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    UGT2B28、FABP5、CYP2C9基因在脂肪酸代謝異常所致大鼠肝纖維化發(fā)生中的作用

    2022-10-15 04:13:30宋敬茹武超曹紅燕謝咚王錚劉璐王丹孫明瑜邊艷琴
    肝臟 2022年9期
    關(guān)鍵詞:基因芯片差異基因造模

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    二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)誘發(fā)的肝纖維化大鼠模型已成為研究肝纖維化及肝硬化的經(jīng)典動物模型[1,2]。研究證實,肝星狀細(xì)胞活化后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞外膠原沉積增多[3]。前期研究采用全基因芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù),發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝異常是DMN誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生的另一重要原因[2]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,對生物信息分析結(jié)果深入挖掘,以期闡明脂肪酸代謝異常引起大鼠肝纖維化發(fā)生的重要機制。

    資料與方法

    一、實驗動物與材料

    (一)動物 Wistar大鼠,雄性,體質(zhì)量(200±15)g,清潔級,購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心。動物合格證:SCXK(滬)2008-0003。于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行飼養(yǎng)、造模及觀察,自由飲食。

    (二)試劑及儀器 甲醛、甲醇、中性樹膠、二甲苯、無水乙醇等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DMN購自和光純藥工業(yè)株式會社;石蠟購自德國Leica公司;天狼猩紅購自美國Sigma公司;基因檢測及分析所需試劑及儀器設(shè)備均由上海生物芯片公司提供。

    二、實驗方法

    (一)造模方法 參照Ala-Kokko方法造模[4]。模型組大鼠以10 mg/kg劑量于每周前3天連續(xù)腹腔注射0.5% 的DMN溶液(以0.9% NaCl稀釋),持續(xù)共4周,對照組大鼠腹腔注射等量的0.9% NaCl。分別在造模2周末、4周末殺鼠取材評估組織病理變化。

    (二)樣品的采集與處理 在實驗2周末和4周末,采用3%戊巴比妥鈉,以2 ml/kg劑量腹腔注射麻醉后,打開腹腔,經(jīng)下腔靜脈采血。待血液抽凈后,摘取肝臟,然后選取肝臟最厚一葉作為目標(biāo)組織,切取1.0 cm×1.0 cm肝組織2塊,4%甲醛固定,剩余肝組織EP管中-80℃保存?zhèn)溆?。組織標(biāo)本經(jīng)過脫水、包埋、切片處理后,進(jìn)行HE和天狼猩紅染色[5],觀察組織病理學(xué)變化。采集血液4℃靜置3 h后, 以3000 r/min離心15 min,分離血清,-80℃保存?zhèn)溆?。ALT、AST、TC和FFA檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行。

    (三)肝組織基因芯片雜交實驗 采用Trizol試劑盒提取總RNA→純化→合成cDNA→純化,參照BioArray(TM)HighYield(TM)RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒方法合成cRNA→將cRNA片段雜交于Afymetrix Rat2302.0芯片→洗脫→染色→掃描芯片。基因芯片:Afymetrix Rat2302.0基因表達(dá)譜芯片,共載基因探針31099個。

    (四)基因芯片的數(shù)據(jù)處理、差異基因篩選和生物信息分析 基因芯片的數(shù)據(jù)處理、差異基因篩選和生物信息分析參照文獻(xiàn)[6]。利用R語言進(jìn)行通路富集分析,利用 Cytoscape 3. 8. 0繪制差異基因參與的脂代謝信號網(wǎng)絡(luò)圖。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、各組大鼠肝組織病理變化

    HE染色結(jié)果提示,與對照組比較,造模2周時,肝組織內(nèi)可見大量炎細(xì)胞彌漫分布于肝竇內(nèi),肝臟結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)紊亂;隨著造模時間延長,肝組織開始出現(xiàn)廣泛的肝細(xì)胞壞死、肝小葉結(jié)構(gòu)消失。膠原沉積在中央靜脈和門脈區(qū)并開始向肝竇蔓延是肝纖維化形成的標(biāo)志。天狼猩紅染色結(jié)果示,相較于對照組,造模2周組位于中央靜脈及門脈區(qū)域的結(jié)締組織明顯增多,并向肝竇持續(xù)蔓延,形成不完全間隔,提示肝纖維化形成;造模4周時膠原纖維明顯較2周時增多、增厚、變粗,相鄰的纖維間隔之間彼此連接、并包繞肝小葉形成假小葉,肝臟結(jié)構(gòu)被改變,膠原沉積明顯增多,提示肝纖維化已向肝硬化轉(zhuǎn)變,造模成功。見圖1。

    A、B、C:HE染色×200;D、E、F:天狼猩紅染色×100

    二、各組大鼠肝功能與血脂變化

    隨著造模時間的延長,大鼠血清ALT、AST呈現(xiàn)遞增性上升,TG先升高后降低,F(xiàn)FA含量先降低后升高。如表1所示,與對照組比較,4WDMN組大鼠血清ALT、AST酶活性明顯升高,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);2WDMN組大鼠血清TG升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(考慮是樣本離散度太大);2WDMN組大鼠血清FFA明顯降低,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);4WDMN組大鼠血清TG與FFA含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    三、差異基因分析

