基于Nrf2/Keap1/HO-1通路的淫羊藿素對(duì)精索靜脈曲張雄性大鼠生精功能的影響

黃雅平 林文東 丁小明

精索靜脈曲張是目前臨床中較為常見(jiàn)的男科疾病，好發(fā)于青壯年，主要指精索內(nèi)靜脈伸長(zhǎng)、擴(kuò)張、迂曲。有調(diào)查結(jié)果顯示，精索靜脈曲張的臨床發(fā)病率10%～15%，其主要發(fā)病部位為左側(cè)，約30%以上男性不育癥由精索靜脈曲張誘發(fā)[1]。研究表明，精索靜脈曲張是目前臨床中導(dǎo)致患者出現(xiàn)附睪及睪丸功能障礙的主要因素，并可能誘發(fā)患者出現(xiàn)生精功能異常[2]。依照傳統(tǒng)中醫(yī)理論，精索靜脈曲張性不育癥患者常采用補(bǔ)腎祛瘀法進(jìn)行治療，精索靜脈曲張致不育癥主要與腎虛血瘀關(guān)系密切，導(dǎo)致患者出現(xiàn)腎精虧虛、營(yíng)氣不從[3]。淫羊藿是目前廣泛應(yīng)用的補(bǔ)腎藥，其應(yīng)用歷史悠久，又稱為仙靈脾，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有明確的抗腫瘤、抗衰老作用。淫羊藿能有效促進(jìn)睪丸分泌睪酮，在促進(jìn)小鼠精囊及附睪發(fā)育中發(fā)揮重要作用，具有明確的性激素樣效應(yīng)，可作為治療精索靜脈曲張的潛在藥物[4]。本研究通過(guò)構(gòu)建雄性大鼠精索靜脈曲張動(dòng)物模型，并對(duì)該模型進(jìn)行研究，分析基于Nrf2/Keap1/HO-1通路淫羊藿素對(duì)精索靜脈曲張雄性大鼠生精功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選擇青春期SPF級(jí)雄性大鼠60只作為研究對(duì)象，大鼠體重（170±10）g，6周齡，所有大鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于泉州醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校屏障系統(tǒng)動(dòng)物房，許可證號(hào)SYXK（閩）2016-0001。所有大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、淫羊藿素低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。按實(shí)驗(yàn)要求先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。飲食飲水一切按要求正常給予。

1.2 造模方法

本研究中模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、淫羊藿素低劑量組、中劑量組、高劑量組均構(gòu)建精索靜脈曲張大鼠模型，采用左腎靜脈部分結(jié)扎法構(gòu)建模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，隨后于下腹部正中切開(kāi)皮膚，打開(kāi)腹腔，充分暴露精索內(nèi)靜脈、左側(cè)腎靜脈、下腔靜脈及腎上腺靜脈。將大鼠腎上腺靜脈內(nèi)側(cè)部分左腎靜脈段和左側(cè)精索靜脈仔細(xì)游離并使用4-0絲線穿過(guò)并備用，使用0.65 mm光滑金屬桿與該段左腎靜脈上平行結(jié)扎，結(jié)扎完成后小心拔出金屬桿，復(fù)通靜脈構(gòu)建左腎靜脈狹窄模型，后分離并結(jié)扎左髂總靜脈與精索內(nèi)靜脈間交通支，后關(guān)腹縫合切口?？瞻讓?duì)照組使用假手術(shù)方案處理，參照模型組進(jìn)行分離靜脈但不做結(jié)扎處理，其他操作同模型組。術(shù)后6周麻醉大鼠，再次開(kāi)腹觀察大鼠精索內(nèi)靜脈及雙腎狀態(tài)，較右側(cè)精索內(nèi)靜脈左側(cè)明顯擴(kuò)張迂曲且左腎無(wú)萎縮。模型制備不成功大鼠則清除出實(shí)驗(yàn)，最終模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、淫羊藿素低劑量組、中劑量組、高劑量組每組入組8只大鼠。所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開(kāi)始給藥治療。

1.3 干預(yù)方法

空白對(duì)照組、模型組按實(shí)驗(yàn)方案灌胃（2 ml/d），低劑量組、中劑量組、高劑量組分別淫羊藿素灌胃75 mg/kg、100 mg/kg和125 mg/kg，淫羊藿素為淺黃色粉末，購(gòu)自西安小草植物科技有限公司，陽(yáng)性對(duì)照組采用邁之靈片（德國(guó)禮達(dá)大藥廠，注冊(cè)證號(hào)ZJ20140002）54 mg/kg灌胃治療，各組大鼠每日灌胃干預(yù)一次，持續(xù)給藥干預(yù)8周后再進(jìn)行后續(xù)操作。

1.4 觀察指標(biāo)

