鐵皮石斛多糖的分離純化及抗衰老活性研究

趙苑伶 張 雪 陳林珍 劉 妍 劉 靜 趙崇軍 劉永剛 馬志強(qiáng)

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京,100102； 2 中藥品質(zhì)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京,100102)

鐵皮石斛因具有鐵綠色的外表皮而得此名稱，是鐵皮石斛(一種蘭科植物)的干燥莖[1]。其神奇獨(dú)特的藥用價(jià)值深受歷代醫(yī)家推崇，是皇家御用圣品[2]。它有著清熱滋陰與生津益胃等方面的良好功效，大量的數(shù)據(jù)顯示，它的主要功效還包括抗氧化、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)人體的免疫系統(tǒng)等，可以有效地治療消化道疾病、肝膽類疾病和糖尿病等[3]，鐵皮石斛主要含有多糖、芪類、氨基酸、礦質(zhì)元素、生物堿、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[4-10]，而多糖作為其主要活性成分，具有改善抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老等作用[11]。

多糖具有的多種生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，不同的結(jié)構(gòu)有著不同的活性[12]，多糖的構(gòu)型、分子量等都是影響其活性的主要因素，近年來，對鐵皮石斛多糖(Dendrobium Officinale Polysaccharides，DOP)的藥理活性研究主要集中在粗多糖，對分離純化后的多糖藥理活性研究較少，而在多糖的藥理活性中，抗衰老作用不僅具有重要的藥用和保健價(jià)值，也是中藥多糖活性的研究熱點(diǎn)，但純品鐵皮石斛多糖抗衰老作用的研究卻較為少見?？顾ダ匣钚匝芯恐?，常用的動(dòng)物模型有D-半乳糖致衰老小鼠模型、斑馬魚、果蠅和秀麗隱桿線蟲模型等，秀麗隱桿線蟲是抗衰老藥物及抗衰老功能因子研究的理想模型[13-14]，因其生命周期短，可模擬自然衰老，體積小，產(chǎn)卵量大，體內(nèi)大部分基因與人類基因同源，具有高度保守性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為研究衰老調(diào)控機(jī)制十分有用的模式生物之一[15]。研究常以其自然壽命、生殖能力、抗氧化損傷能力及脂質(zhì)含量等作為指標(biāo)，來評價(jià)藥物的抗衰老作用。因此，本文通過分離純化得到鐵皮石斛純品多糖DOP-1，同時(shí)采用秀麗隱桿線蟲作為所需的研究模型，深入地探討DOP-1所具有的抗衰老功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 大腸桿菌E.coli OP50、野生型秀麗隱桿線蟲株N2由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所惠贈(zèng)，野生型秀麗隱桿線蟲株N2于22 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物 鐵皮石斛藥材(樂清楓之靈健康科技有限公司，批號(hào)：20200921)。

1.1.3 試劑與儀器 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Mw1000、5000、12000、50000、270000、670000(阿拉丁公司，批號(hào)分別為A2009198、C2111186、A2125476、D2016056、E2008104、D2027059)，DEAE-Sepharose Fast Flow(索萊寶公司，批號(hào)：20210317)，HW-55F(東曹生物科技有限公司，批號(hào)：55HWFB005FA)，線蟲生長培養(yǎng)基(Nematode Growth Medium，NGM)(上海瑞楚生物科技有限公司，批號(hào)：20210706)，LB液體培養(yǎng)基(索萊寶公司，批號(hào)：20210716)，瓊脂粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20210613)，磷酸二氫鈉(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20200402)，磷酸二氫鉀(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20201105)，氯化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20210115)，硫酸鎂(福晨化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200401)，次氯酸鈉(福晨化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20210525)等均為分析純；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE)、B5-2磁力攪拌器(常州榮華儀器制造有限公司，型號(hào)：B5-2)、恒流泵(上海青浦滬西儀器廠，型號(hào)：HL-2B)、自動(dòng)部分收集器(上海青浦滬西儀器廠，型號(hào)：BS-160A)、冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司，型號(hào)：SCIENTZ-10ND)、體視顯微鏡(Nikon公司，日本，型號(hào)：SMZ 745)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本，型號(hào)：TS-2)、生化培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司，型號(hào)：SPX-250)、萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號(hào)：MS105DU)、高壓蒸汽滅菌器(松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社，日本，型號(hào)：MLS-3751L)。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖的制備 鐵皮石斛藥材取100 g，加入15倍體積水回流提取1.5 h/次，共計(jì)3次，合并提取液并抽濾，濃縮至適量體積后，除去色素、淀粉及小分子雜質(zhì)后，將透析液濃縮至原藥材量的0.8倍，加入95%乙醇至濃縮液含醇量為85%，通過去離子水透析48 h，在4 ℃的溫度下進(jìn)行12 h的醇沉，然后進(jìn)行離心處理，時(shí)間為20 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，之后將沉淀取出來，放置于真空干燥箱進(jìn)行干燥，得到鐵皮石斛粗多糖。

