萘乙酸在黃瓜中的殘留及膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

許?？?，臧婭磊，李 萌，李 通，周 娟，安 莉，馬婧瑋，宋 鍵，吳緒金*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州 450002；2.鄭州鄭氏化工產(chǎn)品有限公司，河南 鄭州 450002；3.商丘市實(shí)驗(yàn)中學(xué)，河南 商丘 476000)

黃瓜最初生長在熱帶雨林地區(qū)，是一年生蔓生植物[1]。富含纖維素、維生素以及各種礦物質(zhì)，深受人們喜愛，已成為我國重要的蔬菜之一。萘乙酸化學(xué)名稱為1-萘乙酸，英文通用名為Naphthylacetic acid，化學(xué)式是C12H10O2。萘乙酸是一種具有生長素類性質(zhì)的植物生長調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，誘導(dǎo)不定根的形成，促進(jìn)植物的光合作用和新陳代謝，增加坐果率[2]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于萘乙酸的研究主要涉及萘乙酸的合成工藝[3]，對(duì)小鼠的毒性效應(yīng)[4]，對(duì)植物扦插生根的影響[5-6]，增強(qiáng)油菜幼苗的抗逆性[7]，提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[8-12]，在蘋果、柑橘等瓜果中的殘留檢測方法[13-14]。已報(bào)道萘乙酸的檢測方法主要有紫外分光光度法[15]、高效液相色譜法[16]、氣相色譜法[17]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-19]等，此外還出現(xiàn)了一些新型檢測方法，如多壁碳納米管增敏的電化學(xué)傳感器檢測法[20]、雙水相萃取-流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[21]等?？椎卵蟮萚22]研究了以二氯甲烷為萃取溶劑，GPC(Gel Permeation Chromatography)凈化，高效液相色譜分離，二極管陣列檢測器測定水稻植株及土壤中萘乙酸的檢測方法。牟艷莉等[23]報(bào)道了2%甲酸的乙腈溶液為提取劑，Poly-Sery MAX混合型陰離子交換固相萃取柱凈化后，采用Phenomenex Gemini-NX 5uC18110A柱進(jìn)行分離，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測萘乙酸在橙中的殘留量。胡曉科等[24]報(bào)道了萘乙酸在黃瓜、番茄中經(jīng)QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)前處理，乙腈-二氯甲烷(1：1)提取，分散固相萃取法凈化，超高效液相色譜法進(jìn)行檢測。José A.等[25]優(yōu)化了熒光分光光度法，在測定草莓樹漿果和柑橘類水果中的萘乙酸時(shí)，無需事先分離，更加快速、準(zhǔn)確。

在黃瓜生長期間施用萘乙酸，有利于植株的生長發(fā)育，提高黃瓜產(chǎn)量。但關(guān)于萘乙酸在黃瓜中的殘留分析和膳食攝入評(píng)估報(bào)道卻很少。本試驗(yàn)采用QuEChERS前處理方法，HPLC-MS /MS對(duì)黃瓜中萘乙酸進(jìn)行檢測，開展萘乙酸在黃瓜中的殘留對(duì)國人攝入風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，為萘乙酸在黃瓜上的科學(xué)合理使用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試農(nóng)藥：10%吲哚丁酸·萘乙酸可溶液劑。

供試作物黃瓜，品種：內(nèi)蒙古呼和浩特為德爾2012；遼寧遼陽為80-5；山西太原為17-8；天津?qū)氎鏋榻騼?yōu)35號(hào)；山東濟(jì)南為津春四號(hào)；河南鄭州為黑優(yōu)301；河北邢臺(tái)為馳譽(yù)鳳凰；上海松江為瑞新黑亮王；安徽合肥為中農(nóng)2號(hào)；湖南長沙為津研7號(hào)；貴州貴陽為環(huán)農(nóng)402；廣西南寧為豐田黃瓜16號(hào)。

1.2 田間試驗(yàn) 試驗(yàn)時(shí)間2019年。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所發(fā)布的《農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)區(qū)域指南》[26]選擇試驗(yàn)地點(diǎn)，分別為內(nèi)蒙古呼和浩特市、遼寧省遼陽市、山西省太原市、天津市、山東省濟(jì)南市、河南省鄭州市、河北省邢臺(tái)市、上海市、安徽省合肥市、湖南省長沙市、貴州省貴陽市和廣西省南寧市。按照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[27]要求設(shè)置處理區(qū)和空白對(duì)照區(qū)，小區(qū)面積≥50m2，小區(qū)間設(shè)置隔離帶。按照有效成分用量為10mg/kg，于黃瓜3～4葉期和初花期各噴霧施藥1次，末次施藥后3和5d采集黃瓜樣品。