各組均給藥8周后處死大鼠，摘取大鼠左側(cè)睪丸、附睪，稱重并計(jì)算臟器指數(shù)，檢測(cè)精子濃度、總活率、前向運(yùn)動(dòng)精子、精子頭側(cè)擺幅度（ALH）、精子曲線速度（VCL）、精子直線速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）；檢測(cè)左側(cè)附睪生精細(xì)胞凋亡情況，大鼠睪丸組織超氧化物酶歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH-X）及丙二醛（MDA）水平，Western Blot檢測(cè)睪丸組織中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測(cè)睪丸組織中Nrf2、Keap1和HO-1的mRNA表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示行方差檢驗(yàn)分析，利用LSD-t檢驗(yàn)分析兩組間計(jì)量資料差異，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左側(cè)睪丸及附睪指數(shù)

陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠睪丸指數(shù)及附睪指數(shù)明顯高于模型組（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組和淫羊藿素低、中、高三組睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 6組大鼠左側(cè)睪丸及附睪指數(shù)比較(mg/g,±s)

表1 6組大鼠左側(cè)睪丸及附睪指數(shù)比較(mg/g,±s)

組別 只數(shù) 睪丸指數(shù) 附睪指數(shù)空白對(duì)照組 10 3.86±0.21 1.51±0.11模型組 8 3.02±0.12 1.08±0.07陽(yáng)性對(duì)照組 8 3.74±0.17 1.40±0.05低劑量組 8 3.61±0.15 1.31±0.08中劑量組 8 3.73±0.09 1.42±0.06高劑量組 8 3.76±0.13 1.41±0.07

2.2 精子活動(dòng)度

陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠精子濃度、總活率、前向運(yùn)動(dòng)精子、ALH、VCL、VSL及VAP明顯高于模型組（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠精子濃度、總活率、前向運(yùn)動(dòng)精子、ALH、VCL、VSL及VAP比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低劑量組大鼠精子濃度、總活率、前向運(yùn)動(dòng)精子、ALH、VCL、VSL及VAP略低于陽(yáng)性對(duì)照組、中劑量組、高劑量組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 6組大鼠精子活動(dòng)度比較(±s)

表2 6組大鼠精子活動(dòng)度比較(±s)

組別 只數(shù) 精子濃度(M/ml)總活率(%)前向運(yùn)動(dòng)精子(%)VSL(mm/s)VCL(mm/s)VAP(mm/s)ALH(mm/s)空白對(duì)照組 10 81.74±4.59 70.84±5.02 52.38±4.58 29.64±1.03 49.54±3.92 40.65±2.38 2.31±0.34模型組 8 54.39±4.11 45.74±4.57 20.12±5.01 10.31±2.01 27.43±3.84 17.21±3.12 1.23±0.29陽(yáng)性對(duì)照組 8 66.49±3.98 62.38±4.88 40.84±4.43 26.48±1.88 42.48±2.19 36.73±2.99 2.08±0.27低劑量組 8 61.92±5.02 58.34±5.12 38.49±5.12 23.31±1.73 39.28±2.99 34.01±2.74 1.93±0.30中劑量組 8 67.39±4.38 61.21±4.92 41.21±5.03 25.49±1.69 41.99±3.01 36.04±3.41 2.03±0.33高劑量組 8 68.41±4.47 62.19±4.79 42.19±5.47 26.03±1.64 42.84±2.74 37.03±2.55 2.17±0.28

2.3 左側(cè)附睪生精細(xì)胞凋亡情況

陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠附睪生精細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠附睪生精細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 6組大鼠左側(cè)附睪生精細(xì)胞凋亡情況比較(±s)

表3 6組大鼠左側(cè)附睪生精細(xì)胞凋亡情況比較(±s)

組別 只數(shù) 附睪生精細(xì)胞凋亡指數(shù)空白對(duì)照組 10 1.54±0.32模型組 8 12.47±1.02陽(yáng)性對(duì)照組 8 2.70±0.28低劑量組 8 3.28±0.19中劑量組 8 2.74±0.24高劑量組 8 2.56±0.21

2.4 睪丸組織指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠SOD、LDH-X明顯高于模型組，MDA明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠SOD、LDH-X、MDA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 6組大鼠睪丸組織指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果(U/L,±s)

表4 6組大鼠睪丸組織指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果(U/L,±s)

組別 只數(shù) LDH-X SOD MDA空白對(duì)照組 10 75.85±4.39 96.04±5.43 7.84±1.29模型組 8 43.92±3.99 63.29±7.65 19.68±4.30陽(yáng)性對(duì)照組 8 67.48±5.01 90.09±4.95 8.79±3.88低劑量組 8 65.37±4.38 87.94±5.01 9.32±4.19中劑量組 8 67.01±4.25 89.99±4.83 8.92±4.27高劑量組 8 68.74±3.49 91.32±4.94 8.57±3.94

2.5 Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白顯著高于模型組（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 6組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果(±s)

表5 6組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果(±s)

