退變[14]。相關研究表明炎癥反應已被認為是LDH椎間盤退變的主要因素，巨噬細胞是椎間盤突出吸收過程中的重要免疫參與者，β-谷固醇可通過調(diào)節(jié)細胞功能及抑制相關炎癥信號通路對關節(jié)炎、結腸炎及神經(jīng)炎癥等發(fā)揮良好的抗炎作用[15-16]，其在治療LDH椎間盤退變過程中也可能發(fā)揮重要作用，目前尚未報道β-谷固醇是否對椎間盤退變相關炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用，這為日后的研究提供新方向。

槲皮素存在于紅花、沒藥、牛膝、香附中，其可抑制IL-1β誘導的核因子κB途徑級聯(lián)反應的激活，通過核因子E2相關因子2/核因子κB軸改善椎間盤退變[17]。山柰酚、黃芩素存在于紅花、牛膝中，其中山柰酚不僅能調(diào)控脂質(zhì)代謝相關基因，減緩細胞凋亡、增強細胞活力，還能減少促炎癥介質(zhì)IL-6、增加抗炎細胞因子IL-10的水平發(fā)揮其抗炎作用從而延緩LDH椎間盤退變[18]。黃芩素可抑制核因子κB和MAPK信號通路的激活，其主要通過以下方面延緩椎間盤退變：一是通過抑制相關炎癥介質(zhì)的表達來參與炎癥反應[19]，二是通過參與力學載荷，抑制壓力誘導的髓核細胞的凋亡，延緩椎間盤退變的進程[20]。山柰酚和黃芩素作為LDH椎間盤退變的潛在治療劑具有巨大研究價值。

PPI網(wǎng)絡中，分析69個關鍵靶點蛋白的相互作用關系，其中信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3是STAT成員之一，在腰椎間盤髓核突出引起的持續(xù)疼痛大鼠模型的實驗研究中，發(fā)現(xiàn)STAT3通過上調(diào)脊髓趨化因子C-X-C基序配體12的表達介導腰椎間盤髓核突出引起的機械痛敏，抑制STAT3的活化顯著緩解腰椎間盤突出誘導的持續(xù)疼痛[21]；IL-6是一種炎癥介質(zhì)，在椎間盤髓核中檢測細胞質(zhì)中表達的IL-6，腰椎間盤突出組IL-6表達顯著升高。IL-6基因過表達是椎間盤退變的重要危險因素[22]，IL-6水平增高可引起LDH持續(xù)性腰椎神經(jīng)根痛癥狀[23]，研究表明通過IL6/STAT3通路可調(diào)節(jié)腰椎間盤退變的發(fā)生[24]。調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)A的表達可改善椎間盤的營養(yǎng)供應進而延緩椎間盤退變[25]，腫瘤蛋白P53也稱P53，屬于人體抑癌基因的一種，VEGF與P53可在椎間盤組織中協(xié)同表達，共同參與血管形成和浸潤，并加速椎間盤組織變性[26]。MAPK1又叫胞外信號調(diào)節(jié)激酶2，通過參與MAPK信號轉(zhuǎn)導通路控制髓核細胞凋亡，為椎間盤退變過程中的重要基因[27]。MMP9、MMP13是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，研究發(fā)現(xiàn)，MMP9在miR-133a的下調(diào)靶向作用下可誘導Ⅱ型膠原蛋白丟失，進而影響椎間盤退變[28]。Jun為活化蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，實驗研究發(fā)現(xiàn)c-Jun通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)的表達促進細胞增殖并減少細胞凋亡，通過降低TNF-α，IL-1β，IL-6的表達來抑制炎癥反應，進而延緩椎間盤退變[29]。TNF基因家族中，TNF-α屬于其中一員，其通過核因子κB信號轉(zhuǎn)導通路在腰椎間盤突出的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[30]。通過GO富集分析可推測，這些關鍵靶點蛋白主要在質(zhì)膜、細胞核、細胞質(zhì)等位置發(fā)揮作用，并通過細胞增殖的正調(diào)控、凋亡的負調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等生物過程，發(fā)揮激酶活性、與蛋白質(zhì)結合等分子功能。

