兩種H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 試劑盒的敏感性和特異性評(píng)價(jià)

馮肖肖，趙靈燕，劉 霞，黃 靖，陳偉良，董建斐，張 璐，徐 輝

（浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310000）

2013 年我國(guó)首次報(bào)告人H7N9 流感病例[1-3]。2017 年初我國(guó)首次檢測(cè)到對(duì)家禽呈高致病力的H7N9 流感病毒，其傳播力強(qiáng)、致死率高，給國(guó)內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[4-9]。2017 年秋季我國(guó)開(kāi)始實(shí)施家禽H5 和H7 亞型流感全面免疫政策，有效防控了H7N9 流感的傳播與流行。家禽H7N9 流感強(qiáng)制免疫效果和病原污染狀況日常監(jiān)測(cè)是H7N9 流感防控的重要工作內(nèi)容[10-11]。目前，H7N9 流感日常監(jiān)測(cè)和防控普遍采用商品化熒光RT-PCR 試劑盒。而市場(chǎng)上商品化的H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒種類眾多，不同試劑盒的陰陽(yáng)性臨界點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)不同，導(dǎo)致臨床檢測(cè)結(jié)果存在較大差異。因此，本研究選擇兩種H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，對(duì)50 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用TG-ROC 方法分析其敏感性和特異性，并用Kappa 一致性檢驗(yàn)評(píng)估檢測(cè)結(jié)果的一致性，綜合評(píng)價(jià)其檢測(cè)性能，為H7N9 流感病毒檢測(cè)試劑盒的選擇和應(yīng)用提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品

浙江省在2016—2017 年日常監(jiān)測(cè)中檢出50份疑似H7N9 流感核酸陽(yáng)性樣品，已通過(guò)官方報(bào)備并送國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室通過(guò)雞胚病毒分離鑒定，確認(rèn)其中11 份為H7N9 流感病毒陽(yáng)性，其余39 份為陰性。

1.2 主要儀器與試劑

兩種H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自A、B 兩家生物科技有限公司，分別標(biāo)記為A、B 試劑盒。A 和B 兩種試劑盒提供的臨界點(diǎn)判定值分別為43 和30。

Roche480 熒光定量PCR 儀、MagNA Pure 96全自動(dòng)核酸提取儀，均購(gòu)自Roche 公司。

1.3 熒光RT-PCR 檢測(cè)

按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品核酸，分別用A、B 兩種試劑盒進(jìn)行H7N9 流感病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果判定依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)分析兩種熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，并以雞胚病毒分離鑒定結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，采用TG-ROC 分析方法篩選熒光RT-PCR最適Ct 值（閾值），以2×2 列聯(lián)表分析兩種檢測(cè)試劑盒的敏感性和特異性。敏感性=真陽(yáng)性數(shù)/（真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù)）×100%；特異性=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù)）×100%。對(duì)檢測(cè)結(jié)果用Kappa 一致性檢驗(yàn)評(píng)估其一致性，綜合評(píng)價(jià)兩種試劑盒的檢測(cè)性能。其中，Kappa ＜0.2 說(shuō)明一致性較差，0.2～0.4 說(shuō)明一致性一般，0.4～0.6 說(shuō)明一致性中等，0.6～0.8 說(shuō)明一致性較強(qiáng)，0.8～1.0 說(shuō)明一致性很強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸檢測(cè)

采用兩種H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒分別對(duì)50 份拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒提供的臨界點(diǎn)判定閾值。結(jié)果（表1、2）顯示：A試劑盒檢出27 份陽(yáng)性、23 份陰性，以雞胚病毒分離鑒定結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，則A 試劑盒的敏感性和特異性分別為90.9%（10/11）和56.4%（22/39），敏感性高，但特異性低；B 試劑盒共檢出8 份陽(yáng)性，其余42 份為陰性，以雞胚病毒分離鑒定結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，則B 試劑盒的敏感性和特異性分別為54.5%（6/11）和94.9%（37/39），特異性高，但敏感性低。