1.2.2 DEAE-Sepharose Fast Flow柱分離 取鐵皮石斛粗多糖500 mg，將其溶于10 mL去離子水中，用微孔濾膜過濾，去除雜質(zhì)，上清液用DEAE-Sepharose Fast Flow進(jìn)行離子柱層析進(jìn)行洗脫，用去離子水作為洗脫液[16]。自動(dòng)收集器收集洗脫液，并用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，對以上的多糖部位進(jìn)行收集，濃縮，透析，干燥。得到干燥的水溶性多糖部位。

1.2.3 HW-55F凝膠柱純化 將上述得到的水溶液鐵皮石斛多糖100 mg溶于10 mL去離子水中，用微孔濾膜過濾，去除雜質(zhì)，上清液用HW-55F凝膠進(jìn)行柱層析進(jìn)行洗脫，用去離子水作為洗脫液。自動(dòng)收集器收集洗脫液，酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，濃縮，透析，干燥，得到干燥的多糖部位，命名為DOP-1。

1.2.4 鐵皮石斛多糖的均一性鑒定及相對分子質(zhì)量測定 采用高效凝膠滲透色譜法(High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC)測定DOP-1的分子量和純度，配置1 mg/mL的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，以純凈水作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測，采用TSK G4000 PWXL(300 mm×7.8 mm，10 μm)型號(hào)的色譜柱，流速設(shè)置為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL，檢測器采用視差折光檢測器。根據(jù)葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式，配置1 mg/mL的多糖樣品溶液進(jìn)行檢測。

1.2.5 秀麗隱桿線蟲的基本培養(yǎng) 配制新鮮NGM，過夜后，在培養(yǎng)基上均勻地涂布OP50大腸桿菌，培養(yǎng)基邊緣留出約0.5 cm為無菌區(qū)，涂布后的培養(yǎng)皿于37 ℃過夜培養(yǎng)。通過滅菌手術(shù)刀將一部分舊培養(yǎng)基(其中含大量線蟲)切下來，采用倒置的方式放于培養(yǎng)基表面上，然后在22 ℃進(jìn)行靜置培養(yǎng)處理，每隔一段時(shí)間即進(jìn)行更換。

1.2.6 線蟲的壽命實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[17]的方法，收集同期化L4期線蟲至配制涂布OP50大腸桿菌的不同濃度DOP-1溶液(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)NGM，根據(jù)研究需要設(shè)置以不含DOP-1溶液的NGM培養(yǎng)基為對照組，在培養(yǎng)基當(dāng)中添加五氟尿嘧啶，其濃度為200 μmol/L，以對線蟲的繁殖過程進(jìn)行有效的抑制。將線蟲挑選處理并放到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基之上，線蟲數(shù)量為30條/板，3板/組。記L4期給藥為第0天，每隔1 d即進(jìn)行1次的定點(diǎn)計(jì)數(shù)，將正常死亡線蟲挑出來，并且將異常的去除掉[18]。該過程持續(xù)到所有線蟲均已死亡，然后不再計(jì)數(shù)，該過程共重復(fù)3次，然后繪制壽命曲線。所采用的死亡標(biāo)準(zhǔn)具體如下：通過挑蟲器來對其頭尾部進(jìn)行多次輕觸，如果沒有反應(yīng)，則可認(rèn)為其已經(jīng)死亡。

1.2.7 線蟲的生殖實(shí)驗(yàn) 結(jié)合參考文獻(xiàn)[19]所提出的方法，按照上述方法操作，每組培養(yǎng)板上放置1條線蟲，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)完成實(shí)驗(yàn)后，則定期轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)板上，且將原有培養(yǎng)板保留下來，并于次日開展計(jì)數(shù)工作，將產(chǎn)卵量記錄下來，實(shí)驗(yàn)共持續(xù)5 d[20]。

