改良 ALPPS 大鼠模型安全性及有效性的評(píng)價(jià)研究

孫光輝，曹 峻，陳少科，馬 嵋，悟拉木·艾力，周成明

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1兒內(nèi)科；2肝臟 腹腔鏡外科；3運(yùn)營管理部；4外科手術(shù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830054)

肝切除術(shù)是治療肝臟良、惡性腫瘤的最主要方法[1]。確保功能足夠的剩余肝臟體積(Future liver remnant，F(xiàn)LR)是完成腫瘤根治性切除的前提，F(xiàn)LR不足所致肝功能衰竭是肝切除術(shù)后致命的并發(fā)癥[2]。有效促進(jìn)FLR增生的方法是目前研究的熱點(diǎn)。門靜脈分支結(jié)扎(Portal vein ligation，PVL)和選擇性門靜脈栓塞(Portal vein embolization，PVE)可促進(jìn)肝再生，若FLR增長不足或較長的等待間歇期腫瘤進(jìn)展會(huì)造成二期根治性手術(shù)無法進(jìn)行[3-4]。聯(lián)合肝臟分隔和門靜脈結(jié)扎的二步肝切除術(shù)(Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS)可在短期內(nèi)快速刺激FLR增長65%～95%，顯著提高腫瘤根治性切除率[5]。最新研究表明ALPPS具有高達(dá)44%的圍術(shù)期并發(fā)癥發(fā)生率及8.8%的術(shù)后90 d內(nèi)死亡率[6-7]。提高ALPPS的安全性、降低圍術(shù)期并發(fā)癥及死亡率，是目前亟待解決的問題。近年來一些改良ALPPS術(shù)式出現(xiàn)，包括射頻消融輔助肝實(shí)質(zhì)分隔聯(lián)合門靜脈結(jié)扎的二步肝切除術(shù)(Radiofrequency-assisted liver partition with portal vein ligation，RALPP)[8]及繞肝帶捆綁肝實(shí)質(zhì)聯(lián)合門靜脈結(jié)扎的二步肝切除術(shù)(Associating liver tourniquet and portal ligation for staged hepatectomy，ALTPS)[9]，限于開展病例數(shù)較少，其療效及安全性尚不完全明確。目前鮮有關(guān)于改良ALPPS模型的基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)研究。本研究通過建立能夠模擬臨床實(shí)踐過程的大鼠ALPPS及改良ALPPS模型，比較不同時(shí)間點(diǎn)FLR增生率及肝功能情況，評(píng)價(jià)相應(yīng)模型的安全性及有效性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥LDRF-120 s型多極射頻消融儀，射頻消融(Radio frequency ablation, RFA)電極針(綿陽立德電子技術(shù)有限公司)，xMarkTM型酶標(biāo)儀(德國Bio-Rad公司)，門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(南京建成有限公司，批號(hào)C010-2-1)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(南京建成有限公司，批號(hào)C009-2-1)，白蛋白試劑盒(南京建成有限公司，批號(hào)A028-2-1)，血清總膽紅素試劑盒(南京建成有限公司，批號(hào)C019-1-1)，大鼠白介素6 ELISA試劑盒(聯(lián)科生物有限公司,批號(hào) 70-EK306/3)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用清潔級(jí) Spargue-Dawley(SD) 健康雄性大鼠70只，體重 (275±25)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫23℃，自由飲食飲水，人工設(shè)置12 h光照/12 h黑暗交替。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.3動(dòng)物分組與手術(shù)方法隨機(jī)選取10只SD大鼠測量術(shù)前體重(IW)及右中葉質(zhì)量(W1)作為參考，其余60只隨機(jī)分為RALPP組、ALTPS組和ALPPS組，每組20只。ALPPS組：給予2%戊巴比妥鈉20 mg/kg體重腹腔麻醉后腹部備皮，后取仰臥位，固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的多功能手術(shù)操作臺(tái)上，為避免腹腔麻醉過深導(dǎo)致大鼠死亡，適當(dāng)減少腹腔麻醉藥物使用量，同時(shí)為減輕大鼠疼痛并保證手術(shù)順利進(jìn)行，聯(lián)合小動(dòng)物專用氣體麻醉機(jī)(參數(shù)設(shè)置氧流量0.2 L/min)給予持續(xù)異氟烷(揮發(fā)參數(shù)2.5)吸入麻醉，消毒鋪巾，取腹正中切口，上至劍突，下達(dá)雙后肢水平的腹部平面，用自制的腹部拉鉤牽開腹壁并固定，分離肝周粘連及韌帶，仔細(xì)解剖肝門，用8-0 尼龍線選擇性結(jié)扎或縫扎大鼠門靜脈右葉支、尾葉支及左支，保留右中葉門靜脈支(右中葉作為預(yù)留增生肝葉)(圖1A)，后沿著缺血線離斷肝實(shí)質(zhì)，肝實(shí)質(zhì)的離斷采用顯微鉗鉗夾，微電凝止血或縫扎止血(圖1B)。RALPP組門靜脈分支結(jié)扎同ALPPS組，后沿著缺血線行RFA燒灼出1條“無血帶”(圖1C)。ALTPS組門靜脈分支結(jié)扎同ALPPS組，后用5-0 尼龍線沿著缺血線縫合捆扎(圖1D)。術(shù)后24 h、48 h、72 h、7 d大鼠麻醉后分別采集腹主動(dòng)脈血和肝臟標(biāo)本。收集腹主動(dòng)脈血離心后血清-80℃保存?zhèn)溆?。切取整個(gè)肝臟組織，用電子天平稱取右中葉及余各肝葉重量，后將標(biāo)本分為2份，一份切成小塊后置入凍存管-80℃保存，另一份置入福爾馬林固定液中固定，石蠟包埋。

