針刺對慢性偏頭痛大鼠趨化因子C-C配體2和C-X-C基序配體1的影響研究

周夢荻 孫銘聲 劉 一 鄭宇琦 蔡定均 趙 凌

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都，610075)

偏頭痛是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其病情特征為反復(fù)發(fā)作、一側(cè)或雙側(cè)搏動性的頭痛[1]。偏頭痛根據(jù)發(fā)作頻率可分為發(fā)作性偏頭痛和慢性偏頭痛，其中每年有大約2.5%的發(fā)作性偏頭痛進(jìn)展為慢性偏頭痛[2]。與發(fā)作性偏頭痛比較，慢性偏頭痛致殘率更高，并導(dǎo)致更多的疾病負(fù)擔(dān)。目前，慢性偏頭痛發(fā)展的生理學(xué)機(jī)制還不完全清楚。有證據(jù)表明炎癥和三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)在發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用[3]。三叉神經(jīng)血管通路將傷害性信息從腦膜傳遞到大腦，三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Spinal Trigeminal Nucleus Caudalis,Sp5C)是三叉神經(jīng)血管通路傳遞腦膜傷害性信息的重要部位[4]。有學(xué)者認(rèn)為，三叉血管中的無菌性神經(jīng)源性炎癥是慢性偏頭痛發(fā)病的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，中樞性炎癥也被認(rèn)為是慢性偏頭痛的主要病因。

慢性偏頭痛作為慢性疼痛的一種，受到了國內(nèi)外研究的關(guān)注，有關(guān)慢性疼痛研究的一個(gè)重要進(jìn)展表明，神經(jīng)炎癥反應(yīng)是慢性疼痛產(chǎn)生和持續(xù)的重要因素[5]。偏頭痛中的神經(jīng)源性炎癥主要以三叉神經(jīng)釋放神經(jīng)肽如降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin Gene-Related Peptide，CGRP)和P物質(zhì)為特征，導(dǎo)致動脈血管擴(kuò)張、血漿蛋白外滲和肥大細(xì)胞脫粒，炎癥介質(zhì)或趨化因子可能參與了這一系列反應(yīng)[6]。趨化因子是一類小分子蛋白，其相對分子質(zhì)量約為8～14 kDa，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥、損傷及病原體入侵時(shí)，其表達(dá)水平增高，可以通過誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛和炎癥疼痛的發(fā)展[7]。其中，趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)，又稱為趨化因子C-C配體2[Chemokine(C-C Motif) Ligand 2，CCL2]，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的一種重要因子，也被認(rèn)為是一種新的致痛因子[8]。有學(xué)者報(bào)道了家族性偏癱偏頭痛小鼠模型的三叉神經(jīng)節(jié)中單核細(xì)胞趨化蛋白(Monocyte Chemotactic Protein-1，MCP-1)的mRNA和蛋白水平較高；并且他們還報(bào)道了偏頭痛患者血漿中MCP-1水平升高[9-11]。此外，趨化因子C-X-C基序配體1[Chemokine(C-X-C Motif) Ligand 1]也在維持慢性炎癥疼痛中發(fā)揮重要作用[12]。在一項(xiàng)研究中也發(fā)現(xiàn)，偏頭痛患者血清中的CXCL1有明顯的升高，CXCL1也是一種炎癥介質(zhì)以及細(xì)胞傷害性因子[13]。最新的研究也發(fā)現(xiàn)多種趨化因子在偏頭痛動物模型中有所表達(dá)[14]。

針灸作為一種傳統(tǒng)的非藥物療法，已被偏頭痛臨床實(shí)踐指南作為推薦方案廣泛應(yīng)用于臨床[15]。大量臨床研究證明針刺治療慢性偏頭痛的療效具有操作簡單方便、療效持久、無不良事件等特點(diǎn)[16]。目前，在國內(nèi)外的研究中發(fā)現(xiàn)，針刺治療偏頭痛多選用少陽經(jīng)穴且效果顯著[17]。為進(jìn)一步探究針灸治療偏頭痛的機(jī)制，本研究通過制備慢性偏頭痛大鼠模型，觀察針刺對Sp5C中趨化因子CCL2以及CXCL1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量200～240 g，由成都恩斯維爾生物科技有限公司的實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)合格證號：SCXK(湘)2019-0004。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下(溫度：22～25 ℃，相對濕度：45%～65%，12 h光照到黑暗周期，隨意進(jìn)食和飲水)被飼養(yǎng)在成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。經(jīng)過1周適應(yīng)期，進(jìn)行分組及造模。實(shí)驗(yàn)遵照科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理編號：2019-23)。

1.1.2 藥物 硝酸甘油注射液(Nitroglycerin，NTG)(北京益民醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H11020289)。