    選取差異表達(dá)大于2倍的基因,并比對其中共同存在的差異基因。2WDMN組與對照組比較顯著差異基因數(shù)目共有133個,4WDMN組與對照組比較顯著差異基因共有98個,兩組共同的差異基因共有55個。55個共同差異基因中,上調(diào)的基因有40個,下調(diào)的基因有15個。在上調(diào)基因中,UGT2B28、FABP5為變化最為顯著基因,在2WDMN中變化差異倍數(shù)均大于5倍,UGT2B28同時在4WDMN組中變化差異倍數(shù)也大于5倍;在下調(diào)的基因中,CYP2C9、STAC3、MLC1為變化最為顯著基因,在2WDMN、4WDMN中變化差異倍數(shù)均大于4倍。

    四、共同差異基因參與生物學(xué)功能及信號通路

    分析55個共同差異基因參與調(diào)控的生物學(xué)功能及信號通路,對共享基因功能富集,根據(jù)Pvalue值從高到低排列,結(jié)果顯示共享基因參與的前10條通路,其功能主要涉及蛋白酶結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)合成、脂肪酸代謝等方面,見圖2。其中,參與脂肪酸代謝功能的通路共有5條, CYP2C9、FABP5、UGT2B28參與了脂代謝所有信號通路,見圖3,提示這些基因在DMN誘導(dǎo)脂代謝形成中發(fā)揮重要作用。

    圖2 共享差異基因功能富集分析

    圖3 差異基因參與的脂代謝信號網(wǎng)絡(luò)圖

    討 論

    脂質(zhì)代謝紊亂與肝星狀細(xì)胞激活相關(guān),可促進(jìn)肝纖維的發(fā)生發(fā)展[7,8]。本研究采用全基因芯片技術(shù),發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與脂代謝、炎癥、免疫和血管新生的調(diào)控,可能參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。DNA 的損傷修復(fù)貫穿于肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程,脂肪酸的代謝紊亂在肝纖維化向肝硬化動態(tài)演變的過程中發(fā)揮了重要作用。以脂肪酸合成增加為主的脂代謝紊亂,早于肝臟炎癥反應(yīng),是肝纖維形成的機制之一[9]。

    表1 各組大鼠血清肝功能及血脂變化(±s)

    全基因芯片深入挖掘后,3個基因調(diào)控明顯。在下調(diào)基因中,隨著肝纖維化的加重,CYP2C9逐漸下調(diào)。CYP2C9是細(xì)胞色素P450家族2亞家族的C型成員之一,與藥物代謝以及類固醇、脂肪酸的合成相關(guān)[10,11]。CYP2C9的表達(dá)水平可以反映肝臟的功能,其在慢性肝病患者中較正常人下調(diào)[12]。在肝硬化進(jìn)展之前,CYPS活性被選擇性地改變,肝臟疾病會不同程度地影響CYP亞型的活性[13]。CYP2C9蛋白在肝硬化、肝癌患者中表達(dá)均降低,CYP2C9高表達(dá)的肝癌患者生存率較高[14]。CYP2C9的下調(diào)提示肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中,肝功能的受損程度加重。研究提示在DMN誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中,花生四烯酸代謝紊亂可能促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[5]。

    在上調(diào)基因中,共享差異基因FABP5在2周、4周模型組中明顯上調(diào)大于5倍。FABP5是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸結(jié)合蛋白家族之一,與硬脂酸和亞油酸可以高度親和,參與FAA的攝取、結(jié)合、轉(zhuǎn)運和代謝 ,參與炎癥反應(yīng)和能量代謝[15]。同時與腫瘤的發(fā)生相關(guān),在HCC、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌等顯著上調(diào)[16,17]。研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ABP5在LPS誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用[18]。FABP5在巨噬細(xì)胞中高表達(dá),F(xiàn)ABP5的沉默對LPS誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用,并有利于抗炎反應(yīng),F(xiàn)ABP5-PPARγ信號通路可能促進(jìn)HSC激活[19]。肝纖維的發(fā)生發(fā)展過程中,脂肪酸代謝紊亂發(fā)生在炎癥之前,并可能加重炎癥的發(fā)展。FAPB5在肝纖維發(fā)生的前期主要參與脂肪代謝紊亂,后期主要參與炎癥反應(yīng)。

    在上調(diào)基因中,共享差異基因UGT2B28在2周、4周上調(diào)均大于5倍。UGT2B28是UGT2B亞家族一員,負(fù)責(zé)膽汁酸和性激素的代謝[20]。UGT2B28基因變異與肝癌的發(fā)病年齡、復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡有關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)UGT2B28在肝纖維化形成和發(fā)展的過程中上調(diào),提示UGT2B28可能是肝纖維化加劇的預(yù)測因子之一。

    綜上,肝纖維發(fā)生的早期存在明顯的脂肪代謝紊亂,以基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)整的脂肪酸紊亂,可能是逆轉(zhuǎn)肝纖維化向肝硬化轉(zhuǎn)化的策略,可以為進(jìn)一步評估肝纖維化的療效奠定基礎(chǔ)。

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