1.4指標(biāo)的測定

1.4.1 術(shù)前大鼠肝臟右中葉質(zhì)量占比及死亡率的測定 術(shù)前隨機(jī)選取10只大鼠麻醉后處死，測量大鼠體重(IW)及肝臟右中葉質(zhì)量(W1)，計(jì)算評(píng)價(jià)W1及體重占比W1/IW×100%。記錄各組大鼠手術(shù)前后的死亡情況，計(jì)算死亡率。

1.4.2 大鼠右中葉肝再生率(Hepatic regeneration rate，HRR)的測定 測定3組大鼠肝臟質(zhì)量，計(jì)算HRR值，HRR=(WA-W1)/W1×100%，式中WA為大鼠術(shù)后處死時(shí)肝臟右中葉質(zhì)量，W1為大鼠術(shù)前肝臟右中葉質(zhì)量。

1.4.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測 用酶標(biāo)儀測定3組大鼠血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、血清白蛋白(Alb)、總膽紅素(TBil)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平。

2 結(jié)果

2.1術(shù)前大鼠肝臟右中葉平均質(zhì)量值及其體重占比術(shù)前10只正常大鼠平均W1為2.06 g，體重占比為0.79%。

2.23組大鼠術(shù)后死亡率的比較ALPPS組大鼠圍手術(shù)期死亡4只，均發(fā)生在術(shù)后48 h內(nèi)，尸體解剖顯示3例死于腹腔出血，1例死于膽漏感染，RALPP組和ALTPS組大鼠術(shù)后均存活。與ALPPS組比較，RALPP組和ALTPS組圍手術(shù)期死亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.33組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝臟右中葉質(zhì)量和HRR的比較ALPPS組、RALPP組和ALTPS組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝臟右中葉質(zhì)量和HRR均增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.43組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清指標(biāo)的比較ALPPS組、RALPP組及ALTPS組術(shù)后24、48、72 h血清AST及ALT 水平增高，術(shù)后24 h達(dá)高峰，后逐漸降低，第 7 d 恢復(fù)至正常水平，三組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清AST及ALT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、3。與ALPPS組相比，RALPP組、ALTPS組術(shù)后24、 48 h血清Alb 水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后72 h ALTPS組血清Alb 水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后第7 d三組血清Alb 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。三組術(shù)后血清 TBil 水平在各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異(P>0.05)，見表5。

表3 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清ALT水平的比較

表4 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清Alb水平的比較

表5 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清TBil水平的比較

2.53組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6含量測定三組術(shù)后24、48、72 h及7 d血清中IL-6含量均升高，72 h含量達(dá)到最高峰，后均逐漸下降，三組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清中IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