1.1.3 試劑與儀器 華佗牌一次性無菌針灸針0.18 mm×13 mm(蘇州華佗醫(yī)療用品有限公司，批號：222012)，電子Von Frey測痛儀(IITC Life Science Inc，美國，型號：BW-EVF2393)，大鼠MCP-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)藥盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：JM-01506R1)，大鼠CXCL1 ELISA藥盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：JM-10942R1)，酶標(biāo)儀(Diatek公司，型號：DR-200Bs)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分配為4組：對照組(Cont)，模型組(NTG)，針刺組(ACU)，非經(jīng)非穴組(Sham ACU)，每組7只。參照Chen等[18]的報(bào)道：造模方式采用硝酸甘油頸背部皮下注射。以10 mg/kg的劑量在第1、3、5、7、9天，對模型組、針刺組、非經(jīng)非穴組大鼠進(jìn)行頸背部皮下注射。注射時(shí)間為上午，對照組以10 mg/kg的劑量頸背部皮下注射生理鹽水。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)頻繁撓頭、爬籠等偏頭痛樣行為學(xué)現(xiàn)象且大鼠足底機(jī)械痛閾明顯降低[18]。

1.2.2 干預(yù)方法 對大鼠進(jìn)行針刺治療，首先抓取捆綁固定。針刺組選取雙側(cè)“率谷”(位于耳郭尖上方與頂骨結(jié)節(jié)連線的中點(diǎn))、“陽陵泉”(后三里上外側(cè)5 mm處)進(jìn)行針刺干預(yù)。取穴標(biāo)準(zhǔn)參照鄧春雷等主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》以及《實(shí)驗(yàn)動物常用穴位名稱與定位第2部分：大鼠》[19-20]。率谷穴沿皮刺、陽陵泉直刺，進(jìn)針后行小幅度捻轉(zhuǎn)，予以平補(bǔ)平瀉，頻率為120次/min，持續(xù)捻轉(zhuǎn)1 min后，每5分鐘行針1次，留針20 min。非經(jīng)非穴組取大鼠軀干上非穴點(diǎn)Ⅰ(髂棘上10 mm，后正中線旁開20 mm處)、非穴點(diǎn)Ⅱ(髂后上棘止點(diǎn)，肌肉豐厚處)進(jìn)行針刺干預(yù)，留針20 min。模型組、對照組除捆綁固定外不做其余干預(yù)。連續(xù)干預(yù)9 d。

1.2.3 機(jī)械痛閾值測定 采用電子Von Frey儀器，于第1天造模前2 h測定，之后在每次NTG注射造模后2 h測定。首先校準(zhǔn)儀器誤差，同時(shí)將大鼠放入懸空的網(wǎng)格箱中，使其適應(yīng)環(huán)境5～10 min。大鼠安靜后，將儀器讀數(shù)歸零，采用探針自下而上垂直刺激大鼠左后爪或右后爪的中央(無肉墊位置)，逐漸增加壓力，直至觀察到大鼠出現(xiàn)明確的疼痛反應(yīng)，如縮足、抬足、舔舐刺激部位、跳起等，為陽性反應(yīng)。移開探針，儀器自動記錄下數(shù)值。測定痛閾時(shí)，每只大鼠重復(fù)測量5次，然后對最接近5次測量值中位數(shù)的3個(gè)數(shù)值取平均值，得到機(jī)械痛閾值。

1.2.4 ELISA 在第9天對大鼠干預(yù)完成后，用2%的戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，取出Sp5C，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。對組織進(jìn)行研磨勻漿后，取上清液，嚴(yán)格按照ELISA藥盒說明書進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 大鼠足底機(jī)械痛閾比較 各組大鼠在第1天造模前，足底機(jī)械痛閾組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3天注射NTG造模后，模型組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；針刺組痛閾下降較為緩慢。第5天注射NTG后，模型組痛閾持續(xù)降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；針刺組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，針刺組與非經(jīng)非穴組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第7天注射NTG后，模型組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組與針刺組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；針刺組與非經(jīng)非穴組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在第9天最后一次注射NTG后，模型組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，針刺組痛閾與模型組比較持續(xù)升高(P<0.001)；針刺組與非經(jīng)非穴組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間足底機(jī)械痛閾比較

2.2 各組大鼠Sp5C的趨化因子水平的比較 與對照組比較，模型組的Sp5C中CCL2、CXCL1水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)。針刺組的趨化因子CCL2的水平與模型組比較顯著下降(P<0.01)，CXCL1也呈下降趨勢(P<0.05)。然而針刺組與非經(jīng)非穴組之間趨化因子水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠趨化因子CCL2、CXCL1水平的比較

3 討論

偏頭痛是一種常見的慢性神經(jīng)血管性疾病，其病情具有反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈以及致殘性高的特征。三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活及敏化是偏頭痛發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)，其中神經(jīng)源性炎癥是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。硝酸甘油作為一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的供體具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，NO分子小可以穿過血腦屏障[21]，可以引起顱內(nèi)腦膜血管(顱內(nèi)痛敏結(jié)構(gòu))持續(xù)地?cái)U(kuò)張從而誘發(fā)搏動樣頭痛。已有多項(xiàng)報(bào)道研究表明多次間隔的頸背部皮下注射NTG會導(dǎo)致大鼠偏頭痛樣行為及敏化痛覺反應(yīng)[22]。本研究結(jié)果顯示，采用頸背部NTG皮下注射可以成功復(fù)制慢性偏頭痛模型，使偏頭痛大鼠產(chǎn)生痛覺過敏。針刺可以改善慢性偏頭痛大鼠的疼痛閾值，緩解痛覺過敏，并且可以降低大鼠Sp5C中趨化因子CCL2和CXCL1的表達(dá)水平。

