反相高效液相色譜法測定牛初乳保健食品中免疫球蛋白G的含量

免疫球蛋白(Ig)按其抗原性不同可分為5類：IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。其中，免疫球蛋白G(IgG)是最主要的免疫因子，并且在人體內(nèi)占總血清免疫球蛋白含量的70%～80%左右。IgG是一種母體給幼崽傳遞特異性免疫力的主要載體，其具有抗原結(jié)合和凝集特性，具有中病原微生物(如病毒)和毒素的作用。其他研究表明，IgG對人體和犢牛的免疫功能有有益影響，如防止腹瀉、促進非特異性免疫、增強細胞免疫功能、體液免疫功能等。因IgG特有的增強免疫功能，近些年，在普通食品的研發(fā)上也受到了關(guān)注，如富含免疫球蛋白的冰淇淋、臻糕、發(fā)酵乳等。而與常乳相比較，牛初乳中IgG等涉及物質(zhì)轉(zhuǎn)運和免疫活性等功能的蛋白質(zhì)表達量更高，且IgG含量高低也作為牛初乳產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的優(yōu)劣評判標(biāo)桿。所以，在保健食品中，以IgG為主要營養(yǎng)成分的產(chǎn)品多以牛初乳為原料。

目前，現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)測定IgG的方法有酶聯(lián)免疫吸附法、瓊脂單向免疫擴散法、分光光度法、高效親和色譜法(HPAC)等。牛初乳保健食品檢測IgG最常見的方法為國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.194—2003，原理基于HPAC，其將IgG親和柱(Pharmacia HI-Trap Protein G柱，1 mL)適配在高效液相色譜上，利用IgG的特異吸附性作用對樣品進行在線檢測。IgG存在多種亞型，如IgG、IgG、IgG、IgG，在牛初乳中富含IgG和IgG。因此，在使用GB/T5009.194—2003檢測時，親和吸附后洗脫解吸附時會造成IgG混合峰型分叉，較大峰寬，前延、拖尾明顯，且無法與其他雜質(zhì)峰分開(圖1)，造成積分困難，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確定量。因此，為了提高結(jié)果精確度，現(xiàn)開發(fā)一種對保健食品中IgG含量測定的高效液相色譜法，以確保牛初乳原料的質(zhì)量控制以及牛初乳保健食品中功效成分含量的精準(zhǔn)測定，為企業(yè)提供檢測依據(jù)，為保健食品品質(zhì)監(jiān)管提供有利技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清IgG標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)，由Sigma提供(貨號：I5506)；牛免疫球蛋白G親和柱3 mL，由美正生物提供(貨號：QC0137)；三氟乙酸(色譜純)，Alfa Aesar提供；乙腈(質(zhì)譜純)，F(xiàn)ishers提供；磷酸鹽緩沖液片劑(PBS)pH=7.2～7.4，Salarbio提供；GHP濾膜(0.22 μm)，Waters公司提供；實驗室用水為Milli-Q超純水；含IgG的保健食品樣品為市場購買和湯臣倍健股份有限公司提供。

U3000高效液相色譜儀(配有紫外檢測器及Chromeleon數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國賽默飛公司；AL204和XP205電子分析天平，梅特勒-托利多公司；CR22GIII高速離心機，日本日立公司。

EMBBO算法包括遷移、突變兩種操作。在迭代過程中，更適合物種生存的棲息地有更大的概率通過遷移操作將信息與其他棲息地共享，使種群進步；突變操作將產(chǎn)生全新的棲息地，幫助算法跳出局部極小。

