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    染色體核型分析聯(lián)合CNV-Seq檢測在高齡孕婦產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用

    2022-10-13 04:17:14唐艷盧守蓮王玨
    系統(tǒng)醫(yī)學(xué) 2022年15期
    關(guān)鍵詞:分析檢測

    唐艷,盧守蓮,王玨

    南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心,江蘇南京 210029

    高齡孕婦是指預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的孕婦,隨著三胎政策的提出,高齡孕婦不斷增多。高齡孕婦是染色體異常的高危人群[1],染色體的異??梢鹛航M織、器官發(fā)育異常等。多年來傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)染色體核型分析一直作為診斷染色體畸變的金標(biāo)準(zhǔn),能夠直觀地檢測出染色體數(shù)目異常、大片段的缺失重復(fù)及平衡易位等。但是染色體核型分析存在許多缺點(diǎn)如培養(yǎng)周期長耗時(shí)耗力,通常只能檢測5 Mb以上的異常[2]。近年來,隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展,高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)為染色體畸變及染色體拷貝數(shù)變異檢測提供了新的手段。本研究回顧性分析2018年1月—2020年1月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院368例高齡孕婦產(chǎn)前診斷羊水的染色體核型結(jié)果及基因組拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing,CNV-Seq)結(jié)果,探討二者聯(lián)合檢測在高齡孕婦中的臨床應(yīng)用價(jià)值,為臨床醫(yī)生提供參考?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取在本院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的高齡孕婦共368例,年齡35~48歲,孕周18~23周。通過羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水標(biāo)本,并在臨床上進(jìn)行胎兒染色體核型、CNV-Seq檢測與分析。

    1.2 方法

    1.2.1 樣本采集孕婦術(shù)前排空膀胱,取平臥位,經(jīng)B超檢測,基于無菌環(huán)境下,使羊水專用穿刺針經(jīng)腹部穿刺,抽取30 mL羊水,其中的20 mL羊水實(shí)施細(xì)胞培養(yǎng),以獲得染色體核型,其余的10 mL實(shí)現(xiàn)CNV-Seq檢測。

    1.2.2 染色體核型分析 完成20 mL的羊水抽取工作后離心,離心時(shí)間為8 min,離心速度2 500 r/min,去上清液且將下層羊水細(xì)胞留下,并放在兩個(gè)培養(yǎng)瓶中接種。孕婦的每個(gè)樣本都需要實(shí)現(xiàn)雙線培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后換液,換液后繼續(xù)培養(yǎng)3~5 d后觀察細(xì)胞生長狀態(tài),根據(jù)細(xì)胞生長狀況進(jìn)行收獲,常規(guī)制片、G顯帶,顯微鏡下計(jì)數(shù)30個(gè)中期分裂相,兩線鏡下各分析5個(gè)核型,如果遇到嵌合體,加倍計(jì)數(shù)分析,染色體圖像分析系統(tǒng)兩線采集保存3張圖片,核型結(jié)果參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制ISCN2013》進(jìn)行描述。

    1.2.3 CNV-Seq檢測 完成10 mL羊水抽取工作后,貝瑞和康公司完成CNV-Seq的樣本分析。在實(shí)際檢測中,主要針對的對象為染色體非整倍體變異、100 kb以上的CNV,具體方法為:提取待測樣本DNA;采用科諾安試劑盒進(jìn)行PCR-free建庫;利用NextSeqCN500對建庫后的樣本進(jìn)行測序;對測序的結(jié)果(fastq文件)進(jìn)行質(zhì)控,質(zhì)控合格的樣本用于全基因組范圍上的CNV檢測;將檢測獲得的開放閱讀框(reads)與hg19參考基因組進(jìn)行比對,按照基因組予以區(qū)間(bin)的劃分,對每個(gè)bin上的唯一數(shù)目進(jìn)行比對,對陰性對照在區(qū)域內(nèi)的唯一比對數(shù)值進(jìn)行計(jì)算,后期還需要使用GDSW算法對染色體異?;駽NV詳細(xì)分析。結(jié)果分為五類:致病、可能致病、臨床意義未明、可能良性、良性。