表1 A 試劑盒與病毒分離鑒定法的檢測(cè)結(jié)果比較 單位：份

表2 B 試劑盒與病毒分離鑒定法的檢測(cè)結(jié)果比較 單位：份

2.2 一致性比較

Kappa 一致性檢驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示：兩種檢測(cè)試劑盒的Kappa 值為0.28，一致性一般，說(shuō)明A 和B 兩種熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒對(duì)H7N9 流感病毒的檢測(cè)結(jié)果差異較大。

表3 兩種熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果比較 單位：份

2.3 TG-ROC 分析曲線

敏感性和特異性相等時(shí)所對(duì)應(yīng)的Ct 值為最佳閾值，這個(gè)點(diǎn)恰好是敏感性和特異性曲線的交點(diǎn)[12-14]。TG-ROC 分析曲線（圖1）顯示：A試劑盒閾值為33，對(duì)應(yīng)的敏感性和特異性分別為90.91%和92.31%；B 試劑盒閾值為37，對(duì)應(yīng)的敏感性和特異性分別為81.82%和87.18%。

圖1 兩種試劑盒TG-ROC 分析曲線

2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)重設(shè)后檢測(cè)

A 試劑盒原定的判定標(biāo)準(zhǔn)（Ct）為43，該閾值下的敏感性達(dá)到最高，但特異性較差。若將判定標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整至33～35，其敏感性不變，但特異性大大提高。因此，根據(jù)TG-ROC 分析曲線，重新設(shè)定A 試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)為33。調(diào)整后的檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，與“金標(biāo)準(zhǔn)”相對(duì)比，A 試劑盒的敏感性和特異性分別為90.91%（10/11）和92.31%（36/39），均達(dá)到90%以上，與調(diào)整前相比，敏感性不變，但特異性提高了35.91 百分點(diǎn)。

表4 A 試劑盒調(diào)整判定標(biāo)準(zhǔn)后的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 單位：份

B 試劑盒原定的判定標(biāo)準(zhǔn)（Ct）為30，該閾值下的特異性較高，但敏感性較差。若將臨界點(diǎn)調(diào)整至36～37，不僅特異性保持較好，且敏感性大大提高。因此，根據(jù)TG-ROC 分析曲線，重新設(shè)定B 試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)為37。調(diào)整后檢測(cè)結(jié)果（表5）顯示，與“金標(biāo)準(zhǔn)”相對(duì)比，B 試劑盒的敏感性和特異性分別為81.82%（9/11）和87.18%（34/39），均在80%以上。與調(diào)整前相比，特異性雖然下降7.72 百分點(diǎn)，但敏感性提高了27.32 百分點(diǎn)。

表5 B 試劑盒調(diào)整判定標(biāo)準(zhǔn)后的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 單位：份

2.5 判定標(biāo)準(zhǔn)重設(shè)后檢測(cè)結(jié)果一致性

調(diào)整判定標(biāo)準(zhǔn)后兩種試劑盒檢測(cè)一致性比較結(jié)果（表6）顯示，兩種檢測(cè)試劑盒的Kappa 值為0.85，一致性很強(qiáng)，說(shuō)明兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。

