斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中IL-10表達(dá)的特點(diǎn)*

趙硯馳， 李化， 李丹， 孔鵬， 張乙進(jìn)， 吳潔玲， 莫大雙， 舒莉萍*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室, 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550004； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)是一種內(nèi)源性細(xì)胞因子、于1989年被發(fā)現(xiàn)，因其能夠抑制輔助性T細(xì)胞1(Th1 cell)的激活并影響促炎性細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNFα)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)及白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)]的活化，被稱為抗炎性細(xì)胞因子，在體液免疫與細(xì)胞免疫中起著重要作用[1-5]。IL-10由樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK cell)、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，與相應(yīng)受體結(jié)合后，導(dǎo)致非受體酪氨酸激酶1(janus kinase 1，JAK1)活化，激活信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通過旁分泌與自分泌作用于樹突狀細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，抑制Th2細(xì)胞發(fā)揮功能，同時(shí)影響過敏反應(yīng)的發(fā)生[6-8]。有研究報(bào)道，IL-10能激活肥大細(xì)胞，并增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞(T-lymphocyte，T cell)、B淋巴細(xì)胞(B-lymphocyte，B cell)和NK細(xì)胞的功能[9-11]；還發(fā)現(xiàn)IL-10抑制抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)激活從而抑制T細(xì)胞發(fā)揮功能，誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[12]；IL-10還可以直接或間接激活NK細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷作用[13]，因此IL-10在腫瘤免疫中有著雙向調(diào)節(jié)作用，IL-10的功能及機(jī)制研究也受到越來越多的關(guān)注。IL-10在妊娠中維持胚胎正常發(fā)育同樣起著重要作用[14]，有研究報(bào)道在正常妊娠過程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞會(huì)分泌IL-10抑制淋巴細(xì)胞的增殖，進(jìn)而使得滋養(yǎng)層細(xì)胞免受淋巴細(xì)胞的殺傷[15]；抑制IL-10的分泌，將會(huì)促進(jìn)Th1細(xì)胞的增高，抑制Th2細(xì)胞的分泌，最終成為導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育的重要原因之一[16]。既往IL-10相關(guān)研究已在小鼠、兔子等動(dòng)物模型中進(jìn)行了探索[17-18]，但因小鼠和兔子具有飼養(yǎng)成本高昂、繁殖周期較長以及胚胎宮內(nèi)發(fā)育等特點(diǎn)，無法清晰直觀且批量高效地探究IL-10在動(dòng)物體內(nèi)的變化情況。斑馬魚作為模式動(dòng)物具有體型小、繁殖能力強(qiáng)、飼養(yǎng)繁殖較容易、體外受精以及所產(chǎn)胚胎透明易于觀察等優(yōu)勢，其基因組又與人類基因高度相似[19-20]；且尚未有報(bào)道斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中IL-10的表達(dá)情況，因此本研究通過同線性分析斑馬魚與人類及小鼠IL-10基因在染色體中的位置，將斑馬魚與不同物種進(jìn)行氨基酸序列同源性比較，探究斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中IL-10的表達(dá)形式，為IL-10相關(guān)疾病研究提供實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 使用野生型斑馬魚(Tüebingen品系)4～72受精后小時(shí) (hourspost-fertilization，hpf)的胚胎，該品系為實(shí)驗(yàn)室自行繁育[合格證號(hào)SYXK(黔)2018-0001]；pCS2+載體(pCS2+vector)載體由本實(shí)驗(yàn)室提供，大腸桿菌(Escherichiacoil，E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化)。

1.1.2主要試劑 2×Taq 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)預(yù)混液劑(北京天根生化)，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit、限制性內(nèi)切酶NotⅠ和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、T4DNA連接酶(T4 DNA ligase)及NucAwayTMSpin Columns(美國ThermoFisher)，T3聚合酶(T3 RNA Polymerase，美國Promega)，Anti-Digoxigenin-AP(德國Roche)，原位雜交染色試劑盒BCIP / NBT(美國Vector Lab)，TRIzol Reagent(美國ambion)。