    如果發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常的孕婦,可以通過電話隨訪的方式追蹤,詳細(xì)記錄孕婦的妊娠結(jié)局和新生兒的健康情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)方法

    采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料使用(±s)表示,不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)(最小值~最大值)表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 染色體核型分析結(jié)果

    經(jīng)過368例高齡孕婦的染色體核型檢測,發(fā)現(xiàn)有異常者為30例,染色體異常檢出率為8.2%(30/368),其中21三體7例,18三體2例,性染色體數(shù)目異常8例,嵌合體4例,染色體平衡變異6例,不平衡易位變異3例。

    2.2 CNV-Seq檢測結(jié)果

    CNV-Seq結(jié)果異常40例,異常檢出率10.9%(40/368),其中21三體7例,18三體2例,性染色體數(shù)目異常8例,嵌合體4例,≥10 Mb大片段缺失重復(fù)3例,<10 Mb且 致 病 性CNVs3例,可 能 致 病 性CNVs3例,臨床意義未明CNVs10例。

    2.3 染色體核型分析聯(lián)合CNV-Seq檢測

    染色體核型檢測與CNV-Seq兩種方法對于染色體非整倍體異常檢出一致。而兩種方法對于4例嵌合體的檢出結(jié)果,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對于染色體核型分析檢出的3例不平衡變異,CNV-Seq也檢測出異常并且準(zhǔn)確地檢出染色體異常的位點(diǎn)。見表1。此外,染色體核型分析檢出6例CNV-Seq未檢出的染色體平衡變異。見表2。CNV-Seq檢測出染色體核型未檢出的3例致病性CNVs,3例可能致病性CNVs,以及10例臨床意義未明的CNVs。見表3。

    表1 應(yīng)用不同檢測方法染色體核型結(jié)果對比

    表2 不同染色體核型檢出的染色體平衡變異情況對比

    表3 不同染色體核型致病性對比

    續(xù)表3

    對所有CNV結(jié)果異常的高齡孕婦進(jìn)行電話隨訪。7例21三體綜合征均選擇終止妊娠,2例18三體均終止妊娠,8例性染色體異常中,1例超雌綜合征的孕婦33周早產(chǎn),未見明顯異常,5例克氏綜合選擇終止妊娠,另外2例超雄綜合征孕婦足月分娩目前新生兒未見明顯異常。4例嵌合體中1例嵌合型21三體綜合征與2例嵌合型特納綜合征選擇終止妊娠,另外1例嵌合型特納綜合征失訪。3例致病性CNV均引產(chǎn),3例可能致病CNV選擇繼續(xù)妊娠,出生后胎兒未見異常。10例臨床意義未明病例,其中5例做了父母CNV驗(yàn)證,證實(shí)臨床意義不明片段來源于父母,隨訪7例足月分娩未見明顯異常,其余3例失訪。

    3 討論

    拷貝數(shù)變異(copynumbervaria-tion,CNVs)在人類基因組中存在廣泛,在1 000 bp上范圍內(nèi)會(huì)發(fā)生缺失、插入、重復(fù)等多位點(diǎn)的復(fù)雜變異,一般是染色體亞顯微水平缺失或者重復(fù),該情況的發(fā)生多是因?yàn)榛蚪M重排導(dǎo)致的[3]。CNV-Seq主要是對CNV進(jìn)行檢測,在全基因組范圍內(nèi)完成,能夠?qū)NA進(jìn)行全基因組低深度高通量測序,也能進(jìn)行CNV的檢測,期間使用的方法為短序列比對、counts計(jì)算統(tǒng)計(jì)方法。

