趙苑伶 張 雪 陳林珍 劉 妍 劉 靜 趙崇軍 劉永剛 馬志強(qiáng)
(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京,100102; 2 中藥品質(zhì)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100102)
鐵皮石斛因具有鐵綠色的外表皮而得此名稱,是鐵皮石斛(一種蘭科植物)的干燥莖[1]。其神奇獨(dú)特的藥用價(jià)值深受歷代醫(yī)家推崇,是皇家御用圣品[2]。它有著清熱滋陰與生津益胃等方面的良好功效,大量的數(shù)據(jù)顯示,它的主要功效還包括抗氧化、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)人體的免疫系統(tǒng)等,可以有效地治療消化道疾病、肝膽類疾病和糖尿病等[3],鐵皮石斛主要含有多糖、芪類、氨基酸、礦質(zhì)元素、生物堿、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[4-10],而多糖作為其主要活性成分,具有改善抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老等作用[11]。
多糖具有的多種生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān),不同的結(jié)構(gòu)有著不同的活性[12],多糖的構(gòu)型、分子量等都是影響其活性的主要因素,近年來,對鐵皮石斛多糖(Dendrobium Officinale Polysaccharides,DOP)的藥理活性研究主要集中在粗多糖,對分離純化后的多糖藥理活性研究較少,而在多糖的藥理活性中,抗衰老作用不僅具有重要的藥用和保健價(jià)值,也是中藥多糖活性的研究熱點(diǎn),但純品鐵皮石斛多糖抗衰老作用的研究卻較為少見??顾ダ匣钚匝芯恐?,常用的動(dòng)物模型有D-半乳糖致衰老小鼠模型、斑馬魚、果蠅和秀麗隱桿線蟲模型等,秀麗隱桿線蟲是抗衰老藥物及抗衰老功能因子研究的理想模型[13-14],因其生命周期短,可模擬自然衰老,體積小,產(chǎn)卵量大,體內(nèi)大部分基因與人類基因同源,具有高度保守性等特點(diǎn),已經(jīng)成為研究衰老調(diào)控機(jī)制十分有用的模式生物之一[15]。研究常以其自然壽命、生殖能力、抗氧化損傷能力及脂質(zhì)含量等作為指標(biāo),來評價(jià)藥物的抗衰老作用。因此,本文通過分離純化得到鐵皮石斛純品多糖DOP-1,同時(shí)采用秀麗隱桿線蟲作為所需的研究模型,深入地探討DOP-1所具有的抗衰老功能。
1.1 材料
1.1.1 動(dòng)物 大腸桿菌E.coli OP50、野生型秀麗隱桿線蟲株N2由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所惠贈(zèng),野生型秀麗隱桿線蟲株N2于22 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.1.2 藥物 鐵皮石斛藥材(樂清楓之靈健康科技有限公司,批號(hào):20200921)。
1.1.3 試劑與儀器 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Mw1000、5000、12000、50000、270000、670000(阿拉丁公司,批號(hào)分別為A2009198、C2111186、A2125476、D2016056、E2008104、D2027059),DEAE-Sepharose Fast Flow(索萊寶公司,批號(hào):20210317),HW-55F(東曹生物科技有限公司,批號(hào):55HWFB005FA),線蟲生長培養(yǎng)基(Nematode Growth Medium,NGM)(上海瑞楚生物科技有限公司,批號(hào):20210706),LB液體培養(yǎng)基(索萊寶公司,批號(hào):20210716),瓊脂粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào):20210613),磷酸二氫鈉(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司,批號(hào):20200402),磷酸二氫鉀(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司,批號(hào):20201105),氯化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號(hào):20210115),硫酸鎂(福晨化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20200401),次氯酸鈉(福晨化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20210525)等均為分析純;數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,型號(hào):KQ-500DE)、B5-2磁力攪拌器(常州榮華儀器制造有限公司,型號(hào):B5-2)、恒流泵(上海青浦滬西儀器廠,型號(hào):HL-2B)、自動(dòng)部分收集器(上海青浦滬西儀器廠,型號(hào):BS-160A)、冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司,型號(hào):SCIENTZ-10ND)、體視顯微鏡(Nikon公司,日本,型號(hào):SMZ 745)、熒光顯微鏡(Nikon公司,日本,型號(hào):TS-2)、生化培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司,型號(hào):SPX-250)、萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多公司,瑞士,型號(hào):MS105DU)、高壓蒸汽滅菌器(松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社,日本,型號(hào):MLS-3751L)。
