高水分活度中藥制劑處方分析與微生物污染風(fēng)險預(yù)測

李 輝， 馬仕洪， 朱加武， 胡 科， 繩金房， 錢衛(wèi)東， 田 斌*

(1.陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西盛德泰林生物安全技術(shù)檢測有限公司， 陜西 西安 710065； 3.中國食品藥品檢定研究院， 北京 100050； 4.西安海欣制藥有限公司， 陜西 西安 710075； 5.陜西省藥品技術(shù)審評中心， 陜西 西安 710065)

0 引言

水分活度(aw)是影響微生物生長繁殖的關(guān)鍵因素[1]，而高水分活度液體/半固體制劑因其微生物污染風(fēng)險較高而引起普遍關(guān)注.近年來發(fā)生多起高水分活度的制劑的微生物污染事件[2-4]，2021年7月美國FDA發(fā)布公告提醒藥品生產(chǎn)者，洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合體(BCC)可能會對水基非無菌藥品造成污染風(fēng)險[5].國內(nèi)也報道了多起高水分活度液體/半固體制劑的微生物污染和生長繁殖問題[6-12].

為進一步提高藥品質(zhì)量，《中國藥典》2020年版四部對高水分活度的非無菌藥品微生物控制提出了更嚴格的要求，將1107非無菌產(chǎn)品微生物限度標準中的液體制劑和半固體的微生物限度標準要求合并，修訂為“液體及半固體制劑”[13,14].受中藥飲片的微生物污染等因素影響[15,16]，非無菌中藥制劑可能存在一定水平的生物負載，且中藥成分復(fù)雜，常含有糖、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)，而所使用抑菌劑抗菌譜具有局限性，致使高水分活度的中藥液體/半固體制劑更有利于微生物的生長繁殖，因此，高水分活度的中藥液體/半固體制劑是非無菌制劑中微生物污染和增殖風(fēng)險最高的劑型.

研究中藥液體/半固體制劑的水分活度，評估微生物增殖風(fēng)險，探討利用aw、pH、抑菌劑等因素協(xié)同作用進行處方評價和優(yōu)化的方法，對于提升制劑自身抵御微生物增殖風(fēng)險的能力，進而提高中藥制劑的質(zhì)量安全具有現(xiàn)實意義.本文分析5種常見非無菌中藥液體/半固體制劑的水分活度，探討水分活度與處方之間的關(guān)系，并對其最可能的潛在微生物增殖風(fēng)險進行預(yù)測，進而選擇2種高水分活度的中藥制劑采用人工模擬污染的方法對預(yù)測結(jié)果進行驗證，以期利用aw進行非無菌中藥制劑的抑菌劑篩選和微生物控制.

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

測定水分活度所使用的5種劑型的中藥制劑信息見表1所示.

表1 水分活度測定用中藥制劑樣品信息

微生物增殖預(yù)測的驗證實驗采用萸杞滋腎膏(A)和小兒生血糖漿(B)進行.

1.2 實驗儀器

使用的儀器設(shè)備為水分活度測定儀(Aqualab Series 4TEV，METER Group,Inc.USA)，使用前經(jīng)過驗證和校準，采用aw分別為0.500，0.760，0.920，1.000的標準液進行校準，均滿足±0.003 aw的精度要求.

1.3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉均購自中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心(CMCC)，試驗菌株為第3代，洋蔥伯克霍爾德菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，試驗菌株為第4代，均滿足《中國藥典》2020年版中試驗菌株不超過5代的要求.

1.4 實驗方法

依據(jù)《中國藥典》2020年版制劑通則，選擇5種不同劑型的常見中藥液體/半固體制劑，每種劑型選擇3個以上的品種，每個品種收集3個以上批次的樣品.實際獲得的實驗樣品與設(shè)計的理想狀況略有不同.測定前，對所用設(shè)備進行驗證和校準.測定時，在室溫條件下，取均勻的樣品3～5 mL，使樣品鋪滿杯底部且不超過樣品杯容量的1/2，將設(shè)備手柄置于OPEN位置，然后把樣品杯放到樣品倉，蓋上蓋子，并且撥動手柄至READ位置，等待2～5 min，讀數(shù)穩(wěn)定后，記錄設(shè)備屏幕上顯示的aw和溫度.測試完畢后，取出樣品并開始下一份樣品的測試.每份樣品平行測定3次.