組別 只數(shù) Nrf2/β-actin Keap1/β-actin HO-1/β-actin空白對(duì)照組 10 0.67±0.09 0.65±0.08 0.78±0.06模型組 8 0.20±0.04 0.24±0.03 0.31±0.04陽(yáng)性對(duì)照組 8 0.61±0.10 0.63±0.09 0.71±0.05低劑量組 8 0.55±0.07 0.56±0.08 0.66±0.08中劑量組 8 0.59±0.08 0.60±0.09 0.70±0.06高劑量組 8 0.62±0.06 0.64±0.07 0.72±0.07

2.6 Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA明顯高于模型組（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表6。

表6 6組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果(±s)

表6 6組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果(±s)

組別 只數(shù) Nrf2/β-actin Keap1/β-actin HO-1/β-actin空白對(duì)照組 10 0.56±0.04 0.67±0.08 0.78±0.12模型組 8 0.21±0.06 0.28±0.05 0.36±0.07陽(yáng)性對(duì)照組 8 0.53±0.04 0.58±0.06 0.66±0.10低劑量組 8 0.46±0.03 0.50±0.07 0.61±0.11中劑量組 8 0.51±0.05 0.57±0.07 0.65±0.12高劑量組 8 0.55±0.04 0.61±0.10 0.71±0.13

3 討論

精索靜脈曲張是目前臨床中導(dǎo)致男性出現(xiàn)不育癥的重要病因，且WHO最新數(shù)據(jù)顯示其已成為導(dǎo)致男性不育的主要誘因[5]。有學(xué)者提出的一種構(gòu)建方案是縮窄大鼠左側(cè)精索靜脈匯入左腎靜脈處，是目前成功率高的動(dòng)物模型，在基礎(chǔ)研究中得以廣泛應(yīng)用，為男性不育癥的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[6]。還有學(xué)者[7-8]指出，利用縮窄大鼠左側(cè)精索靜脈匯入左腎靜脈處的方案進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，左側(cè)附睪組織出現(xiàn)較明顯病變狀態(tài)，精子數(shù)量明顯減少，且排列紊亂。而且大部分生理細(xì)胞內(nèi)還存在空泡情況，消融和固縮現(xiàn)象等，出現(xiàn)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，如細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體消失，同樣的情況還在生精細(xì)胞中出現(xiàn)。結(jié)果表明采用縮窄大鼠左側(cè)精索靜脈匯入左腎靜脈處的方案可造成大鼠附睪組織損傷，因此本研究擬選擇該模型進(jìn)行后續(xù)研究。

淫羊藿是目前廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)壯陽(yáng)補(bǔ)腎中藥，也是目前生殖內(nèi)分泌疾病的中醫(yī)中藥治療中常用藥物[9]。淫羊藿具有補(bǔ)腰膝、益精氣、堅(jiān)筋骨、強(qiáng)心力功效，并具有較強(qiáng)的抗氧化作用。研究表明，采用生精素片等含淫羊藿中藥制劑治療137例精索靜脈曲張誘發(fā)的生精功能異常患者，患者治療一年半內(nèi)受孕率達(dá)60%以上[10]。研究表明，幼年小鼠采用淫羊藿干預(yù)會(huì)顯著調(diào)節(jié)其生殖內(nèi)分泌功能，有效促進(jìn)幼年小鼠附睪及精囊的發(fā)育[11]。利用淫羊藿干預(yù)可有效調(diào)節(jié)大鼠睪丸內(nèi)睪酮合成及分泌，改善睪丸生精功能，并具有明確的性激素樣效應(yīng)，也成為目前治療男性不育的新選擇。精索靜脈曲張的發(fā)病和發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，研究認(rèn)為其主要與氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、炎癥等有關(guān)，其中生精細(xì)胞凋亡是目前公認(rèn)的導(dǎo)致男性不育的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[12]。

陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)、精子濃度、總活率、前向運(yùn)動(dòng)精子、ALH、VCL、VSL、VAP及SOD、LDH-X明顯高于模型組，生精細(xì)胞凋亡指數(shù)、MDA明顯低于模型組。進(jìn)一步分析各組大鼠組織Nrf2/Keap1/HO-1通路研究結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白及mRNA明顯高于模型組。邁之靈片是目前臨床常用的治療精索靜脈曲張的藥物之一，其具有增加靜脈回流，降低血管通透性，增加血管彈性和張力，減輕靜脈淤血癥狀和抗氧自由基的作用，因此本研究選擇該藥物作為陽(yáng)性對(duì)照藥，用于評(píng)估淫羊藿素的臨床應(yīng)用潛在價(jià)值。低、中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組各指標(biāo)無(wú)明顯差異，表明淫羊藿素具有較高的改善精索靜脈曲張雄性大鼠生精功能療效。分析認(rèn)為，Nrf2在細(xì)胞可與胞質(zhì)內(nèi)特異性受體Keap1結(jié)合，并失去活性[13]。HO-1體內(nèi)可催化血紅素生成CO、鐵及膽紅素，也是重要的調(diào)控基因[14]。

綜上所述，采用淫羊藿素治療精索靜脈曲張，可能通過(guò)調(diào)控Nrf2/Keap1/HO-1通路有效調(diào)節(jié)雄性大鼠生精功能。