1.2 方法

1.2.1 IgG提取工藝 相較于國標(biāo)法中直接采用流動相稀釋樣品后分析，本方法認(rèn)為需考察樣品前處理的提取方法，最大化的回收待測成分以滿足檢測方法學(xué)的要求。但牛乳類基質(zhì)中都會含有IgG本底值，無法獲得與牛乳相似的混合性蛋白溶液作為陰性基質(zhì)提取效率的考察對象，故只能選擇使用同一樣品制得的平行樣品，分別比較直接稀釋溶解法(記為0 min)與渦旋振蕩法、超聲法的提取效率。提取溶液選擇pH=7.2～7.4的0.1 mol/L PBS溶液，可保證免疫親合柱抗原、抗體之間較強的作用力和較好的凈化效果。其中振蕩法考察了1、3、5 min的時間節(jié)點(n=3)，而超聲法選擇的時間節(jié)點為5、10、20 min(n=3)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：精密稱取牛血清免疫球蛋白G標(biāo)準(zhǔn)品適量(精確至0.01 mg)，置棕色容量瓶中，用0.1 mol/L PBS溶解并制成每1 mg/mL的IgG儲備溶液，搖勻，即得。標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制備：分別準(zhǔn)確吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加0.1 mol/L PBS將其稀釋成IgG含量分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。臨用時配制,冷藏。

1.2.4 色譜條件 本方法采用的反相高效液相色譜法檢測。色譜柱：沃特世 Symmetry300 C色譜柱(4.6 × 250 mm，5 μm)；流動相：0.1%三氟乙酸-水溶液和乙腈，流動相梯度見表1；紫外檢測波長：280 nm；柱溫30 ℃；進樣體積20 μL。

環(huán)境友好型鉆井液抗鉆屑和水污染實驗結(jié)果見表8(老化條件為90℃、16 h)。不同區(qū)塊的鉆屑對鉆井液性能影響較小，隨著鉆屑量的增加，鉆井液黏度和切力略有增加，20%南堡巖屑污染后較原體系有一定變化，鉆進過程中鉆遇大段泥巖及鉆時較快時，需要及時補充包被劑加量并提高鉆井液抑制能力，通過加入稀釋劑保證良好流變性，少量水侵對鉆井液有較小的稀釋效果，動切力略降，濾失量略增，不會對體系性能產(chǎn)生明顯的影響。

我認(rèn)為，每位教師不只是學(xué)習(xí)業(yè)務(wù)知識，還必須學(xué)習(xí)《教育法》、《教師法》和《未成年人保護法》等法律法規(guī)，并深刻認(rèn)識到不懂法律，否則不依法執(zhí)教就是不合格的教師。例如：要想讓學(xué)生熱愛環(huán)境，保護公共衛(wèi)生，我們必須得先彎下腰，去主動拾起地上的字紙；要想讓學(xué)生學(xué)會文明用語，不用暴力解決問題，我們必須先注意自己的言行，不體罰和打罵學(xué)生。要想讓學(xué)生遵守《中小學(xué)生守則》和《小學(xué)生日常行為規(guī)范》，我們必須先遵守學(xué)校的各項規(guī)章制度，哪怕是排隊打飯不講小話的日常生活問題。

根據(jù)5.1節(jié)的模型和系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置，不考慮安全性概率閾值，模擬運行系統(tǒng)400次，每次運行到系統(tǒng)違背安全屬性或觀測序列的長度大于50為止.在400次運行中系統(tǒng)違背安全屬性64次.通過分析系統(tǒng)每次運行的觀測序列、最大可能執(zhí)行路徑和系統(tǒng)實際執(zhí)行路徑，表3給出IIV算法和PF算法安全性預(yù)測錯誤率和本文提出的反例預(yù)測算法的錯誤率.當(dāng)系統(tǒng)違背安全屬性時，我們的方法能夠給出反例而PF算法不能給出系統(tǒng)反例，在安全攸關(guān)系統(tǒng)中，漏報的危害比誤報要大， 而IIV算法漏報次數(shù)只有PF算法的一半，預(yù)測錯誤率下降了近20%.