1.1.3主要儀器 分子雜交箱HL-2000(美國UVP)，梯度PCR儀etc811(北京東勝創(chuàng)新生物)，超微量生物檢測儀nanodrop(美國ThermoFisher)，體視顯微鏡SMZ25(日本尼康)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不同物種IL-10基因同源性分析(synteny analysis)及氨基酸序列同源性分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹 在美國國家生物信息技術(shù)中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中分別查詢IL-10基因在斑馬魚、人類及小鼠染色體中的位置，與Ensemble數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，分別分析人類、斑馬魚、小鼠、大鼠、家兔、雞、袋鼠、牛、黑猩猩、獼猴、紅鰭鲀以及鰱魚的IL-10氨基酸序列，通過多重序列比對(duì)軟件(multiple sequence alignment，DNAMAN)對(duì)氨基酸序列相似性進(jìn)行比對(duì)；使用分子進(jìn)化遺傳分析軟件(molecular evolutionary genetics analysis X，MEGA X)分析系統(tǒng)進(jìn)化樹，以及Neighbor-joining算法進(jìn)行評(píng)估。

1.2.2斑馬魚及胚胎養(yǎng)殖 野生型斑馬魚養(yǎng)殖在室溫(26±2)℃且12 h/12 h照明的循環(huán)水系統(tǒng)中，使用胚胎培養(yǎng)液(0.06 g/L海鹽、0.5 mg/L亞甲基藍(lán))對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3斑馬魚總RNA提取及互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)合成 分別收集3組72 hpf的斑馬魚胚胎90枚(30枚/組)，使用TRIzol試劑對(duì)胚胎樣本進(jìn)行處理，經(jīng)氯分相后使用異丙醇將RNA沉淀，洗滌并晾干后加入無酶水溶解；將上述總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20 ℃保存。

1.2.4地高辛標(biāo)記的IL-10反義信使RNA(messenger RNA，mRNA)探針制備 根據(jù)斑馬魚IL-10基因序列使用Snap Gene軟件設(shè)計(jì)引物：F為CCGGAATTCGGAGACCATTCTGCCAACA(劃線位置表示添加的EcoRⅠ位點(diǎn)及保護(hù)堿基序列)，R為ATAGTTTAGCGGCCGCCATTTCACCATATCCCGCT(劃線位置表示添加的NotⅠ 位點(diǎn)及保護(hù)堿基序列)。使用EcoRⅠ與NotⅠ將pCS2+載體與擴(kuò)增所得IL-10片段進(jìn)行雙酶切，使用T4DNA連接酶將兩者產(chǎn)物進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒pCS2+-IL-10，將重組產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定與測序鑒定，鑒定無誤后將重組質(zhì)粒線性化，使用T3轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄后，純化所得反義mRNA探針，置于-80 ℃凍存。

1.2.5斑馬魚多時(shí)相整胚原位雜交 分別收集4、6 、9 、12、18、24、48及72 hpf的斑馬魚胚胎75枚(25枚/組、3組)，4%多聚甲醛(paraformaldehyde fixative solution，PFA)固定胚胎過夜，使用甲醇梯度脫水于-20 ℃保存；原位雜交第1天時(shí)會(huì)將其中48和72 hpf的胚胎需用蛋白酶K處理；所有時(shí)相胚胎置于分子雜交箱中68 ℃預(yù)雜交4 h，加IL-10反義mRNA探針雜交14 h；第2天檸檬酸鈉(saline sodium citrate，SSC)緩沖液洗滌，加anti-DIG-AP(1 ∶5 000)于4 ℃孵育16 h；第3天用含Tween-20的馬來酸緩沖液(maleic acid buffer-tween，MABT)洗滌后加入新鮮配置的BCIP/NBT染液，避光染色直至陽性雜交信號(hào)出現(xiàn)后立即使用含Tween的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline tween，PBST)洗滌終止染色，4%PFA固定；在體視顯微鏡下觀察IL-10的陽性雜交信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 不同物種間的同源性分析