1.2 方法
1.2.1 鐵皮石斛多糖的制備 鐵皮石斛藥材取100 g,加入15倍體積水回流提取1.5 h/次,共計(jì)3次,合并提取液并抽濾,濃縮至適量體積后,除去色素、淀粉及小分子雜質(zhì)后,將透析液濃縮至原藥材量的0.8倍,加入95%乙醇至濃縮液含醇量為85%,通過去離子水透析48 h,在4 ℃的溫度下進(jìn)行12 h的醇沉,然后進(jìn)行離心處理,時(shí)間為20 min,轉(zhuǎn)速為4 000 r/min,之后將沉淀取出來,放置于真空干燥箱進(jìn)行干燥,得到鐵皮石斛粗多糖。
1.2.2 DEAE-Sepharose Fast Flow柱分離 取鐵皮石斛粗多糖500 mg,將其溶于10 mL去離子水中,用微孔濾膜過濾,去除雜質(zhì),上清液用DEAE-Sepharose Fast Flow進(jìn)行離子柱層析進(jìn)行洗脫,用去離子水作為洗脫液[16]。自動(dòng)收集器收集洗脫液,并用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,對以上的多糖部位進(jìn)行收集,濃縮,透析,干燥。得到干燥的水溶性多糖部位。
1.2.3 HW-55F凝膠柱純化 將上述得到的水溶液鐵皮石斛多糖100 mg溶于10 mL去離子水中,用微孔濾膜過濾,去除雜質(zhì),上清液用HW-55F凝膠進(jìn)行柱層析進(jìn)行洗脫,用去離子水作為洗脫液。自動(dòng)收集器收集洗脫液,酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,濃縮,透析,干燥,得到干燥的多糖部位,命名為DOP-1。
1.2.4 鐵皮石斛多糖的均一性鑒定及相對分子質(zhì)量測定 采用高效凝膠滲透色譜法(High Performance Gel Permeation Chromatography,HPGPC)測定DOP-1的分子量和純度,配置1 mg/mL的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,以純凈水作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測,采用TSK G4000 PWXL(300 mm×7.8 mm,10 μm)型號(hào)的色譜柱,流速設(shè)置為1 mL/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣體積為20 μL,檢測器采用視差折光檢測器。根據(jù)葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式,配置1 mg/mL的多糖樣品溶液進(jìn)行檢測。
1.2.5 秀麗隱桿線蟲的基本培養(yǎng) 配制新鮮NGM,過夜后,在培養(yǎng)基上均勻地涂布OP50大腸桿菌,培養(yǎng)基邊緣留出約0.5 cm為無菌區(qū),涂布后的培養(yǎng)皿于37 ℃過夜培養(yǎng)。通過滅菌手術(shù)刀將一部分舊培養(yǎng)基(其中含大量線蟲)切下來,采用倒置的方式放于培養(yǎng)基表面上,然后在22 ℃進(jìn)行靜置培養(yǎng)處理,每隔一段時(shí)間即進(jìn)行更換。
1.2.6 線蟲的壽命實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[17]的方法,收集同期化L4期線蟲至配制涂布OP50大腸桿菌的不同濃度DOP-1溶液(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)NGM,根據(jù)研究需要設(shè)置以不含DOP-1溶液的NGM培養(yǎng)基為對照組,在培養(yǎng)基當(dāng)中添加五氟尿嘧啶,其濃度為200 μmol/L,以對線蟲的繁殖過程進(jìn)行有效的抑制。將線蟲挑選處理并放到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基之上,線蟲數(shù)量為30條/板,3板/組。記L4期給藥為第0天,每隔1 d即進(jìn)行1次的定點(diǎn)計(jì)數(shù),將正常死亡線蟲挑出來,并且將異常的去除掉[18]。該過程持續(xù)到所有線蟲均已死亡,然后不再計(jì)數(shù),該過程共重復(fù)3次,然后繪制壽命曲線。所采用的死亡標(biāo)準(zhǔn)具體如下:通過挑蟲器來對其頭尾部進(jìn)行多次輕觸,如果沒有反應(yīng),則可認(rèn)為其已經(jīng)死亡。
