基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討玉屏風(fēng)散治療肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制

金 虹 龐雪瑩 劉松江

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040； 2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱，150040)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)為全球第6大常見癌癥，約占原發(fā)性肝癌的80%，目前已是我國第4位的常見惡性腫瘤及第3位的腫瘤致死病因[1]，給患者帶來了巨大的生理及心理雙重壓力，同時(shí)加重了社會(huì)的經(jīng)濟(jì)壓力。肝癌在中醫(yī)學(xué)上可歸屬于積聚、癥瘕、臌脹范疇。《中藏經(jīng)》曾言道：“積聚癥瘕雜蟲者，皆五臟六腑真氣失而邪氣并?！盚CC的發(fā)病原因多因正氣不足所致，氣虛無以行血，最終導(dǎo)致肝血因瘀而不通，長(zhǎng)期可致肝體失于濡養(yǎng)，造成氣滯血瘀于內(nèi)，故而形成癥瘕積聚，終發(fā)為肝癌[2]。在臨床中由于早期診斷方法不足且HCC發(fā)病隱匿，導(dǎo)致多數(shù)患者在最終臨床確診時(shí)已屬于中晚期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，現(xiàn)臨床實(shí)踐提示經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞化療(Transcatheter Arterial Chemoembolization，TACE)可有效延長(zhǎng)患者生存期，但術(shù)后仍常出現(xiàn)疼痛、發(fā)熱、惡心等一系列不良反應(yīng)[3]。

現(xiàn)代研究表明中藥在臨床上可整體調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)，具有療效可觀且不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，可通過多通路、多靶點(diǎn)等角度治療疾病[4]，故HCC的臨床診療模式正逐漸向中西醫(yī)結(jié)合治療轉(zhuǎn)變。正氣不足為中醫(yī)學(xué)總結(jié)得出的HCC發(fā)病的主要原因，玉屏風(fēng)散作為中醫(yī)學(xué)中扶正固表的經(jīng)典名方，不但可增強(qiáng)機(jī)體免疫力[5]，還可調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤的作用[6]。方中所涉及的黃芪、防風(fēng)、白術(shù)均為臨床治療HCC中的常用藥[7]?，F(xiàn)代研究表明，黃芪不但具有抗腫瘤作用，還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和抗氧化等作用[8]，白術(shù)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抑制腫瘤組織的侵襲能力等作用[9]，防風(fēng)在研究中表明其具有抗炎，抗氧化及抗腫瘤等作用[10]。因此可推測(cè)玉屏風(fēng)散存在治療HCC的潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制。

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法可從系統(tǒng)層面揭示中藥對(duì)機(jī)體調(diào)控的作用，所構(gòu)建的“藥物-成分-疾病”的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖作為一種新的研究思路，突破了單一靶點(diǎn)，單一途徑的藥物研究束縛，其獨(dú)有的系統(tǒng)性、整體性與中醫(yī)藥研究的理念契合[11-12]。本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究手段，探討了玉屏風(fēng)散治療HCC的作用機(jī)制，為今后使用玉屏風(fēng)散治療HCC的臨床及實(shí)驗(yàn)研究提供了新的探索思路及方向。

1 資料與方法

1.1 獲取與篩選玉屏風(fēng)散的活性成分 將玉屏風(fēng)散中所含藥物，即黃芪、防風(fēng)及白術(shù)在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com.php)中進(jìn)行檢索。將篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18，篩選出有效成分后，將玉屏風(fēng)散活性成分的靶基因通過TCMSP進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理，去除重復(fù)值。

1.2 獲取疾病靶點(diǎn) 以“Hepatocellular Carcinoma”作為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中進(jìn)行搜索，將檢索到的蛋白通過UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 構(gòu)建“藥物-疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 篩選玉屏風(fēng)散活性成分的靶基因與疾病基因的共同基因，繪制韋恩圖并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中以形成“藥物-疾病-成分-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖，其中的節(jié)點(diǎn)(Node)代表了藥物的活性成分、關(guān)鍵靶基因及HCC等，邊(Edge)則代表點(diǎn)與點(diǎn)的作用關(guān)系。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)，將選項(xiàng)中的物種定義為“Homo sapiens”，以構(gòu)建玉屏風(fēng)散治療HCC核心靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，再將以上所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2中，利用“Network Analyze”從而進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞膮?shù)分析，并設(shè)置Degree值大于平均值(≥11)作為標(biāo)準(zhǔn)以進(jìn)行篩選，最終得到核心靶點(diǎn)信息。

1.5 基因本體富集分析及京都基因和基因組百科全書富集分析 使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫將篩選出的PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)進(jìn)行導(dǎo)入，將種屬選項(xiàng)定義為“Homo Sapiens”，再依次選取“GOTERM_BP_DIRECT”“GOTERM_CC_DIRECT”“GOTERM_MF_DIRECT”和“KEGG_PATHWAY”進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)生物過程的富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05，得到符合條件的前10條生物過程和KEGG通路，并用條形圖進(jìn)行結(jié)果展示。

2 結(jié)果

2.1 篩選及預(yù)測(cè)藥物活性成分靶點(diǎn) 最終得到玉屏風(fēng)散的活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)共92個(gè)，其中有效成分包括細(xì)胞腫瘤抗原p53(Cellular Tumor Antigen p53)、凋亡調(diào)節(jié)劑Bcl-2(Apoptosis Regulator Bcl-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6)等。見表1。

表1 玉屏風(fēng)散主要成分

續(xù)表1 玉屏風(fēng)散主要成分

2.2 玉屏風(fēng)散治療HCC的潛在作用靶點(diǎn) 藥物與疾病的韋恩圖得到交集靶點(diǎn)，即玉屏風(fēng)散治療HCC的潛在靶點(diǎn)，共66個(gè)。見圖1。