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液檢測的峰面積為Y軸、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，進行線性回歸分析，得線性方程和相關(guān)系數(shù)。在檢測檢出限和定量限時，經(jīng)檢測多個乳粉樣本以及保健食品樣品(復(fù)合蛋白粉)都發(fā)現(xiàn)含有少量的IgG本底值，無法采用不含本底的陰性基質(zhì)加標(biāo)的方式精準(zhǔn)地確定本方法的檢出限與定量限。因此，選取與乳粉相似的多蛋白混合豆粉作為陰性基質(zhì)，采用逐步添加IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式來確定檢出限和定量限。

如圖1所示，零重力補償裝置主要由導(dǎo)軌支架、伸桿支撐組件、線性導(dǎo)軌組件、滑車、光電傳感器組件、伸桿和固定支座組成。其中，線性導(dǎo)軌組件包含2根線性導(dǎo)軌，安裝在導(dǎo)軌支架上；滑車連接在伸桿的移動端上，可以帶動伸桿在線性導(dǎo)軌上滑動；4套伸桿支撐組件在伸桿水平展開實驗中用于提供平衡力以補償伸桿的重力影響。

將標(biāo)準(zhǔn)工作液和制備后的樣品，參照儀器條件檢測，將樣品檢測結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照式(1)計算，即得最終含量。

1.3.3 樣品穩(wěn)定性 由于IgG為生物活性物質(zhì)，在分析過程中的前處理操作溫度盡可能低以及減少處理時間才可最大化保持其生物結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的保持直接關(guān)系到在280 nm處的波長吸收效率。為考察樣品24 h內(nèi)的穩(wěn)定性情況，將兩種劑型樣品經(jīng)前處理后，使用封口膜密封并貯存于4 ℃冰箱內(nèi)。在冷藏后，于0、0.5、1、2、4、8、12、24 h等時間點，對樣品分別進行檢測，分析穩(wěn)定性。

1.4 IgG的含量計算

1.3.2 方法回收率和精密度 在研究本方法回收率與精密度時采用的是同一保健品樣品進行含本底值的加標(biāo)實驗。根據(jù)線性范圍以及樣品真實含量情況，制定了3個水平添加濃度，每個濃度取6份平行樣(n=6)，為保證高濃度加標(biāo)樣的測定濃度在線性范圍內(nèi)，將洗脫液最終定容至10 mL。

(1)

式(1)中，為試樣中 IgG的含量(g/100 g)；為試樣中 IgG的質(zhì)量濃度(μg/mL)；為試樣的取樣量(g)；為試樣的定容體積(mL)；為樣液稀釋因子；100、1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的分析

2.1.2 凈化方法的分析 在傳統(tǒng)的IgG工業(yè)純化方法中，因為需要經(jīng)過化學(xué)沉淀、透析、濃縮等多個分離步驟，導(dǎo)致在生產(chǎn)過程中IgG的大量損失，因此本研究采用特異性吸附能力更強的免疫親和柱法作為凈化免疫球蛋白G的方法。Protein G免疫親和柱填料作為強力吸附乳制品或者血液樣品中IgG的手段已經(jīng)被多次報道，并已形成商品化的預(yù)充柱。相比Protein A填料，Protein G填料對牛源IgG結(jié)合能力更強，可作用于全部IgG亞型，并不會作用于其他免疫球蛋白。國標(biāo)GB/T 5009.194—2003中規(guī)定了該種填料的預(yù)充柱作為液相色譜分離過程中的分析柱使用，但是經(jīng)實際樣品檢測過程中發(fā)現(xiàn)，此預(yù)充柱并非適配于絕大多數(shù)液相色譜儀型號，需增加較多串口配件；在適配過程中對于系統(tǒng)壓力的要求較高，常出現(xiàn)超壓漏液等現(xiàn)象，不易控制；分離流動相系統(tǒng)包含了磷酸鹽以及甘氨酸鹽酸鹽，此類洗脫液極易造成液相系統(tǒng)管路內(nèi)產(chǎn)生結(jié)晶、堵塞，不利于儀器維護。本實驗將這種在線分離方式轉(zhuǎn)化成為柱前分離凈化的方式操作。采用含Protein G的固相萃取小柱，將IgG提取溶液預(yù)先通過親和小柱進行吸附與解吸附的處理，最大化地去除在280 nm處與IgG共流出峰的干擾。如圖3所示，a為標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，b、c為2種劑型的牛初乳保健食品樣品經(jīng)前處理提取和凈化后測定的IgG液相色譜圖，待測峰均呈現(xiàn)了良好的分離情況，且峰型尖銳對稱，10 min內(nèi)即可獲得完整的IgG色譜峰。比較圖3中的總分離時間段內(nèi)各色譜圖可發(fā)現(xiàn)，經(jīng)固相萃取柱凈化后的不同劑型樣品色譜圖幾乎均與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖一致，且提高了對IgG的凈化效率?？梢杂兄谟嬎惴椒ǖ幕厥招?，避免親和柱過載時導(dǎo)致的在線分析干擾，優(yōu)化了分離柱上的峰型，使積分準(zhǔn)確。