選擇未添加抑菌劑的2種中藥制劑A煎膏劑和B糖漿劑，分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、洋蔥伯克霍爾德菌、白色念珠菌、黑曲霉等6種試驗菌，接種后A和B中的含菌量分別為18、25、50、55、98、36 cfu/ml，至A和B中，同時做陰性對照和陽性對照，在21 d中分別于0 h、24 h、48 h、72 h、5 d、8 d、13 d、16 d和21 d分別按照《中國藥典》2020年版四部1105中需氧菌總數(shù)與霉菌及酵母菌總數(shù)的檢測方法在23 ℃培養(yǎng)，計數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 5類中藥液體/半固體制劑的aw分析

5類中藥液體/半固體制劑的aw測定結(jié)果見表2所示，表明5種劑型aw從高到低依次是洗劑、口服液、露劑、糖漿劑、煎膏劑.相同劑型不同品種之間aw差異程度不同，例如煎膏劑蜜煉強力枇杷膏的aw與雪梨膏高0.170， 而洗劑青柏潔身洗液的aw比利夫康洗液高0.012.相同劑型相同品種不同廠家生產(chǎn)的中藥液體制劑存在差異，甚至相同廠家同品種不同批次的中藥液體制劑也存在差異.

表2 中藥液體/半固體制劑的水分活度測定結(jié)果及最大潛在微生物增殖風(fēng)險預(yù)測

續(xù)表2

5種劑型的中藥液體/半固體制劑的aw分析結(jié)果見圖1所示.煎膏劑為半固體制劑，aw遠低于洗劑等其他中藥液體制劑.糖漿劑、露劑、口服液和洗劑的aw較高且分布更集中，對大多數(shù)微生物增殖有利.

圖1 5種劑型的高水分活度中藥制劑的aw分布圖

2.2 5類高aw中藥制劑潛在微生物增殖風(fēng)險分析

中藥制劑的aw越高，微生物污染和增殖的風(fēng)險越高，微生物污染和增殖風(fēng)險由高到低依次為：洗劑>口服液>露劑>糖漿劑>煎膏劑.中藥制劑水分活度差異將會影響潛在污染微生物的種類.根據(jù)不同微生物生長所需aw的規(guī)律[17]，即：當(dāng)制劑aw>0.95，革蘭陰性菌增殖風(fēng)險較高，如大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合體[18]等；制劑aw>0.86，革蘭陽性菌增殖風(fēng)險較高，如金黃色葡萄球菌[19]等；當(dāng)制劑aw>0.75，且制劑含有較多的蔗糖或蜂蜜等糖類成分時，霉菌和酵母菌增殖風(fēng)險高，如黑曲霉等；當(dāng)制劑0.75>aw>0.60，只有耐受極端條件的霉菌和酵母菌才會生長，如魯氏酵母等；當(dāng)制劑aw<0.60，不支持微生物生長，結(jié)合高aw的中藥制劑測定結(jié)果，形成了表2所示的高水分活度中藥制劑的最大潛在增殖風(fēng)險的微生物評估結(jié)果.

2.3 基于aw的3組藥品不同劑型的處方分析

aw是中藥制劑的重要屬性，利用aw差異可評價相同品種的處方抑制微生物增殖的能力.3個品種不同劑型的中藥制劑aw比較見圖2所示，處方差異見表3所示.

圖2 不同劑型的3組6種中藥制劑aw比較

表3 不同劑型的3組6種中藥制劑處方分析

2.3.1 蜜煉川貝枇杷膏與川貝枇杷糖漿

蜜煉川貝枇杷膏與川貝枇杷糖漿的aw差異大，煎膏劑含有大量aw較低的煉蜜從而降低了制劑總體的aw，處方不利于大多數(shù)微生物的增殖，因處方含糖量高，僅耐受低aw脅迫的部分霉菌和酵母菌可生長.糖漿劑中加入的蔗糖也可降低aw，但本處方中糖漿劑aw降低的程度不如煎膏劑高，aw為0.965的糖漿劑可支持革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、霉菌和酵母菌等微生物的生長.潛在微生物增殖風(fēng)險可用來指導(dǎo)抑菌劑的合理應(yīng)用，若蜜煉川貝枇杷膏使用抑菌劑，應(yīng)選擇對霉菌和酵母菌作用強的抑菌劑，若川貝枇杷糖漿使用抑菌劑，應(yīng)選擇對細菌、霉菌和酵母菌都有作用的廣譜抑菌劑.

2.3.2 蜜煉強力枇杷膏與強力枇杷露

蜜煉強力枇杷膏與強力枇杷露的處方除所含煉蜜，飴糖及蔗糖不同外，主要處方相同(表3)，蜜煉強力枇杷膏aw均值比強力枇杷露的膏aw均值低0.107(圖2).根據(jù)aw的不同，蜜煉強力枇杷膏僅支持部分霉菌和酵母菌的增殖，微生物增殖風(fēng)險低，而強力枇杷露可支持部分細菌，霉菌和酵母菌的生長繁殖，處方對微生物增殖的敏感性更高，抑菌劑應(yīng)選擇更為廣譜的種類及更高的濃度.文獻報道[20]從強力枇杷露中可分離出引起脹瓶的污染微生物拜耳接合酵母，而強力枇杷露中大腸埃希菌[21]及BCC[22]的生長與否與產(chǎn)品的aw密切相關(guān).

