凝集素在甲殼類動(dòng)物免疫學(xué)方面的研究進(jìn)展

封永輝，郭曉萌，邱 亮，董 宣

（1.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071）

甲殼類動(dòng)物作為無脊椎動(dòng)物中一員，不具備脊椎動(dòng)物獲得性免疫相關(guān)的B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞，但進(jìn)化形成了完善抵御致病性生物的先天性免疫系統(tǒng)[1]，包括由幾丁質(zhì)體表外殼、呼吸器官和消化器官組成的物理防御，血細(xì)胞組成的細(xì)胞免疫以及由各種免疫因子組成的體液免疫[2-3]。參與體液免疫的許多成分都存儲(chǔ)在血淋巴細(xì)胞中。甲殼類動(dòng)物的體液免疫必須依賴血淋巴細(xì)胞參與，啟動(dòng)依賴宿主模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）來識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）[4-5]。

凝集素作為識(shí)別PAMPs 的重要成員，在甲殼類動(dòng)物細(xì)胞免疫識(shí)別病原過程中發(fā)揮巨大作用[6]。通過甲殼類動(dòng)物凝集素的深入研究可以提升對(duì)甲殼類動(dòng)物免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)水平，對(duì)發(fā)展綠色健康漁業(yè)生產(chǎn)具有重要理論和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義，有助于從根本上提升漁業(yè)生產(chǎn)的防病治病水平。本文從凝集素定義、分類和功能等方面，總結(jié)凝集素在甲殼類動(dòng)物免疫學(xué)方面的研究進(jìn)展情況，并對(duì)其中研究較多的兩種重要類型——C 型凝集素（C-type lectins，CTLs）和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域免疫凝集素（fibrinogen-like domain immunolectins，F(xiàn)BGLs）作出總結(jié)。

1 凝集素介紹

1.1 定義

1888 年，俄國Hermann Stillmark 研究蓖麻籽毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)提取物可以凝集血細(xì)胞，并將該提取物命名為蓖麻蛋白（ricin）。1954 年，Boyd 建議使用拉丁文legere（意為選擇）命名，后因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），將其命名為凝集素。凝集素是從各種植物以及無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的一種糖蛋白或結(jié)合糖的模式識(shí)別分子蛋白。1988年，Barondes 等將凝集素進(jìn)一步定義為非酶和抗體的結(jié)合蛋白[7]。凝集素在自然界廣泛存在，植物、動(dòng)物、微生物中都存在多種類型的凝集素。

1.2 分類及功能

根據(jù)物種來源，凝集素被分類為植物凝集素、動(dòng)物凝集素、原生生物凝集素、細(xì)菌凝集素和病毒凝集素。

植物凝集素主要存在于豆科（Legumes）、石蒜科（Amaryllidaceae）、桑科（Moraceae）、覓科（Amaranthaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）、茄科（Solanaceae）、唇形科（Labiatae）、尊麻科（Urticaceae）以及谷類（cereals）等植物中。植物凝集素參與植物體抵御病毒和昆蟲的免疫過程[8]。

1906 年，在牛血清中首次發(fā)現(xiàn)動(dòng)物凝集素。目前根據(jù)其不同結(jié)構(gòu)特征及特異性結(jié)合基序，動(dòng)物凝集素被分為L 型、P 型（配體為甘露糖-6-磷酸鹽）、C 型、F 型、M 型、I 型、R 型、S 型（依賴巰基）凝集素以及幾丁質(zhì)酶樣凝集素（chitinaselike lectins）、半乳糖苷結(jié)合凝集素（galactosidebinding lectins，galectins）、鈣連蛋白（calnexin，CNX）或鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）、內(nèi)凝集素（intelectins）、唾液酸結(jié)合凝集素（siglecs）、纖維膠凝蛋白（ficolins）、F-box 凝集素等[9-10]。動(dòng)物凝集素能識(shí)別病原分子物質(zhì)[11]，并調(diào)節(jié)蛋白折疊和調(diào)控細(xì)胞信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。