圖1 藥物-疾病韋恩圖

2.3 “藥物-疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析 構(gòu)建的“藥物-疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中，紅色代表疾病及藥物，橙色、黃色、紫色分別代防風(fēng)、黃芪、白術(shù)中有效成分所對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)，共51個(gè)，藍(lán)色代表玉屏風(fēng)散有效成分及HCC所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，其平均自由度為10.38。見圖2。

圖2 “藥物-疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 篩選出核心靶點(diǎn) 構(gòu)建的玉屏風(fēng)散與HCC共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖包括65個(gè)節(jié)點(diǎn)，328條邊。篩選出26個(gè)的核心靶點(diǎn)，即IL-6、TP53、TNF、NOS3、ESR1、JUN、PTGS2等。見圖3～4。

圖3 玉屏風(fēng)散與HCC的共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 玉屏風(fēng)散治療HCC的核心靶點(diǎn)

2.5 GO富集分析結(jié)果 最終得到146個(gè)條目，各取前10個(gè)條目形成富集條形圖，其中主要涉及到RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控及類固醇激素受體活性等。見圖5。

圖5 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析共得到54個(gè)條目，取前10個(gè)制作富集條形圖，其中涉及癌癥信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及胰島素抵抗等通路。見圖6。

圖6 KEGG功能富集分析

3 討論

HCC雖有臨床治療措施，但5年生存率仍然較低[13]，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為HCC的發(fā)病機(jī)制主要?dú)w結(jié)為正虛邪實(shí)，正虛以脾氣虛及肝腎不足為主，邪實(shí)則以氣滯血瘀為主，治療時(shí)應(yīng)兼顧標(biāo)本。在臨床中中藥可作用于疾病的各個(gè)發(fā)展環(huán)節(jié)，可整體調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫功能，已有研究表明玉屏風(fēng)在治療HCC的過程中具有增強(qiáng)抗腫瘤以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的功效[14-16]。方中以黃芪為君，在內(nèi)可補(bǔ)脾肺，在外可固表，以白術(shù)為臣可益氣健脾，以上二藥相須為用，既可顧護(hù)衛(wèi)表，又可令外邪難侵，另用防風(fēng)為佐，既可祛風(fēng)又可御風(fēng)，三藥合用可顧護(hù)正氣且不留邪。方中黃芪為扶正固本之良藥，現(xiàn)代研究表明，其主要成分為黃芪多糖，不僅可以直接起到免疫調(diào)節(jié)及抗病的作用，還可以通過改善微生態(tài)從而起到間接的免疫調(diào)節(jié)作用[17]。防風(fēng)的主要成分為原酮類及香豆素2類，其具有抗炎、抗驚厥、抗腫瘤及鎮(zhèn)痛等作用[18]。白術(shù)中含有苯丙烷、黃酮、固醇、苯醌和多糖等成分，具有善腸胃功能、抗氧化、抗腫瘤和保護(hù)肝臟等作用[19]。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘的技術(shù)將玉屏風(fēng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，并篩選其有效成分與HCC的交集靶點(diǎn)，制作形成“藥物-疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，將關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了生物通路的富集分析，結(jié)果表明玉屏風(fēng)散治療HCC可能與IL-6、TP53、TNF、NOS3、ESR1、JUN、PTGS2等靶點(diǎn)有關(guān)。IL-6為一種細(xì)胞因子，其具有誘導(dǎo)B細(xì)胞分化，提高自然殺傷細(xì)胞活性，誘導(dǎo)急性期的反應(yīng)并可刺激肝細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡等作用。腫瘤壞死因子則是一種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子[20]。腫瘤蛋白p53(Tumor Protein p53，TP53)作為一種抑癌蛋白，可以起到誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡及衰老的作用，也可參與DNA的修復(fù)或代謝改變[21]。一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)為一種異構(gòu)酶，其中NOS3主要作用為增加血管通透性及調(diào)節(jié)血管擴(kuò)張度[22]。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase，PTGS)2為PTGS誘導(dǎo)型，其參與了HCC的病情進(jìn)展全過程，其在肝癌組織表達(dá)陽性并在進(jìn)展期肝癌組織中高表達(dá)，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子正相關(guān)，其特異性抑制劑可抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。促癌蛋白c-Jun氨基端蛋白激酶可以通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)域的方式調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)，構(gòu)成促癌信號(hào)環(huán)路[24]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)途中結(jié)果顯示可知β-谷甾醇、黃芩素、原酮類、甜菜堿、異紫花前胡內(nèi)酯、5-O-甲基維斯阿米醇、珊瑚菜素所涉及共有靶點(diǎn)最多，這些成分可能參與了玉屏風(fēng)散治療HCC的過程。另外本研究還通過GO富集分析及KEGG生物通路富集分析中看出，使用玉屏風(fēng)散治療HCC的主要靶點(diǎn)涉及細(xì)胞核、與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控、類固醇激素受體活性以及TNF信號(hào)通路等，其中與細(xì)胞核相關(guān)的靶點(diǎn)最多。

綜上所述，玉屏風(fēng)散治療HCC具有多通路、多靶點(diǎn)、多成分的特點(diǎn)，本研究對(duì)可能涉及的機(jī)制進(jìn)行了分析研究，為玉屏風(fēng)散治療HCC提供了新思路。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果僅提示玉屏風(fēng)散與HCC的相關(guān)性，且受限于數(shù)據(jù)庫的完整性，故而仍需要后續(xù)深入研究以進(jìn)一步考察。