2.3.3 川貝止咳糖漿與川貝止咳露

川貝止咳糖漿與川貝止咳露雖名稱相似，然而其處方中的藥味種類及用量差異較大，aw差異不大，若僅以aw因素考慮其微生物增殖風(fēng)險，川貝止咳糖漿最大潛在污染微生物為革蘭陽性菌，而川貝止咳露的最大潛在污染微生物為革蘭陰性菌.抑菌劑選擇時二者的側(cè)重點有所不同.

2.4 微生物污染風(fēng)險預(yù)測的結(jié)果驗證

在21d中，陽性對照生長良好，陰性對照均未生長，根據(jù)A和B的aw，預(yù)測最大潛在微生物增殖風(fēng)險及其21d的驗證結(jié)果見表4所示.由于A和B的aw均較低，抑制了大多數(shù)細菌、酵母菌和霉菌的增殖，驗證結(jié)果優(yōu)于預(yù)測結(jié)果，風(fēng)險預(yù)測具有較好的應(yīng)用價值.

表4 中藥煎膏劑和糖漿劑微生物污染預(yù)測驗證結(jié)果

中藥制劑aw的首要決定因素是劑型，其次是品種，再次是處方工藝.按照QbD理念，在新藥處方設(shè)計階段可利用aw作為制劑處方微生物易感性的評價工具，指導(dǎo)抑菌劑的合理使用[23,24]；在生產(chǎn)加工階段可利用aw作為工具確定關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性，控制生產(chǎn)過程種微生物和水分的引入，保障藥品安全有效及質(zhì)量可控[25]，aw為非無菌中藥制劑的微生物過程控制提供了有力工具；在質(zhì)量控制階段，可利用aw判斷最大潛在污染微生物，評估藥品的微生物污染風(fēng)險，制定更合理的標準.

高aw的非無菌中藥制劑應(yīng)考慮aw因素，制定更嚴格的微生物限度標準.例如，BCC在鹽酸美沙酮口服溶液[8]、保濟口服液[22]中的增殖，白色念珠菌和黑曲霉可在部分半夏糖漿/半夏止咳糖漿[12]中的增殖，拜耳接合酵母在強力枇杷露中的增殖[20]等高aw中藥制劑微生物污染和增殖現(xiàn)象均符合本文的理論預(yù)測結(jié)果.高aw的中藥液體制劑除了本文調(diào)查的5類制劑外，還有諸如中藥代煎煮液[9,26,27]、凝膠劑、合劑、沖洗劑、搽劑等多種劑型，均為微生物污染和增殖風(fēng)險較高的制劑，也是容易造成微生物生長繁殖的中藥制劑，因此，在進行該類制劑的處方設(shè)計、工藝確定、質(zhì)量控制時，可關(guān)注制劑的aw參數(shù).

此外，研究所獲高aw中藥制劑的平均aw應(yīng)理解為該類制劑的aw參考值，參考值的價值在于將劑型進行初步的分類，預(yù)測微生物的增殖風(fēng)險.非無菌中藥制劑處方中的藥味組成和形態(tài)，輔料的種類和用量等因素影響制劑的aw，進而影響制劑對微生物的敏感性.

盡管A和B兩種中藥制劑驗證結(jié)果與預(yù)測模型結(jié)果不一致，但微生物增殖風(fēng)險的驗證結(jié)果優(yōu)于預(yù)測，說明除aw外，可能其他因素如中藥成分也起到了抑制作用，使微生物控制的綜合效果優(yōu)于預(yù)測，這可能與中藥制劑成分的復(fù)雜性有關(guān).同一劑型甚至同一品種的aw差異較大，這與原輔料、處方[22]、工藝的關(guān)系密切，科學(xué)的微生物控制策略的建立依賴實際測定的針對具體品種的aw.

3 結(jié)論

高aw的中藥制劑包括液體/半固體制劑，通常aw>0.60，微生物污染和增殖風(fēng)險相對較高.研究非無菌中藥制劑的aw的分布，在控制高aw中藥制劑生物負載的前提下，可通過aw反映和評價制劑的微生物風(fēng)險，將為非無菌中藥制劑的處方優(yōu)化，過程控制和標準制定提供參考.