1.2.7 線蟲的生殖實(shí)驗(yàn) 結(jié)合參考文獻(xiàn)[19]所提出的方法,按照上述方法操作,每組培養(yǎng)板上放置1條線蟲,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)完成實(shí)驗(yàn)后,則定期轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)板上,且將原有培養(yǎng)板保留下來,并于次日開展計(jì)數(shù)工作,將產(chǎn)卵量記錄下來,實(shí)驗(yàn)共持續(xù)5 d[20]。
1.2.8 線蟲的急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 結(jié)合參考文獻(xiàn)[21]所提出的方法,按照上述方法操作,將線蟲挑選處理并放到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基之上,線蟲數(shù)量為30條/板,3板/組。給藥培養(yǎng)3 d,將線蟲挑出來并且轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基里,然后在37 ℃下進(jìn)行觀察。每隔1 h即進(jìn)行1次計(jì)數(shù),將已經(jīng)死亡的線蟲挑出來并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。該過程持續(xù)到全部線蟲死亡,實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。
1.2.9 線蟲的氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 結(jié)合參考文獻(xiàn)[22]所提出的方法,按照上述方法操作,在含濃度為600 mmol/L的百草枯溶液的培養(yǎng)基中放入培養(yǎng)好的各組線蟲,線蟲數(shù)量為30條/板,3板/組。此外,每隔2 h即進(jìn)行1次定點(diǎn)計(jì)數(shù),將已經(jīng)死亡的線蟲挑出來并進(jìn)行計(jì)數(shù)。該過程持續(xù)全部線蟲死亡,實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。
1.2.10 線蟲的脂褐素實(shí)驗(yàn) 結(jié)合參考文獻(xiàn)[23]所提出的方法,按照上述方法培養(yǎng)5 d,將培養(yǎng)好的線蟲挑出,30條/組,麻醉,制片,熒光顯微鏡下觀察拍照(紫光激發(fā),藍(lán)光發(fā)射),實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。
2.1 鐵皮石斛多糖的純度及相對分子質(zhì)量分析 鐵皮石斛純化多糖的HPGPC結(jié)果顯示,分離純化后的多糖組分洗脫曲線形態(tài)對稱,存在著較為單一的峰形特征,并且具有比較高的純度(純度達(dá)到了98%)。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果和GPC軟件所得數(shù)據(jù)綜合分析,可繪制出樣品的示差色譜圖。利用已知葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對數(shù)為縱坐標(biāo),HPLC所顯示的保留時(shí)間為橫坐標(biāo),根據(jù)DOP-1的液相圖中的保留時(shí)間,可計(jì)算得出鐵皮石斛純品多糖的相對平均分子量是DOP-1(Mw)﹕3.260×105。見圖1。
圖1 鐵皮石斛多糖高效凝膠色譜圖
2.2 DOP-1對線蟲壽命的影響 不同濃度的DOP-1均能延長線蟲的壽命,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),并使線蟲的生命曲線右移,對照組和DOP-1低濃度、中濃度、高濃度組線蟲的平均壽命分別為(13.12±0.59)d、(16.51±0.60)d、(18.81±0.51)d、(17.49±0.45)d。且當(dāng)DOP-1的濃度為200 μg/mL時(shí),與對照組比較,壽命提高了43.37%,延長壽命效果更為顯著。見圖2。
圖2 DOP-1對秀麗隱桿線蟲壽命的影響
2.3 DOP-1對線蟲生殖能力的影響 與對照組比較,在100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的DOP-1當(dāng)中,其產(chǎn)卵量基本接近,而且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。
圖3 DOP-1對線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響
2.4 DOP-1對線蟲抵抗外界急性熱應(yīng)激能力的影響 與對照組比較,各個(gè)濃度條件(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)的DOP-1組具有顯著更高的存活率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。
圖4 熱應(yīng)激下DOP-1對線蟲壽命的影響
2.5 DOP-1對線蟲急性氧化應(yīng)激的影響 經(jīng)不同濃度的DOP-1處理后,秀麗線蟲在經(jīng)歷百草枯急性應(yīng)激時(shí)其生存能力顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖5。
圖5 氧化應(yīng)激下DOP-1對線蟲壽命的影響