    CNV-Seq多應(yīng)用在果蠅的染色體CNV檢測、腫瘤基因組檢測中[4-5],后期開始檢測人類遺傳病有關(guān)的CNV。

    本研究回顧性分析了368例高齡孕婦產(chǎn)前診斷的結(jié)果,共檢出30例異常,檢出率8.2%(30/368),其中21三體7例,18三體2例,性染色體數(shù)目異常8例,嵌合體4例,染色體平衡變異6例,不平衡易位變異3例。CNV-Seq檢測出異常40例,檢出率10.9%(40/368)。其中除了染色體核型結(jié)果6例平衡易位未檢出,其他24例致病性改變CNV-Seq均檢測出。此外CNV-Seq還額外檢測出3例CNV≤10 Mb明確致病性樣本,3例可能致病性樣本,占比1.6%(6/368),10例臨床意義不明樣本。3例CNV可能致病性病例均進(jìn)行父母染色體CNV驗(yàn)證,其中1例為母源性,另外2例為新發(fā)突變,3例病例孕婦均選擇繼續(xù)妊娠,出生后未見明顯異常。10例臨床意義未明病例中有5例選擇夫妻雙方CNV驗(yàn)證,證實(shí)異常片段均來源于父母,另外5例未做驗(yàn)證。10例病例3例失訪,其余7例出生后均未見明顯異常。

    本研究中選取的均為高齡孕婦,即預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的孕婦,368例高齡孕婦中染色體異常CNVSeq檢出率高于染色體核型檢測檢出率,由此可見CNV-Seq在高齡孕婦的產(chǎn)前診斷中具有重要的臨床意義。經(jīng)過大量數(shù)據(jù)研究分析,產(chǎn)前診斷指征為高齡、血清學(xué)篩查提示染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)或者因焦慮自愿選擇產(chǎn)前診斷的孕婦中,當(dāng)染色體核型分析正常時(shí),采用分子檢測手段還能發(fā)現(xiàn)額外1.0%~1.7%的具有臨床意義的CNV異常[6-7]。Wang J等[8]開展了3 429例產(chǎn)前診斷樣本前瞻性研究,其中包括高齡孕婦,研究提出CNV-Seq可作為產(chǎn)前診斷的一線檢測手段。吳曉霞等[9]通過高齡孕婦人群中CNV發(fā)生率研究,發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的CNV發(fā)生率為1.9%。本研究染色體核型異常的孕婦中額外檢測出1.6%的具有臨床意義的CNV。

    CNV-Seq用于產(chǎn)前診斷對比染色體核型分析,該方法需要的樣本少,且分析速度快、準(zhǔn)確,具備較高的分辨率,能實(shí)現(xiàn)染色體微缺失、微重復(fù)檢測等優(yōu)勢。本研究中對于染色體核型正常的孕婦CNVSeq檢測額外檢測出6例具有臨床意義的CNV,并且對于大片段的染色體重復(fù)缺失,染色體核型雖然也能檢測出異常,但是由于染色體核型分析制片過程中受多種因素影響,有時(shí)顯帶并不是很理想,或者分辨率低無法準(zhǔn)確地定位染色體斷裂的位點(diǎn),CNV-Seq可準(zhǔn)確地定位到染色體斷裂的位點(diǎn)[10-12]。染色體核型相比較CNV-Seq也有獨(dú)特的優(yōu)勢,可直觀觀察全染色體組形態(tài),檢測染色體結(jié)構(gòu)變異,可從形態(tài)學(xué)上解釋染色體異常機(jī)理。本研究中染色體核型分析準(zhǔn)確地診斷出6例CNV-Seq無法檢測出的染色體平衡易位。因此,防止漏檢,高齡孕婦在行產(chǎn)前診斷羊水染色體核型檢測時(shí)可聯(lián)合CNVSeq檢測,提高染色體異常檢出率。CNV-Seq由于是全基因組隨機(jī)測序,測序位點(diǎn)沒有偏向,會(huì)增加更多的拷貝數(shù)變異[13-15],能夠有效發(fā)現(xiàn)新基因,但工作量較大,臨床醫(yī)生可在羊膜腔穿刺前向孕婦交代清楚,由孕婦知情選擇。

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