1.2.8 線蟲的急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 結(jié)合參考文獻(xiàn)[21]所提出的方法，按照上述方法操作，將線蟲挑選處理并放到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基之上，線蟲數(shù)量為30條/板，3板/組。給藥培養(yǎng)3 d，將線蟲挑出來并且轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基里，然后在37 ℃下進(jìn)行觀察。每隔1 h即進(jìn)行1次計(jì)數(shù)，將已經(jīng)死亡的線蟲挑出來并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。該過程持續(xù)到全部線蟲死亡，實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。

1.2.9 線蟲的氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 結(jié)合參考文獻(xiàn)[22]所提出的方法，按照上述方法操作，在含濃度為600 mmol/L的百草枯溶液的培養(yǎng)基中放入培養(yǎng)好的各組線蟲，線蟲數(shù)量為30條/板，3板/組。此外，每隔2 h即進(jìn)行1次定點(diǎn)計(jì)數(shù)，將已經(jīng)死亡的線蟲挑出來并進(jìn)行計(jì)數(shù)。該過程持續(xù)全部線蟲死亡，實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。

1.2.10 線蟲的脂褐素實(shí)驗(yàn) 結(jié)合參考文獻(xiàn)[23]所提出的方法，按照上述方法培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)好的線蟲挑出，30條/組，麻醉，制片，熒光顯微鏡下觀察拍照(紫光激發(fā)，藍(lán)光發(fā)射)，實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛多糖的純度及相對分子質(zhì)量分析 鐵皮石斛純化多糖的HPGPC結(jié)果顯示，分離純化后的多糖組分洗脫曲線形態(tài)對稱，存在著較為單一的峰形特征，并且具有比較高的純度(純度達(dá)到了98%)。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果和GPC軟件所得數(shù)據(jù)綜合分析，可繪制出樣品的示差色譜圖。利用已知葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對數(shù)為縱坐標(biāo)，HPLC所顯示的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，根據(jù)DOP-1的液相圖中的保留時(shí)間，可計(jì)算得出鐵皮石斛純品多糖的相對平均分子量是DOP-1(Mw)﹕3.260×105。見圖1。

圖1 鐵皮石斛多糖高效凝膠色譜圖

2.2 DOP-1對線蟲壽命的影響 不同濃度的DOP-1均能延長線蟲的壽命，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，并使線蟲的生命曲線右移，對照組和DOP-1低濃度、中濃度、高濃度組線蟲的平均壽命分別為(13.12±0.59)d、(16.51±0.60)d、(18.81±0.51)d、(17.49±0.45)d。且當(dāng)DOP-1的濃度為200 μg/mL時(shí)，與對照組比較，壽命提高了43.37%，延長壽命效果更為顯著。見圖2。

圖2 DOP-1對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

2.3 DOP-1對線蟲生殖能力的影響 與對照組比較，在100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的DOP-1當(dāng)中，其產(chǎn)卵量基本接近，而且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 DOP-1對線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響

2.4 DOP-1對線蟲抵抗外界急性熱應(yīng)激能力的影響 與對照組比較，各個(gè)濃度條件(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)的DOP-1組具有顯著更高的存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 熱應(yīng)激下DOP-1對線蟲壽命的影響

2.5 DOP-1對線蟲急性氧化應(yīng)激的影響 經(jīng)不同濃度的DOP-1處理后，秀麗線蟲在經(jīng)歷百草枯急性應(yīng)激時(shí)其生存能力顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖5。

圖5 氧化應(yīng)激下DOP-1對線蟲壽命的影響

2.6 DOP-1對秀麗線蟲體內(nèi)腸脂褐質(zhì)的影響 利用熒光顯微鏡可觀察到線蟲體內(nèi)的脂褐素發(fā)出的藍(lán)色熒光。見圖6。通過熒光密度的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)不同濃度的DOP-1均能降低線蟲體內(nèi)脂褐素的積累，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

圖6 熒光照射下，線蟲體內(nèi)產(chǎn)生的藍(lán)色熒光

圖7 DOP-1對秀麗隱桿線蟲脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

3 討論

多糖是鐵皮石斛的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗衰老作用。分離純化鐵皮石斛多糖，得到均一多糖，并研究其藥理活性，有利于對其化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性之間關(guān)系的研究提供思路。本實(shí)驗(yàn)以鐵皮石斛鮮品為原料，通過水提醇沉獲得粗多糖，然后經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱和HW-55F凝膠柱進(jìn)行分離純化，獲得了純化的鐵皮石斛多糖DOP-1。通過凝膠滲透色譜法對DOP-1進(jìn)行分析，結(jié)果表明中鐵皮石斛多糖為均一性多糖，相對分子質(zhì)量為3.260×105。