2.1.1 提取方法和時間的優(yōu)化 如圖2所示，經(jīng)one-way ANOVA統(tǒng)計分析，與直接稀釋溶解相比，振蕩法和超聲提取法均有顯著增強(≤0.05)。但振蕩法的提取效率在1 min后無顯著性增強(≥0.05)，則以1 min為振蕩法的最佳選擇。超聲法結(jié)果均無顯著增高于渦旋振蕩法1 min結(jié)果。則經(jīng)考慮對比實驗時間消耗和樣品含量回收的增幅比例，在相似提取效率的結(jié)果下，渦旋振蕩1 min為此方法樣品前處理的優(yōu)選提取條件。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限的確定 采用峰面積與分析物濃度進行線性回歸計算，得到線性方程為=0.003 4+0.011 4，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。因此，IgG液相分析法在10～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性呈良好關(guān)系。IgG色譜峰信噪比約等于 3 時的濃度作為檢出濃度，為1.0 μg/mL；以及信噪比約于10 時的濃度作為定量濃度，為3.3 μg/mL。則此方法的方法檢出限和定量限分別為0.5、1.7 g/kg。

1.2.3 樣品的前處理 將樣品混合均勻后，精密稱取混勻試樣約0.100 0 g，置50 mL具塞離心管中，用0.1 mol/L PBS定容至刻度，充分振蕩混勻1 min后，8 000 r/min離心5 min，取上清液5 mL過牛免疫球蛋白G親和柱，最終使用洗脫液定容至5 mL，取部分洗脫液過0.22 μm濾膜，得濾液，即可上機。

2.2.3 樣品穩(wěn)定性的評價 將經(jīng)前處理后的2種劑型樣品于4 ℃環(huán)境中冷藏貯存24 h，并監(jiān)測24 h內(nèi)各時間節(jié)點的樣品IgG含量以考察穩(wěn)定性。如表4所示，24 h內(nèi)樣品中IgG的濃度值的精密度為1.04%～1.72%，偏差較小，表明樣品經(jīng)前處理后，24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2 回收率與精密度的驗證 3個濃度樣品經(jīng)檢測結(jié)果計算得，低濃度加標(biāo)回收率為97.5%，中濃度加標(biāo)回收率為92.2%，高濃度加標(biāo)回收率為93.5%,精密度結(jié)果為0.20%～1.18%(表3)。回收率和精密度均符合方法學(xué)驗證要求。