2.6 DOP-1對秀麗線蟲體內(nèi)腸脂褐質(zhì)的影響 利用熒光顯微鏡可觀察到線蟲體內(nèi)的脂褐素發(fā)出的藍(lán)色熒光。見圖6。通過熒光密度的計(jì)算,發(fā)現(xiàn)不同濃度的DOP-1均能降低線蟲體內(nèi)脂褐素的積累,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。
圖6 熒光照射下,線蟲體內(nèi)產(chǎn)生的藍(lán)色熒光
圖7 DOP-1對秀麗隱桿線蟲脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響
多糖是鐵皮石斛的主要活性成分,具有良好的抗氧化、抗衰老作用。分離純化鐵皮石斛多糖,得到均一多糖,并研究其藥理活性,有利于對其化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性之間關(guān)系的研究提供思路。本實(shí)驗(yàn)以鐵皮石斛鮮品為原料,通過水提醇沉獲得粗多糖,然后經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱和HW-55F凝膠柱進(jìn)行分離純化,獲得了純化的鐵皮石斛多糖DOP-1。通過凝膠滲透色譜法對DOP-1進(jìn)行分析,結(jié)果表明中鐵皮石斛多糖為均一性多糖,相對分子質(zhì)量為3.260×105。
衰老指的是有關(guān)的機(jī)體功能丟失并逐步地喪失了適應(yīng)周圍環(huán)境的能力,該過程涉及到不同因素的影響與控制,截至今日,尚未探明其具體的生物學(xué)機(jī)制。氧化應(yīng)激、細(xì)胞老化和慢性炎癥都可能是誘導(dǎo)衰老的因素[24-25]。本研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物,對DOP-1的抗衰老活性進(jìn)行研究,主要研究其壽命、生殖能力及抗氧化損傷能力等。對于抗衰老作用研究,自然壽命是其首選分析指標(biāo),能直接觀察藥物對其壽命的影響,本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的DOP-1均能提高秀麗隱桿線蟲壽命,且濃度為200 μg/mL的DOP-1效果最顯著,與對照組比較,線蟲壽命增加了43.37%;開展DOP-1對線蟲生殖能力的影響這一研究,主要目的是探討對于延壽方面,DOP-1是否會(huì)損害線蟲的生殖能力,或者說,在延壽的同時(shí)生殖能力是否發(fā)生了改變。抗衰老藥物應(yīng)同時(shí)具備增加壽命和維持機(jī)體正常生理活動(dòng)2方面的條件,關(guān)于增加線蟲的壽命作用是否以損害生理功能為代價(jià),不同的抗氧化物質(zhì)的研究結(jié)果不同,需要進(jìn)行實(shí)際的研究[26]。為了評價(jià)DOP-1在延緩線蟲衰老時(shí)是否會(huì)對其生殖能力產(chǎn)生不良影響,進(jìn)行了不同DOP-1濃度處理下線蟲產(chǎn)卵后幼蟲的數(shù)量的實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明DOP-1對線蟲產(chǎn)卵能力沒有顯著影響,并未使其喪失生殖能力。研究表明,熱應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體氧化還原平衡紊亂,發(fā)生氧化應(yīng)激,損傷細(xì)胞,評價(jià)體外熱應(yīng)激引起的秀麗隱桿線蟲機(jī)體損傷的方法是在體外施加37 ℃高溫刺激線蟲,以在線蟲中誘導(dǎo)熱應(yīng)激反應(yīng)并改善線蟲的熱應(yīng)激狀態(tài)和促進(jìn)線蟲中耐熱蛋白的表達(dá),從而提高其自身的耐受能力和增強(qiáng)因熱損傷帶來的保護(hù)作用[27-28]。結(jié)果表明在高溫壓力下,DOP-1能夠改善秀麗線蟲的熱應(yīng)激狀態(tài)并提高其耐熱激能力,對秀麗線蟲具有抗熱激損傷保護(hù)作用。百草枯毒是一種強(qiáng)氧化劑,在機(jī)體進(jìn)行代謝之后,產(chǎn)生了超氧陰離子自由基,由此造成了機(jī)體的氧化損傷。衰老的自由基損傷學(xué)說認(rèn)為維持自由基和氧化應(yīng)激系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡的能力可以延緩衰老[29-30],結(jié)果表明在壓力環(huán)境下DOP-1可以促進(jìn)秀麗線蟲抗氧化蛋白的表達(dá),提高其自身的耐受能力和清除自由基的能力,進(jìn)而增強(qiáng)了因氧化損傷而帶來的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DOP-1對37 ℃高溫?fù)p傷和百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷均具有一定抵御作用,推測DOP-1可能是通過改善線蟲在應(yīng)激條件下的生存狀態(tài)而延緩衰老;腸道自發(fā)熒光反映了脂褐素的積累,其積累隨年齡增長而增多,可作為線蟲機(jī)體衰老的有效的生物標(biāo)志[31],通過熒光檢測線蟲脂褐素水平發(fā)現(xiàn),DOP-1處理下自發(fā)熒光減弱,有效降低了脂褐素的積累,延緩線蟲衰老。結(jié)果表明DOP-1具有明顯的抗衰老的作用。針對DOP-1良好的抗衰老作用,可進(jìn)一步考慮研究其抗衰老作用機(jī)制,以期為鐵皮石斛多糖開發(fā)成延緩衰老的保健功能食品和藥品提供理論依據(jù)。