衰老指的是有關(guān)的機(jī)體功能丟失并逐步地喪失了適應(yīng)周圍環(huán)境的能力，該過程涉及到不同因素的影響與控制，截至今日，尚未探明其具體的生物學(xué)機(jī)制。氧化應(yīng)激、細(xì)胞老化和慢性炎癥都可能是誘導(dǎo)衰老的因素[24-25]。本研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物，對DOP-1的抗衰老活性進(jìn)行研究，主要研究其壽命、生殖能力及抗氧化損傷能力等。對于抗衰老作用研究，自然壽命是其首選分析指標(biāo)，能直接觀察藥物對其壽命的影響，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的DOP-1均能提高秀麗隱桿線蟲壽命，且濃度為200 μg/mL的DOP-1效果最顯著，與對照組比較，線蟲壽命增加了43.37%；開展DOP-1對線蟲生殖能力的影響這一研究，主要目的是探討對于延壽方面，DOP-1是否會(huì)損害線蟲的生殖能力，或者說，在延壽的同時(shí)生殖能力是否發(fā)生了改變。抗衰老藥物應(yīng)同時(shí)具備增加壽命和維持機(jī)體正常生理活動(dòng)2方面的條件，關(guān)于增加線蟲的壽命作用是否以損害生理功能為代價(jià)，不同的抗氧化物質(zhì)的研究結(jié)果不同，需要進(jìn)行實(shí)際的研究[26]。為了評價(jià)DOP-1在延緩線蟲衰老時(shí)是否會(huì)對其生殖能力產(chǎn)生不良影響，進(jìn)行了不同DOP-1濃度處理下線蟲產(chǎn)卵后幼蟲的數(shù)量的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明DOP-1對線蟲產(chǎn)卵能力沒有顯著影響，并未使其喪失生殖能力。研究表明，熱應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體氧化還原平衡紊亂，發(fā)生氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞，評價(jià)體外熱應(yīng)激引起的秀麗隱桿線蟲機(jī)體損傷的方法是在體外施加37 ℃高溫刺激線蟲，以在線蟲中誘導(dǎo)熱應(yīng)激反應(yīng)并改善線蟲的熱應(yīng)激狀態(tài)和促進(jìn)線蟲中耐熱蛋白的表達(dá)，從而提高其自身的耐受能力和增強(qiáng)因熱損傷帶來的保護(hù)作用[27-28]。結(jié)果表明在高溫壓力下，DOP-1能夠改善秀麗線蟲的熱應(yīng)激狀態(tài)并提高其耐熱激能力，對秀麗線蟲具有抗熱激損傷保護(hù)作用。百草枯毒是一種強(qiáng)氧化劑，在機(jī)體進(jìn)行代謝之后，產(chǎn)生了超氧陰離子自由基，由此造成了機(jī)體的氧化損傷。衰老的自由基損傷學(xué)說認(rèn)為維持自由基和氧化應(yīng)激系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡的能力可以延緩衰老[29-30]，結(jié)果表明在壓力環(huán)境下DOP-1可以促進(jìn)秀麗線蟲抗氧化蛋白的表達(dá)，提高其自身的耐受能力和清除自由基的能力，進(jìn)而增強(qiáng)了因氧化損傷而帶來的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DOP-1對37 ℃高溫?fù)p傷和百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷均具有一定抵御作用，推測DOP-1可能是通過改善線蟲在應(yīng)激條件下的生存狀態(tài)而延緩衰老；腸道自發(fā)熒光反映了脂褐素的積累，其積累隨年齡增長而增多，可作為線蟲機(jī)體衰老的有效的生物標(biāo)志[31]，通過熒光檢測線蟲脂褐素水平發(fā)現(xiàn)，DOP-1處理下自發(fā)熒光減弱，有效降低了脂褐素的積累，延緩線蟲衰老。結(jié)果表明DOP-1具有明顯的抗衰老的作用。針對DOP-1良好的抗衰老作用，可進(jìn)一步考慮研究其抗衰老作用機(jī)制，以期為鐵皮石斛多糖開發(fā)成延緩衰老的保健功能食品和藥品提供理論依據(jù)。