表6 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6含量

3 討論

ALPPS由德國學(xué)者 Hans Schlitt于2007年在一次肝門部膽管癌手術(shù)中首次應(yīng)用并取得良好效果[10]。ALPPS可在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)FLR顯著增生，然而其 9 d內(nèi)病死率為9%，包括死亡在內(nèi)的嚴(yán)重并發(fā)癥(Clavien Dindo分級(jí)≥Ⅵ級(jí))發(fā)生率為27%[11]。部分研究證實(shí)大鼠ALPPS模型較假手術(shù)組可明顯促進(jìn)肝再生[12-13]。本研究中改良ALPPS動(dòng)物模型的建立可為評(píng)估其加速肝臟再生的有效性及安全性提供良好的基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，和ALLPS相比，RALPP及ALPTS在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)可以達(dá)到促進(jìn)FLR增生的相似效果，且術(shù)后7 d三組HRR均高達(dá)90%以上。IL-6被認(rèn)為在肝臟啟動(dòng)過程中有重要作用，本研究中三組IL-6水平均升高，和既往研究結(jié)果相吻合[14]。IL-6由Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生，參與了肝再生細(xì)胞因子途徑的啟動(dòng)階段，促進(jìn)肝細(xì)胞從G0期轉(zhuǎn)變?yōu)镚1期。本研究及結(jié)合國內(nèi)外研究[15]，目前考慮FLR再生的可能機(jī)制包括：(1)患側(cè)門靜脈結(jié)扎后，預(yù)留肝臟門靜脈血流量迅速增加，同時(shí)肝臟分隔、缺血線肝臟RFA或缺血線肝臟縫扎均有效阻斷了肝實(shí)質(zhì)間的交通支，破壞了肝左、右中葉之間的血流再分布，富含營養(yǎng)物質(zhì)的門靜脈血完全供給FLR，致其血流負(fù)荷明顯增加，促進(jìn)了肝再生；(2)患側(cè)門靜脈結(jié)扎導(dǎo)致患側(cè)肝臟缺血損傷，而肝實(shí)質(zhì)離斷、RFA或捆扎均可引起手術(shù)創(chuàng)傷，引發(fā)IL-6等大量細(xì)胞因子及炎癥因子釋放，加速肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，從而加速 FLR再生。

本研究發(fā)現(xiàn)三組大鼠術(shù)后血清AST及ALT 水平均增高，考慮和門靜脈分支結(jié)扎側(cè)肝臟缺血、門靜脈保留支過多灌注致高靜脈壓力及肝缺血面分隔或RFA或捆扎導(dǎo)致的肝細(xì)胞受損有關(guān)。同時(shí)本研究顯示RALPP組、ALTPS組術(shù)后第24 h、48 h血清Alb 水平較ALPPS組高(P<0.05)，考慮和ALPPS劈肝過程中出血量相對(duì)較多及劈肝手術(shù)創(chuàng)傷大有關(guān)。

本研究在建立模型過程中，RALPP組及ALTPS組無大鼠死亡，而ALPPS組4只大鼠48 h內(nèi)死亡，經(jīng)尸體解剖發(fā)現(xiàn)，大鼠死亡考慮和術(shù)后腹腔出血及膽漏繼發(fā)感染相關(guān)，提示RALPP及ALTPS圍手術(shù)期安全性較好。為提高建立模型的成功率，本研究總結(jié)操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)如下：(1)麻醉：腹腔麻醉避免過深導(dǎo)致大鼠死亡；(2)切口選擇：劍突下正中切口，以方便操作為宜，避免過大，用濕紗布覆蓋腸管避免過度暴露增加腹腔感染風(fēng)險(xiǎn)；(3)門靜脈分支結(jié)扎：尾狀葉門靜脈支較短，位置深且部分管壁位于肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，難以游離，為避免損傷及出血，推開相應(yīng)的肝動(dòng)脈及膽道支后可用8-0尼龍線縫扎，對(duì)于門靜脈右支及左支，如難以結(jié)扎，均可推開相應(yīng)的肝動(dòng)脈支及膽道支后用8-0尼龍線縫扎；(4)劈肝：在缺血線稍偏左側(cè)1mm用電刀標(biāo)記作為劈肝平面，為減少出血，到達(dá)肝靜脈匯入下腔靜脈處不必過分強(qiáng)調(diào)血管顯露，肝斷面劈開后檢查有無膽漏并給與相應(yīng)處理，肝斷面適當(dāng)給予止血材料覆蓋(術(shù)后肝葉稱重時(shí)去除止血材料)。

本研究成功建立改良ALPPS大鼠模型。和ALLPS相比，RALPP 和ALTPS 可以達(dá)到促進(jìn)FLR增生的相似效果且圍手術(shù)期死亡率更低，適于臨床研究推廣。鑒于大鼠和人體存在較大的解剖差異，ALLPS、RALPP 和 ALTPS模型存在一定的局限性，但相應(yīng)模型的建立可進(jìn)一步為其加速剩余肝臟增生的機(jī)制研究提供良好的基礎(chǔ)。