樣本采集和制備：按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的采樣時(shí)間要求，每次在每個(gè)小區(qū)黃瓜植株的不同部位至少采集12個(gè)黃瓜樣品。每個(gè)小區(qū)均采集2個(gè)平行樣品。將切碎后黃瓜樣品充分混和均勻，各取2份150g樣品，用干冰粉碎機(jī)把黃瓜樣品粉碎，分別裝入樣品容器中，貼好標(biāo)簽，-20 ℃保存，待測。

1.3 檢測方法

1.3.1 試劑和儀器設(shè)備 純度為96.9%的萘乙酸標(biāo)準(zhǔn)品；色譜純的乙腈和甲醇；色譜純的甲酸和乙酸銨；分析純的氯化鈉和無水硫酸鎂；ODS C18。

SCIEX QTRAP 4 500 高效液相色譜儀三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；SQP電子天平(d=0.01g)、BS 224 S電子天平(d=0.1mg)；微乳劑 204E；Milli-Q Synthesis超純水機(jī)；多管渦旋振蕩器VX-Ⅲ；多管渦旋混合器UMV-2；L-550臺(tái)式低速離心機(jī)；迷你離心機(jī)MLX-210；變速攪拌打碎機(jī)R10V.V。

1.3.2 溶液配制 精確稱取0.010 2g的萘乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇定容制成1 000mg/L的母液，甲醇作為稀釋溶劑，稀釋配制系列純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液5、2、1、0.5、0.2、0.1mg/L。按照1.3.4的操作步驟，得到黃瓜空白基質(zhì)溶液作為稀釋溶劑，配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01mg/L。

1.3.3 檢測條件 液相色譜柱：島津 Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0mm ×75mm，1.6μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：2μL；流動(dòng)相梯度洗脫條件(表1)。電離方式：ESI-；離子源溫度：500℃；霧化電壓：5500V；霧化氣體類型：空氣；霧化氣體壓力：50psi；碰撞氣體類型：氮?dú)?；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式下萘乙酸保留時(shí)間是4.33min，定性離子對(duì)是185/141m/z，定量離子對(duì)為185/141m/z，碰撞電壓是14eV。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.3.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱取20.00g試驗(yàn)樣品于50mL離心管中，加入10mL純水，20mL乙腈，5g氯化鈉，渦旋震蕩提取20min，再4 000r/min離心10min，取1.5mL上清液裝入含有0.03g無水硫酸鎂和0.03gC18的2mL離心管中。渦旋1min，1 0000r/min離心5min，取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，待測。

1.3.5 方法有效性評(píng)價(jià) 將1.3.2配置好的黃瓜空白基質(zhì)梯度萘乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，評(píng)價(jià)線性相關(guān)性及基質(zhì)效應(yīng)。通過在空白黃瓜樣品中分別加入0.01、0.1、1mg/kg萘乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度均設(shè)置5個(gè)平行，分別計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，用于評(píng)價(jià)正確度以及精密度。以最低添加濃度作為定量限。

1.4 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 以國家衛(wèi)生行政部門發(fā)布的中國居民營養(yǎng)與健康狀況監(jiān)測調(diào)查為依據(jù)，結(jié)合萘乙酸殘留化學(xué)評(píng)估推薦的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值、已制定的萘乙酸最大殘留限量(maximum residue limits，MRLs)和急性參考劑量(acute reference dose，ARfD)，計(jì)算萘乙酸的國家估算每日攝入量(national estimated daily intake，NEDI)、每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)、國家估計(jì)短期攝入量(national estimated short term intake，NESTI)以及占急性參考劑量的百分比(ARfD%)，計(jì)算公式見參考文獻(xiàn)[28-33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法有效性評(píng)價(jià)

2.1.1 線性相關(guān)性及定量限 將萘乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇逐級(jí)稀釋制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.5mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度(mg/L)—峰面積(A)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果(表2)，決定系數(shù)R2=1.000 0，萘乙酸在0.01～0.5mg/L范圍內(nèi)在基質(zhì)中呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以添加回收試驗(yàn)中最小添加濃度為定量限，萘乙酸在黃瓜中的定量限為0.01mg/kg。