表6 兩種試劑盒調(diào)整判定標(biāo)準(zhǔn)后檢測(cè)結(jié)果一致性比較 單位：份

3 討論

高致病性H7N9 流感是我國(guó)重點(diǎn)防控的人獸共患傳染病之一[2-3，5]。H7N9 流感病毒屬于RNA病毒，極易發(fā)生基因突變和重組，因此病原變異監(jiān)視是防控高致病性禽流感的重要工作。目前，熒光RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)是H7N9 流感病原檢測(cè)的常用方法之一[10，15]，可實(shí)時(shí)、快速地監(jiān)視其分布和流行情況，在高致病性禽流感防控監(jiān)測(cè)工作中得到廣泛應(yīng)用。不同廠家的H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)不同，導(dǎo)致其最終檢測(cè)結(jié)果也不一致。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)不同監(jiān)測(cè)目的和要求，選擇不同敏感性和特異性的試劑盒。ROC曲線，也稱受試者工作特征曲線，最初運(yùn)用在軍事上，1971 年被推廣到醫(yī)學(xué)界后得到廣泛應(yīng)用，主要用于診斷試驗(yàn)的綜合評(píng)價(jià)[12-13]。1995 年德國(guó)學(xué)者首次對(duì)ROC 曲線進(jìn)行改進(jìn)，并提出TG-ROC 分析方法，也稱雙圖受試者工作特征曲線[12]。通過(guò)計(jì)算診斷試劑每個(gè)閾值對(duì)應(yīng)的敏感性和特異性，以閾值為橫坐標(biāo)，敏感性和特異性為縱坐標(biāo)，在同一個(gè)坐標(biāo)系上繪制敏感性曲線和特異性曲線雙圖，其交點(diǎn)即為最佳閾值。TG-ROC 分析方法不僅可直觀地反映敏感性和特異性對(duì)閾值的影響，也可估計(jì)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度，還可以根據(jù)實(shí)際情況，選取最佳閾值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，使試驗(yàn)的敏感性和特異性達(dá)到實(shí)際要求，以獲得檢測(cè)試驗(yàn)的最大準(zhǔn)確度，因而常用來(lái)評(píng)價(jià)檢測(cè)試驗(yàn)的可靠性，具有臨床指導(dǎo)意義[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)廠家的H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒的判定閾值不同，因而其敏感性和特異性也各不相同，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不一致。在實(shí)際應(yīng)用中兩種試劑盒各有利弊：A 試劑盒敏感性較高，可以有效檢測(cè)病原，降低漏檢對(duì)防控造成的不利影響，但其特異性低，誤診率較高，實(shí)際應(yīng)用中會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性較多，導(dǎo)致因疫情誤判而加大防控成本；而B(niǎo) 試劑盒特異性較高，可降低誤診引起的經(jīng)濟(jì)損失，但其敏感性低，難以有效檢測(cè)禽群中存在的H7N9 流感病毒，實(shí)際應(yīng)用中會(huì)導(dǎo)致假陰性較多，漏檢率較高，可能造成防控漏洞而增加疫情發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，在臨床應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)不同需求和檢測(cè)目的選擇合適的試劑盒。

診斷試驗(yàn)中，恰當(dāng)?shù)呐卸ㄩ撝悼商岣咴\斷的真實(shí)性，提高疫病防控能力，還可以防范漏檢、誤診帶來(lái)的危害。TG-ROC 分析結(jié)果顯示，在原定閾值下，A、B 兩種試劑盒只能滿足敏感性高或特異性高之一的特性，而不能同時(shí)達(dá)到最佳敏感性和特異性要求，不利于實(shí)際應(yīng)用和選擇。A、B 兩個(gè)試劑盒的判定閾值偏低或偏高，致使假陽(yáng)性或假陰性偏多，容易造成誤判或漏檢，不僅會(huì)加大診斷處理成本或疫情風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)降低診斷試劑的綜合性能。通過(guò)TG-ROC 分析法計(jì)算診斷試劑的最佳閾值并重新調(diào)整后，A 試劑盒的敏感性和特異性同時(shí)達(dá)到90%以上，B 試劑盒能同時(shí)達(dá)到80%以上，且兩者檢測(cè)結(jié)果的一致性明顯增強(qiáng)。這表明，判定閾值會(huì)影響診斷試驗(yàn)的可靠性和真實(shí)性。采用TG-ROC分析方法，選擇適當(dāng)?shù)呐卸ㄩ撝?，可以提高檢測(cè)試劑的敏感性和特異性，增加檢測(cè)結(jié)果的可靠性和真實(shí)性，減少漏診和誤診帶來(lái)的問(wèn)題，從而幫助采取科學(xué)的疫病防控措施。

綜上所述，不同廠家試劑盒的檢測(cè)結(jié)果存在差異，實(shí)際應(yīng)用中不同監(jiān)測(cè)目的要求的試劑盒敏感性和特異性也不同，因此可以應(yīng)用TG-ROC 分析方法，選定檢測(cè)試劑盒的陰陽(yáng)性臨界點(diǎn)，重新調(diào)整試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)，提高檢測(cè)方法在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的指導(dǎo)性。本試驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)有限，今后還需進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究。