KEGG信號通路富集分析中，MAPK、PI3K-AKT、TNF以及核因子κB信號通路可能為身痛逐瘀湯治療LDH的關鍵信號通路。其中，MAPK信號通路主要存在胞外信號調(diào)節(jié)激酶、JUK及p38MAPK 3種經(jīng)典信號通路，與炎癥反應、細胞凋亡及細胞生長分化密切相關，綜合MAPK信號通路相關研究報道，其可能通過以下幾個方面來延緩LDH的椎間盤退變：1)抑制炎癥反應：有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與椎間盤退變的微環(huán)境相關[31]，其可通過p38 MAPK信號通路轉(zhuǎn)導介導IL-6的釋放，降低椎間盤退變微環(huán)境的惡化，進而延緩椎間盤退變；Ge等[32]研究發(fā)現(xiàn)外源性IL-10治療可誘導抗炎反應并抑制p38 MAPK活化，可減輕髓核細胞的形態(tài)和細胞外基質(zhì)變性，從而延遲椎間盤變性。2)介導細胞外基質(zhì)的合成、分解代謝：細胞外基質(zhì)的合成分解代謝失衡是軟骨細胞和椎間盤髓核細胞變性的關鍵影響因素，有研究發(fā)現(xiàn)白血病抑制因子能促進聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原α1的表達，其可通過激活MAPK-ERK1/2信號通路促進髓核細胞外基質(zhì)的合成，起到延緩椎間盤退變的作用[33-34]。3)誘導細胞增殖、凋亡、自噬作用：據(jù)報道機械負荷與糖尿病是椎間盤退變的危險因素，機械生長因子可降低胱天蛋白酶3活性，下調(diào)Bax基因/蛋白表達，而增高機械性超負荷條件下Bcl-2基因/蛋白質(zhì)表達，其通過調(diào)節(jié)p38 MAPK通路來減輕機械性超負荷誘導的髓核細胞的凋亡[35]；Shan等[36]通過高糖對大鼠椎間盤纖維環(huán)(Annulus Fibrosus，AF)細胞凋亡實驗研究發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖通過以葡萄糖濃度依賴性方式調(diào)節(jié)JNK信號通路和p38 MAPK信號通路來促進椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡；也有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的胰島素樣生長因子結合蛋白3可以通過靶向胞外信號調(diào)節(jié)激酶/MAPK信號通路來抑制髓核細胞的遷移和侵襲[37]，該過程與細胞增殖、凋亡、自噬和細胞衰老密切相關。PI3K/AKT信號通路在身痛逐瘀湯治療LDH過程中也可能發(fā)揮重要作用，有研究表明通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路，可減少髓核細胞外基質(zhì)的降解，促進增殖并降低細胞凋亡和炎癥水平，從而緩解椎間盤退變，其作用機制與MAPK信號通路具有相通之處[38-40]。在對LDH椎間盤退變的研究中，核因子κB對椎間盤退變的作用機制包括調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的代謝平衡、介導炎癥反應及誘導細胞凋亡[41]。有研究報道機械應力刺激通過激活核因子κB信號通路直接誘導基質(zhì)降解酶，從而加速髓核細胞外基質(zhì)的分解代謝水平，促進髓核細胞變性[42-43]；Gao等[44]發(fā)現(xiàn)柚皮苷通過下調(diào)核因子κB通路和p53表達來減輕炎癥反應及減弱基質(zhì)金屬蛋白酶分解代謝，從而降低髓核細胞凋亡。

本研究中，在加壓環(huán)境下，隨著時間的增加，單純壓力組髓核細胞凋亡率隨著作用時間也不斷增高；相對于單純壓力組，在同一作用時間下，經(jīng)身痛逐瘀湯中藥血清干預后的中藥組髓核細胞凋亡率更低，說明身痛逐瘀湯中藥血清可降低髓核細胞凋亡率。蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白顯示，在同一作用時間下，中藥組核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3的蛋白表達水平明顯低于單純壓力組，說明經(jīng)身痛逐瘀湯含藥血清干預后核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表達受到抑制，身痛逐瘀湯可能通過抑制核因子κB信號通路，抑制MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表達來減少髓核細胞的凋亡，進而延緩椎間盤退變。

綜上所述，LDH發(fā)病機制錯綜復雜，身痛逐瘀湯通過多種活性成分作用于多個相關基因靶點，并通過多種信號通路來治療LDH，這體現(xiàn)了身痛逐瘀湯治療LDH具有多成分、多靶點、多通路的特點，其可能通過抑制炎癥反應、介導細胞外基質(zhì)合成分解代謝及誘導細胞增殖、凋亡、自噬作用等作用通路來發(fā)揮治療LDH的作用，這為身痛逐瘀湯治療LDH的基礎和臨床研究提供新的方向。網(wǎng)絡藥理學方法對中藥復方作用機制的研究存在本身的局限性[45]，不能全面地分析身痛逐瘀湯所有成分、作用靶點及通路，今后還需要更深入地挖掘及通過相關實驗進行驗證。