細(xì)菌凝集素分為可溶性凝集素、表面凝集素和菌毛凝集素。在功能方面，細(xì)菌凝集素?fù)碛凶R(shí)別作用，與吞噬細(xì)胞結(jié)合可參與調(diào)節(jié)吞噬過程等[12]，也可參與多種生命活動(dòng)，如早期胚胎發(fā)育和先天免疫。根據(jù)分布部位不同，細(xì)菌凝集素發(fā)揮的作用也不相同。一般胞內(nèi)凝集素主要用于合成和分泌蛋白，而在胞外或胞膜上的凝集素則可能有參與病原識(shí)別和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，觸發(fā)一系列免疫反應(yīng)的作用，如引發(fā)免疫系統(tǒng)內(nèi)血淋巴細(xì)胞對(duì)病原的吞噬及消滅作用。常見的細(xì)菌凝集素包括來自革蘭氏陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），來自革蘭氏陽性菌的肽聚糖（peptidoglycans，PGN）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA），來自真菌的甘露聚糖（mannans）、β-1,3-葡聚糖和來自病毒的雙鏈RNA（dsRNA）或糖蛋白[13]。

無脊椎動(dòng)物體內(nèi)普遍存在凝集素[14]，其發(fā)現(xiàn)相對(duì)于植物凝集素要晚，相對(duì)于動(dòng)物凝集素要早，可以追溯到1903 年。有研究[14]提到Noguchi 首次在無脊椎動(dòng)物鱟（Limulus pohyphmus）體液中發(fā)現(xiàn)無脊椎動(dòng)物凝集素，其主要發(fā)揮先天免疫功能。甲殼類動(dòng)物凝集素相對(duì)于貝類動(dòng)物凝集素結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，是一種重要的免疫分子蛋白，在體液免疫中發(fā)揮識(shí)別PAMPs 的作用。甲殼類動(dòng)物凝集素可以同時(shí)參與多項(xiàng)免疫反應(yīng)，如參與病原識(shí)別、結(jié)合、凝集，激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)（prophenoloxidase activating system，proPO）[15]，作為調(diào)理素參與細(xì)胞吞噬等。Vasta 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲、線蟲、海膽、七腮鰻、魚類和兩棲類動(dòng)物中的凝集素主要發(fā)揮先天性免疫功能，在細(xì)胞間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間相互作用，以及在糖蛋白的轉(zhuǎn)移、蛋白折疊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受精和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

目前在甲殼類動(dòng)物中研究發(fā)現(xiàn)的凝集素包括C 型、L型、M 型、CNX 或CRT、甘露糖苷結(jié)合凝集素（mannose-binding lectin，MBL）、galectins、革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白（gram-negative binding proteins，GNBP）、含硫脂蛋白（thioestercontaining proteins）、清道夫受體（scavenger receptors）、絲氨酸蛋白酶同系物、唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子（down syndrome cell adhesion molecule，Dscam）、FBGLs[9-10，17-20]（表1），其中C 型凝集素是甲殼類動(dòng)物凝集素研究中的典型代表。

2 兩種重要甲殼類動(dòng)物凝集素研究概況

2.1 C型凝集素

C型凝集素是最早發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物凝集素之一。1983 年McFaelane 首先發(fā)現(xiàn)肝去唾液酸糖蛋白受體（hepatic asialoglycoprotein receptor，ASGPR）。該受體被鑒定為動(dòng)物C型凝集素。C型凝集素被認(rèn)為是一類配體依賴鈣離子識(shí)別糖類型結(jié)合蛋白，因凝集需要活性鈣離子（Calcium）而得名。它含有一個(gè)或多個(gè)糖類識(shí)別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain，CRD）或C 型凝集素樣結(jié)構(gòu)域（C-type lectin like domain，CTLD），凡是含有與CRD/CTLD 相似的蛋白統(tǒng)稱為C 型凝集素[97]。C 型凝集素超家族包括膠原凝素（collectins）、選擇素（selectins）、胞吞作用受體（endocytic receptors）和蛋白聚糖（proteoglycans）。其主要特征是含有大約幾十到幾百個(gè)氨基酸序列。CRD/CTLD 結(jié)構(gòu)域數(shù)目對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化起了重要作用[9]。C型凝集素大多數(shù)是保守的，只包含1 個(gè)CRD；通過晶體分析揭示，CRD/CTLD 是一個(gè)特殊的壓縮球狀結(jié)構(gòu)。目前研究發(fā)現(xiàn)，C 型凝集素也含有多個(gè)CRD，有的雖然具有CTLD，但不具備糖類結(jié)合能力。C型凝集素種類豐富，目前有1 000 多個(gè)。在脊椎動(dòng)物中，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能將C型凝集素分為Ⅰ—ⅩⅦ共17 組，幾乎在所有的多細(xì)胞生物中都能被發(fā)現(xiàn)[98]。