表2 萘乙酸的回歸方程、決定系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)和定量限

2.1.2 基質(zhì)效應(yīng) 按照以下公式計(jì)算萘乙酸在黃瓜中的基質(zhì)效應(yīng)。

公式1

式中，微乳劑為基質(zhì)效應(yīng)；X基質(zhì)為基質(zhì)標(biāo)樣斜率；X溶劑為溶劑標(biāo)樣斜率

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)純?nèi)軇┡c基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率進(jìn)行比較，若基質(zhì)效應(yīng)的絕對(duì)值≥20%，則采用基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，絕對(duì)值<20%，則采用純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按公式1計(jì)算出基質(zhì)效應(yīng)微乳劑=3.9%，微乳劑<±20%，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱，因此本試驗(yàn)樣品檢測采用純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 添加回收試驗(yàn) 當(dāng)添加水平為0.01、0.1和1mg/kg時(shí)，黃瓜中萘乙酸的平均回收率分別為99%、112%和104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.7%、4.9%和6.5%。方法正確度和精密度均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求。

2.2 最終殘留試驗(yàn) 結(jié)果表明(表3)，采收間隔期為3d時(shí)，黃瓜中萘乙酸的平均殘留量均<0.01mg/kg；采收間隔期為5d時(shí)，黃瓜中萘乙酸的平均殘留量均<0.01mg/kg。目前GB 2763-2021規(guī)定黃瓜中萘乙酸的最大殘留限量值為0.1mg/kg[34]。本試驗(yàn)中不同采收間隔的黃瓜樣品中萘乙酸殘留量均低于我國制定的限量標(biāo)準(zhǔn)。

表3 萘乙酸在12個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)黃瓜中最終殘留

2.3 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 結(jié)合萘乙酸在黃瓜中的最終殘留量，運(yùn)用膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型進(jìn)行萘乙酸在黃瓜上的急性膳食攝入和長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[37]。目前，萘乙酸在我國水稻、小麥等20種作物上已登記。根據(jù)中國健康與營養(yǎng)調(diào)查總結(jié)報(bào)告數(shù)據(jù)，將所有登記作物進(jìn)行膳食分類[38]。萘乙酸ADI值是0.01mg/(kg·bw)，我國居民的平均體重為63kg。計(jì)算結(jié)果(表4和表5)，黃瓜中萘乙酸的國家估計(jì)短期攝入量是0.012 7mg/(kg·bw)，占急性參考劑量百分比是12.7%，萘乙酸使用后不存在急性膳食風(fēng)險(xiǎn)；普通人群萘乙酸的國家估算每日攝入量是0.053mg，占日允許攝入量的0.6%左右，結(jié)果表明對(duì)一般人群健康不會(huì)產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。

表4 萘乙酸急性膳食攝入評(píng)估計(jì)算表

表5 萘乙酸長期膳食攝入評(píng)估計(jì)算表

3 討論與結(jié)論

本研究建立了采用QuEChERS方法進(jìn)行前處理、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜中萘乙酸殘留量的分析方法。該方法打破了傳統(tǒng)的高效液相色譜法檢測器種類少等檢測樣品的局限性，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測中，可以同時(shí)有效應(yīng)用在多種植物生長調(diào)節(jié)劑在不同果蔬中的殘留檢測。前處理方法是檢測農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中殘留的關(guān)鍵步驟，QuEChERS方法作為一種創(chuàng)新型樣品前處理技術(shù)，具有操作簡便，快速，成本低和安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，此外QuEChERS方法也在應(yīng)用中不斷優(yōu)化改進(jìn)應(yīng)用在不同果蔬中的農(nóng)藥殘留檢測[35-36]。在添加水平為0.01～1mg/kg時(shí)，萘乙酸在黃瓜中的平均添加回收率為99%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～6.5%，具有良好的線性關(guān)系，回收率較好，精密度高，可適用于黃瓜中萘乙酸殘留的定量分析。

萘乙酸在12地黃瓜樣品中的殘留量均<0.01mg/kg，對(duì)黃瓜中萘乙酸的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明：10%吲哚丁酸·萘乙酸可溶液劑按照本研究的施藥劑量、施藥次數(shù)和采收間隔使用，黃瓜中萘乙酸的殘留量對(duì)我國一般人群健康不會(huì)產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。