同源性分析結(jié)果顯示，IL-10基因位于斑馬魚11號(hào)染色體上，其上下游存在5個(gè)基因組序列與人類1號(hào)染色體、小鼠1號(hào)染色體上能找到相對(duì)應(yīng)的同源區(qū)(圖1)；人類、斑馬魚、小鼠、獼猴、牛及家兔等12個(gè)物種IL-10氨基酸序列相似性比對(duì)結(jié)果表明，斑馬魚與人類、小鼠、獼猴、牛和家兔等12個(gè)物種的IL-10氨基酸序列相似度較高(圖2)；使用MEGA X繪制12個(gè)物種的IL-10系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明在斑馬魚IL-10進(jìn)化過程中與哺乳類動(dòng)物具有保守性(圖3)。

圖1 人類、斑馬魚及小鼠染色體中IL-10基因的同源性分析Fig.1 Synteny analysis of IL-10 gene in human, zebrafish, and mouse chromosomes

注：英文字母表示不同氨基酸序列，數(shù)字表示氨基酸序列號(hào)，*表示相同氨基酸序列，.或∶表示不同相似程度的氨基酸序列，-表示該物種與其余物種對(duì)比缺失的氨基酸序列片段。圖2 不同物種中IL-10的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of IL-10 amino acid sequences from multiple species

注：結(jié)點(diǎn)上方數(shù)字為自展值，表示該進(jìn)化分支的可信度。圖3 不同物種間IL-10的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of IL-10 in multiple species

2.2 pCS2+- IL-10重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

氨芐抗性篩選的pCS2+-IL-10重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶雙酶切后，結(jié)果顯示目標(biāo)條帶正確，并將正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，將測序結(jié)果與已知斑馬魚IL-10基因序列比對(duì)，結(jié)果保持一致。見圖4和圖5。

注：M為DNA Marker Ⅲ，泳道1為IL-10 RT-PCR產(chǎn)物，泳道2為 pCS2+- IL-10圖4 pCS2+- IL-10重組質(zhì)粒EcoR Ⅰ與Not Ⅰ雙酶切產(chǎn)物的電泳鑒定Fig.4 Electrophoresis result of pCS2+-IL-10 recombinant plasmid digested with EcoRⅠ and NotⅠ enzyme

注：紅色方框表示所選取限制性內(nèi)切酶及堿基序列，紅色箭頭表示所選取限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；紅色曲線表示胸腺嘧啶，綠色曲線表示腺嘌呤，藍(lán)色曲線表示胞嘧啶，黑色曲線表示鳥嘌呤。圖5 pCS2+-IL-10重組質(zhì)粒的測序結(jié)果Fig.5 Sequencing result of pCS2+- IL-10 recombinant plasmid

2.3 野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中IL-10基因的表達(dá)模式

整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示(圖6)，4～12 hpf時(shí)，野生型斑馬魚胚胎未觀察到IL-10陽性雜交信號(hào)；18 hpf時(shí)，野生型斑馬魚胚胎中后部中間細(xì)胞群(intermediate cell mass，ICM)中觀察到IL-10表達(dá)；24 hpf時(shí)，IL-10在野生型斑馬魚胚胎頭部廣泛表達(dá)，在其心臟及卵黃囊背側(cè)表達(dá)尤為突出；48和72 hpf時(shí)，IL-10集中表達(dá)于野生型斑馬魚胚胎頭部區(qū)域，在眼眶、心臟以及頭部背側(cè)表達(dá)尤為明顯。