甲殼類動(dòng)物C型凝集素組織分布具有物種和組織表達(dá)特異性（表1）。多方面研究表明，表達(dá)最豐富的組織是肝胰腺、血細(xì)胞、鰓、胃、腸道、心臟等免疫相關(guān)組織，但在不同病原刺激下，表達(dá)量有很大差異，如在凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）中發(fā)現(xiàn)的LvLT 和斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）中發(fā)現(xiàn)的PmAV 和PmLT，在肝胰腺、血細(xì)胞中表達(dá)量較多[35，44-45]，LvCTL 在胃、腸道中少量表達(dá)；在中國明對(duì)蝦（F.chinensis）中發(fā)現(xiàn)的FcLec 僅表達(dá)于血細(xì)胞[38]，F(xiàn)cLec1、FcLec2[33，39]在 胃、腸道中少量表達(dá)；在克氏原螯蝦（P.clarkii）中提取的PcLec1 在鰓中的表達(dá)水平最高，而在血細(xì)胞中則非常低[63]；日本沼蝦（M.nipponensis）中的MnCTLDcp1 和MnCTLDcp2 在心臟中表達(dá)量最高，而MnCTLDcp3 在肝胰腺中高表達(dá)；羅氏沼蝦（M.rosenbergii）中的MrLec3 在肝胰腺、鰓、胃和腸中表達(dá)量最高，MrCTL 和MrERGIC-53 在血細(xì)胞、肝胰腺、腸道、胃中的表達(dá)量最高[21]。閻德平等[80]對(duì)三疣梭子蟹（P.trituberculatus）C 型凝集素PtCTL5 研究發(fā)現(xiàn)，其在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高，肝胰腺中次之。從不同組織中發(fā)現(xiàn)，C 型凝集素發(fā)揮著不同的功能，如在凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）中，參與了對(duì)蝦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的LvCTLD、LvLec在腦神經(jīng)節(jié)中表達(dá)水平遠(yuǎn)高于在肝胰腺和血細(xì)胞中，分析認(rèn)為其可能在維持腦穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著作用，而LvLec1 和LvLec2 卻在肝胰腺、肌肉、生殖腺、血液和鰓中都能表達(dá)[99]。王敏等[25]對(duì)秀麗白蝦（E.modestus）研究發(fā)現(xiàn)，EmCTL-1 主要在血液中表達(dá)，EmCTL-2 主要在性腺、血液和胸神經(jīng)節(jié)中表達(dá)，而EmCTL-3 和EmCTL-4 則主要在精巢中表達(dá)。中華絨螯蟹（E.sinensis）的EsLecA 主要在精巢和胸神經(jīng)節(jié)中表達(dá)，而EsLecG 則主要在胸神經(jīng)節(jié)中表達(dá)[70]。