3 市售牛初乳保健食品樣品檢測

共收集市售的經(jīng)保健食品注冊備案的牛初乳保健食品樣品15批，編號為1～15號。其中8號樣品為進口產(chǎn)品，其余均為國產(chǎn)產(chǎn)品，聲稱的功效成分均為“免疫球蛋白G”(其中9號樣品聲稱功效成分為“免疫球蛋白”)。使用本方法和國標(biāo)法(GB/T 5009.194—2003)同時測定這15批樣品，對結(jié)果進行比較，檢測結(jié)果如表5所示。根據(jù)GB 13432規(guī)定，營養(yǎng)成分的實際含量不應(yīng)低于標(biāo)示值的80%，1號樣品2個方法的檢測結(jié)果都低于標(biāo)示值的80%，8號樣品的本方法檢測結(jié)果低于標(biāo)示值的80%，其他產(chǎn)品2個方法的檢測結(jié)果均高于標(biāo)示值的80%。在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，方法空白在國標(biāo)法中會在IgG出峰時間引入雜質(zhì)峰(圖4)，此雜質(zhì)峰相當(dāng)于約5 g/100 g的IgG濃度，則在檢測低IgG含量的樣品檢測時，如6號、8號、10號樣品，無法保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。與本方法的含量結(jié)果對比，國標(biāo)法檢測的8號樣品含量結(jié)果高于標(biāo)示值，可能是雜質(zhì)峰的引入導(dǎo)致，無法用來判斷產(chǎn)品是否合格。

4 結(jié)論

本研究建立了使用反相高效液相色譜法檢測牛初乳保健食品中IgG含量的分析方法。此方法使用了固相免疫親和柱法凈化樣品，提高了對待測物的選擇性，解決了國標(biāo)法檢測時的異常峰型和雜峰干擾，使目標(biāo)物質(zhì)可與其他雜質(zhì)分開分析，峰型尖銳且對稱，保證了精準(zhǔn)的定性和定量。經(jīng)方法學(xué)考察后表示，其在0～100 μg/mL內(nèi)線性范圍良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 6，檢出限和定量限為0.5 g/kg和1.7 g/kg，回收率大于92%，精密度和穩(wěn)定性良好，方法學(xué)結(jié)果均符合分析要求。在對實際樣品考察中，對樣品結(jié)果的判定基本與國標(biāo)一致，并且還避免了國標(biāo)法方法空白中的雜質(zhì)檢出，提高了方法靈敏度。

本方法雖然對儀器設(shè)備要求簡單，分析操作系統(tǒng)簡化，但Protein G固相萃取小柱價格偏高，帶來的實驗分析成本上升的問題，相信在未來可隨著本方法的廣泛應(yīng)用，使價格有所控制回落。而對于高靈敏度、高精準(zhǔn)性的分析方法來說，分析成本的提高不足以阻擋各檢測機構(gòu)以及企業(yè)自身對原料質(zhì)控或成品控制時的使用；因為檢驗機構(gòu)需準(zhǔn)確了解此類高價值功效成分是否符合國家規(guī)定添加量。對于企業(yè)而言，誠信生產(chǎn)的同時最大化地節(jié)省原料成本投入，才可為今后良性地生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)保健食品做好技術(shù)經(jīng)驗與研發(fā)資金的積累。

觀測指標(biāo) 年齡、性別、臨床類型、VAS評分、Lund-Kennedy評分、病程、出現(xiàn)急性感染期頻次、急性感染期持續(xù)時間、是否有反復(fù)上呼吸道感染及次數(shù)、有無慢性中耳炎、有無鼻中隔偏曲、有無吸煙史、有無糖尿病、有無變態(tài)反應(yīng)性鼻炎、有無胃食管返流、引流是否通暢、抗菌藥物使用頻次、抗菌藥物使用時間、血糖、是否聯(lián)合使用抗菌藥物(聯(lián)合使用抗菌藥物是指兩種或兩種以上的抗生素聯(lián)合起來使用)及種數(shù)、血清白蛋白濃度、抗菌藥物使用種數(shù)(指治療過程中先后更換使用抗菌藥物種數(shù))、感染病原菌與耐藥性、是否分離出MDRO等內(nèi)容。