在古代偏頭痛就有“經(jīng)久難愈之頭痛”之稱[23]，屬于中醫(yī)學(xué)“頭痛”“頭風(fēng)”范疇。偏頭痛多發(fā)于顳側(cè)，正如《冷廬醫(yī)話》所謂“頭痛屬少陽者，上至兩角，痛在頭角”，其發(fā)作部位與少陽經(jīng)的循行相吻合，與少陽經(jīng)關(guān)系密切。率谷穴為頭部足少陽膽經(jīng)腧穴，其為足少陽、足太陽交會穴，正如《玉龍歌》云：“偏正頭風(fēng)痛難醫(yī)，絲竹金針亦可施，沿皮向后透率谷，一針兩穴世間稀。”具有調(diào)和氣血、活絡(luò)止痛之功。陽陵泉為足少陽膽經(jīng)之合穴，具有活血通絡(luò)、疏調(diào)經(jīng)脈的作用。在本課題組的前期臨床研究中，選取了率谷和陽陵泉這2個(gè)穴位，發(fā)現(xiàn)針灸可降低偏頭痛的頻率和天數(shù)，以及疼痛的強(qiáng)度[24]。Liu等[25]對針刺治療慢性偏頭痛動物的報(bào)道中，也選取了陽陵泉穴。在本研究中率谷和陽陵泉都為足少陽膽經(jīng)穴，率谷靠近偏頭痛發(fā)作部位，起近治作用，陽陵泉位于遠(yuǎn)端，起遠(yuǎn)治作用，兩穴合用對慢性偏頭痛大鼠有較好的治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針刺組與非經(jīng)非穴組之間的足底機(jī)械痛閾具有顯著的差異，可見針刺少陽經(jīng)穴對于緩解慢性偏頭痛大鼠痛覺過敏具有明顯優(yōu)勢，可顯著提高大鼠的痛閾。然而，2組在趨化因子表達(dá)結(jié)果上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從數(shù)據(jù)結(jié)果可見，針刺組對CCL2和CXCL1的下調(diào)作用優(yōu)于非經(jīng)非穴組，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可以擴(kuò)大樣本量，使得此趨向更加明顯。

趨化因子是一類結(jié)構(gòu)相似的小分子分泌蛋白，參與了細(xì)胞遷移、增殖、炎癥等生理和病理過程[26]。已有臨床研究表明，偏頭痛患者血清中CCL2表達(dá)升高[27]。在動物研究中也發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞上CCL2的過表達(dá)會引起大鼠的熱痛覺過敏[28]。CXCL1屬于CXC趨化因子家族，CXCL1可以參與中性粒細(xì)胞的趨化和脫顆粒，并介導(dǎo)炎癥性疼痛，爪底直接注射CXCL1可誘發(fā)機(jī)械性痛覺過敏[29]。也有研究表明CXCL1含量在偏頭痛患者血清中升高[13]。近年來針刺通過趨化因子參與疼痛調(diào)節(jié)的研究受到了廣泛的關(guān)注，研究表明，針刺可通過調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)和募集免疫細(xì)胞釋放阿片肽類物質(zhì)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[30]。有研究表明，針灸可以抑制CCL2的表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)的激活而減輕神經(jīng)病理性疼痛[31]。在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，針刺可以調(diào)控脊髓部位CXCL1發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[32]。在本研究中，NTG組大鼠的趨化因子水平明顯升高，與以上研究中的結(jié)果一致；針刺降低了Sp5C中趨化因子CCL2和CXCL1的表達(dá)水平，表明了針刺少陽經(jīng)穴可以通過抑制趨化因子從而發(fā)揮對慢性偏頭痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用。

本實(shí)驗(yàn)研究了針刺對慢性偏頭痛大鼠趨化因子的影響，為針刺治療偏頭痛的分子機(jī)制提供了新線索。近年來研究者們逐漸認(rèn)識到，脊髓中的膠質(zhì)細(xì)胞可以通過釋放強(qiáng)效的趨化因子，介導(dǎo)神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞的相互作用，增強(qiáng)神經(jīng)炎癥，在神經(jīng)性病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中占據(jù)重要地位[33]。最新的研究也指出，趨化因子可能與偏頭痛模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞的激活相關(guān)[14]。目前，膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛研究領(lǐng)域受到極高的關(guān)注，從“趨化因子-膠質(zhì)細(xì)胞”的角度，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)深入探求慢性偏頭痛大鼠趨化因子與膠質(zhì)細(xì)胞活化之間的關(guān)系，進(jìn)一步完善針刺在慢性偏頭痛大鼠抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制中所發(fā)揮的作用。