表1 甲殼類動(dòng)物凝集素種類及蛋白分子大小

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

研究發(fā)現(xiàn)，甲殼類動(dòng)物C型凝集素除作為PRRs 外，還同時(shí)在免疫反應(yīng)中發(fā)揮多種免疫功能，例如凝集病原微生物（AMP）[100]、抗病毒應(yīng)答[31，35，44]、粘附細(xì)胞[101]、增強(qiáng)調(diào)理、激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)、形成結(jié)節(jié)、參與細(xì)胞吞噬作用和包封作用（encapsulation）[9]等。在凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）中發(fā)現(xiàn)的LvCTLD和在斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）中提取的PmLT 可增強(qiáng)細(xì)胞包被反應(yīng)，而LvCTLD 甚至可激活黑化作用[45，66]。在日本囊對(duì)蝦（M.japonicus）中分離出的MjCTL、凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）中的LvCTL1、斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）中的PmAV，可以抑制病毒繁殖并引發(fā)細(xì)胞病變反應(yīng)，同時(shí)還可參與抗病毒免疫，但研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)白斑綜合征病毒（WSSV）不起作用[53，102]。在墨吉明對(duì)蝦（F.merguiensis）中分離的FmL 可增強(qiáng)抗菌活性[50]。馮錦玲等[23]在研究羅氏沼 蝦（M.rosenbergii）中發(fā)現(xiàn)，MrLec 可以結(jié)合脂多糖和肽聚糖，參與抗病毒和抗菌反應(yīng)。凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）、南美藍(lán)對(duì)蝦（P.stylirostris）、遠(yuǎn)洋梭子蟹（Portunus pelagicus）、中華絨螯蟹（E.sinensis）和擬穴青蟹（S.paramamosain）中的幾種C 型凝集素缺少信號(hào)肽，說明它們可能在胞內(nèi)發(fā)揮作用[36，56，103]。在凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）中共分離出LvCTL1、LvCLT3、LvLec 共3 種C 型凝集素，其中LvCTL1 具有抗病毒功能[31]，而LvCTL3 可顯著降低感染副溶血弧菌和WSSV 引起的死亡率[104]，LvLec 則參與革蘭氏陰性菌的免疫應(yīng)答[99]。中國明對(duì)蝦（F.chinensis）體內(nèi)的FcLectin和Fc-hsL 具有2 個(gè)CRD[38-39]；FcLec3 可與WSSV的衣殼蛋白VP28 結(jié)合，且具有抑制細(xì)菌及真菌的作用[40]。斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）中的PmAV 具有1 個(gè)典型的CRD，顯示出抗病毒活性，但不具備凝集活性[44]；FcLec4 作為調(diào)理素，可促進(jìn)吞噬作用，清除弧菌[41]；Fc-hsL 對(duì)一些細(xì)菌和真菌具有直接滅殺功能[39]。在日本囊對(duì)蝦（M.japonicus）中獲得3個(gè)C型凝集素（MjLecA、MjLecB 和MjLecC），這些凝集素可以結(jié)合囊膜蛋白，阻止WSSV 對(duì)血細(xì)胞的感染，從而降低WSSV 感染率，其中兩種還可以體外降低感染效率[53]。在墨吉明對(duì)蝦（F.merguiensis）中克隆得到1 個(gè)雙CRD 凝集素FmLec，在受到WSSV 刺激后表達(dá)上調(diào)。在克氏原螯蝦中發(fā)現(xiàn)，PcLec-1、PcLec-2、PcLec-3凝集素，可促進(jìn)蝦對(duì)鰻弧菌的清除，還可參與機(jī)體免疫反應(yīng)，抵御細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原體感染[63，105]。

三疣梭子蟹（P.trituberculatus）中也克隆得到一種C 型凝集素[79]。閻德平等[80]在人工感染試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CTL5 具有消除副溶血弧菌和WSSV 兩種病原的作用，且發(fā)揮一定的免疫應(yīng)答功能。Qiu等[69]在體外試驗(yàn)研究擬穴青蟹時(shí)發(fā)現(xiàn)，SpCTL6不能直接殺滅溶藻弧菌，但是能夠明顯降低溶藻弧菌內(nèi)的毒素水平，從而減少因感染溶藻弧菌引起的死亡，提高蟹的成活率。

2.2 FBGLs 凝集素

FBGLs 是一類進(jìn)化上非常保守的模式識(shí)別蛋白，主要包括纖維膠凝蛋白、tachylectins 和纖維蛋白原相關(guān)蛋白（fibrinogen-related proteins）。其主要參與非己識(shí)別和宿主免疫應(yīng)答作用[106]。