注：黑色箭頭表示IL-10表達(dá)最為突出部位。圖6 野生型斑馬魚胚胎發(fā)育不同時(shí)間點(diǎn)IL-10基因的表達(dá)(整胚原位雜交，×80)Fig.6 Expression of IL-10 during embryonic development of wild-type zebrafish at different time(the whole embryo in situ hybridization, ×80)

3 討論

IL-10作為一種具有生物活性的小分子多肽，在免疫系統(tǒng)以及胚胎發(fā)育中都發(fā)揮重要的作用，可以由巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及各種T細(xì)胞亞群(Th1、Th2以及Th17)產(chǎn)生，其也能抑制Th1、Th2和Th17型T細(xì)胞發(fā)揮功能，存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞以及針對(duì)T細(xì)胞的激活[10,21-23]。有研究報(bào)道，妊娠婦女血清中IL-10水平明顯高于正常婦女，并且復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者血清中IL-10水平低于正常婦女[24]；此外，IL-10在體外也能影響多種造血細(xì)胞生長和分化，IL-10缺陷的小鼠生長發(fā)育明顯遲緩于正常小鼠，且伴有貧血以及腸道局部炎癥[25-26]。然而相對(duì)系統(tǒng)的在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中探究IL-10的表達(dá)情況，目前尚未有報(bào)道。

近年來，小鼠、兔子等動(dòng)物已被廣泛用于建立相關(guān)疾病模型，作為研究相關(guān)基因在疾病中機(jī)制與功能的方法，而斑馬魚在基因進(jìn)化上具有高度保守性，使其逐漸成為一種理想的人類疾病研究的動(dòng)物模型，同時(shí)也是研究遺傳與發(fā)育的理想模型[27-28]。伴隨例如成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)與嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino, MO)等技術(shù)的出現(xiàn)，使得多種斑馬魚疾病模型得以成功建立[29]，例如消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)疾病[30]。本研究通過分析斑馬魚胚胎早期發(fā)育中不同時(shí)期IL-10 mRNA的表達(dá)情況，有助于在相關(guān)疾病的斑馬魚模型中更好地探索IL-10的功能和作用。

本研究結(jié)果顯示，斑馬魚IL-10氨基酸序列與人類IL-10氨基酸序列相似度較高，提示斑馬魚IL-10與人類IL-10功能相似，并且在進(jìn)化過程中斑馬魚IL-10具有一定保守性。通過成功構(gòu)建pCS2+-IL-10重組質(zhì)粒，制備地高辛標(biāo)記的IL-10反義mRNA探針，進(jìn)而通過全胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4～12 hpf時(shí)未在斑馬魚胚胎中觀察到IL-10陽性雜交信號(hào)，而18 hpf時(shí)開始，在斑馬魚胚胎ICM區(qū)域觀察到IL-10陽性雜交信號(hào)；24、48及72 hpf時(shí)，IL-10表達(dá)于頭部區(qū)域，在頭部背側(cè)、心臟、眼眶以及卵黃囊背側(cè)部位表達(dá)尤為明顯。由于ICM區(qū)域是斑馬魚胚胎發(fā)育的原始造血發(fā)生重要區(qū)域之一，與哺乳類動(dòng)物胚胎中的卵黃囊相似，其中含有大量原始造血細(xì)胞，而源自于ICM的后部造血島位于尾部腹側(cè)區(qū)，標(biāo)志著原始造血的結(jié)束，此外與斑馬魚胚胎髓系造血發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在16～30 hpf造血前體細(xì)胞中表達(dá)，而斑馬魚血液循環(huán)開始于24 hpf[27,30]。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示IL-10可能與斑馬魚早期胚胎造血發(fā)育有著密切聯(lián)系，在斑馬魚胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析了斑馬魚IL-10氨基酸序列在進(jìn)化過程中具有相對(duì)保守性，并且通過全胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-10的表達(dá)貫穿斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程，提示IL-10可能在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步探索IL-10在相關(guān)疾病中的功能與機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。