在淡水螯蝦（又名信號(hào)克氏原螯蝦、淡水小龍蝦，P.leniusculus）中發(fā)現(xiàn)兩種膠原樣凝集素蛋白，它們不僅可以參與細(xì)菌結(jié)合還對(duì)革蘭氏陰性菌具有清除作用[86]。日本囊對(duì)蝦（M.japonicus）中發(fā)現(xiàn)的MjFREP1 對(duì)革蘭氏陽性菌具有凝集作用，同時(shí)能夠結(jié)合肽聚糖、脂多糖以及WSSV 的VP28 蛋白，在抗細(xì)菌和抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[88]。羅氏沼蝦（M.rosenbergii）的兩種纖維膠凝蛋白以及Dai 等[90]在克氏原螯蝦體內(nèi)鑒定的PcFLP1，均能夠凝集細(xì)菌，增強(qiáng)蝦體對(duì)細(xì)菌的清除能力，在抗弧菌免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3 討論

在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中檢索到的中國明對(duì)蝦（F.chinensis）凝集素?cái)?shù)據(jù)共43 條，其中有已發(fā)表論文支撐的只有10 條，其他數(shù)據(jù)均為軟件預(yù)測的功能結(jié)果，需要進(jìn)一步開展試驗(yàn)研究來挖掘其相關(guān)的功能。

在信號(hào)通路的研究中，針對(duì)甲殼類動(dòng)物雖然也開展了一些工作，如中國明對(duì)蝦（F.chinensis）血細(xì)胞的酚氧化酶原系統(tǒng)包括脫顆粒和酚氧化酶（phenoloxidase，PO）的活性，是通過磷酸激酶C（phosphokinase C，PKC）通路來調(diào)節(jié)的[107]；羅氏沼蝦（M.rosenbergii）血細(xì)胞proPO 系統(tǒng)包括脫顆粒和PO 的活性，是ODN2006 通過PKC、TPK 信號(hào)通路來調(diào)節(jié)，且此過程與磷酸激酶A（phosphokinase A，PKA）信號(hào)通路無關(guān)[107]；凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）中LvCTL4 能通過激活NF-KB，隨信號(hào)通路參與抗菌免疫反應(yīng)[108]，但是否同一物種同時(shí)存在著多條類似脊椎動(dòng)物的信號(hào)途徑，如免疫缺陷同系物（IMD）途徑、JAK/STAT途徑、Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號(hào)途徑，仍缺乏系統(tǒng)性的研究數(shù)據(jù)來證明。從目前的報(bào)道來看，甲殼類動(dòng)物信號(hào)途徑的整體性及調(diào)控機(jī)制還不明確，如在凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）中，已報(bào)道的9 種C 型凝集素如何發(fā)揮免疫學(xué)調(diào)控作用，9 種凝集素是否具有協(xié)同或抑制機(jī)制，這些都需要進(jìn)一步開展相關(guān)試驗(yàn)研究。

甲殼類動(dòng)物凝集素的研究結(jié)果還需進(jìn)一步整合，不同研究在同一物種分離到的凝集素是否是同一種物質(zhì)，還需要進(jìn)一步確認(rèn)。如在羅氏沼蝦（M.rosenbergii）研究中，Snigdha 等[21]、Huang 等[22]發(fā)現(xiàn)的MrCTL，以及Feng 等[23]和Huang 等[24]發(fā)現(xiàn)的MrLec 具有不同的氨基酸數(shù)目和相對(duì)分子質(zhì)量，其是同一種功能物質(zhì)，還是兩種不同的物質(zhì)，需要進(jìn)一步比較確認(rèn)。

4 結(jié)語

目前對(duì)甲殼類動(dòng)物的免疫機(jī)制，主要以經(jīng)濟(jì)品種對(duì)蝦、龍蝦、鰲蝦和蟹等動(dòng)物為研究對(duì)象，取得了很多成果，在一定程度上揭示了甲殼類動(dòng)物尤其是十足目動(dòng)物免疫防御機(jī)制。然而受試驗(yàn)材料及研究手段的限制，甲殼類動(dòng)物的免疫機(jī)制研究仍然滯后于其他無脊椎動(dòng)物，處于相對(duì)初級(jí)階段，對(duì)于病原體致病機(jī)制及蝦蟹先天性免疫防疫機(jī)制的研究仍然具有很大的提升空間。而對(duì)先天性免疫認(rèn)識(shí)水平的提高，可以在促進(jìn)蝦蟹自身的免疫能力方面，為疾病防治提供新的方法，從根本上提升防病治病水平。