染色體核型分析聯(lián)合CNV-Seq檢測在高齡孕婦產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用

唐艷，盧守蓮，王玨

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心，江蘇南京 210029

高齡孕婦是指預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的孕婦，隨著三胎政策的提出，高齡孕婦不斷增多。高齡孕婦是染色體異常的高危人群[1],染色體的異?？梢鹛航M織、器官發(fā)育異常等。多年來傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)染色體核型分析一直作為診斷染色體畸變的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠直觀地檢測出染色體數(shù)目異常、大片段的缺失重復(fù)及平衡易位等。但是染色體核型分析存在許多缺點如培養(yǎng)周期長耗時耗力，通常只能檢測5 Mb以上的異常[2]。近年來，隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)為染色體畸變及染色體拷貝數(shù)變異檢測提供了新的手段。本研究回顧性分析2018年1月—2020年1月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院368例高齡孕婦產(chǎn)前診斷羊水的染色體核型結(jié)果及基因組拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)結(jié)果，探討二者聯(lián)合檢測在高齡孕婦中的臨床應(yīng)用價值，為臨床醫(yī)生提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在本院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的高齡孕婦共368例，年齡35～48歲，孕周18～23周。通過羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水標(biāo)本，并在臨床上進(jìn)行胎兒染色體核型、CNV-Seq檢測與分析。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集孕婦術(shù)前排空膀胱，取平臥位，經(jīng)B超檢測，基于無菌環(huán)境下，使羊水專用穿刺針經(jīng)腹部穿刺，抽取30 mL羊水，其中的20 mL羊水實施細(xì)胞培養(yǎng)，以獲得染色體核型，其余的10 mL實現(xiàn)CNV-Seq檢測。

1.2.2 染色體核型分析 完成20 mL的羊水抽取工作后離心，離心時間為8 min，離心速度2 500 r/min，去上清液且將下層羊水細(xì)胞留下，并放在兩個培養(yǎng)瓶中接種。孕婦的每個樣本都需要實現(xiàn)雙線培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后換液，換液后繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況進(jìn)行收獲，常規(guī)制片、G顯帶，顯微鏡下計數(shù)30個中期分裂相，兩線鏡下各分析5個核型，如果遇到嵌合體，加倍計數(shù)分析，染色體圖像分析系統(tǒng)兩線采集保存3張圖片，核型結(jié)果參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制ISCN2013》進(jìn)行描述。

1.2.3 CNV-Seq檢測 完成10 mL羊水抽取工作后，貝瑞和康公司完成CNV-Seq的樣本分析。在實際檢測中，主要針對的對象為染色體非整倍體變異、100 kb以上的CNV，具體方法為：提取待測樣本DNA；采用科諾安試劑盒進(jìn)行PCR-free建庫；利用NextSeqCN500對建庫后的樣本進(jìn)行測序；對測序的結(jié)果（fastq文件）進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控合格的樣本用于全基因組范圍上的CNV檢測；將檢測獲得的開放閱讀框（reads）與hg19參考基因組進(jìn)行比對，按照基因組予以區(qū)間（bin）的劃分，對每個bin上的唯一數(shù)目進(jìn)行比對，對陰性對照在區(qū)域內(nèi)的唯一比對數(shù)值進(jìn)行計算，后期還需要使用GDSW算法對染色體異?；駽NV詳細(xì)分析。結(jié)果分為五類：致病、可能致病、臨床意義未明、可能良性、良性。

如果發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常的孕婦，可以通過電話隨訪的方式追蹤，詳細(xì)記錄孕婦的妊娠結(jié)局和新生兒的健康情況。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料使用（±s）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（最小值～最大值）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果

經(jīng)過368例高齡孕婦的染色體核型檢測，發(fā)現(xiàn)有異常者為30例，染色體異常檢出率為8.2%（30/368），其中21三體7例，18三體2例，性染色體數(shù)目異常8例，嵌合體4例，染色體平衡變異6例，不平衡易位變異3例。

2.2 CNV-Seq檢測結(jié)果

CNV-Seq結(jié)果異常40例，異常檢出率10.9%（40/368），其中21三體7例，18三體2例，性染色體數(shù)目異常8例，嵌合體4例，≥10 Mb大片段缺失重復(fù)3例，＜10 Mb且 致 病 性CNVs3例，可 能 致 病 性CNVs3例，臨床意義未明CNVs10例。

2.3 染色體核型分析聯(lián)合CNV-Seq檢測

染色體核型檢測與CNV-Seq兩種方法對于染色體非整倍體異常檢出一致。而兩種方法對于4例嵌合體的檢出結(jié)果，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對于染色體核型分析檢出的3例不平衡變異，CNV-Seq也檢測出異常并且準(zhǔn)確地檢出染色體異常的位點。見表1。此外，染色體核型分析檢出6例CNV-Seq未檢出的染色體平衡變異。見表2。CNV-Seq檢測出染色體核型未檢出的3例致病性CNVs，3例可能致病性CNVs，以及10例臨床意義未明的CNVs。見表3。

表1 應(yīng)用不同檢測方法染色體核型結(jié)果對比

表2 不同染色體核型檢出的染色體平衡變異情況對比

表3 不同染色體核型致病性對比

續(xù)表3

對所有CNV結(jié)果異常的高齡孕婦進(jìn)行電話隨訪。7例21三體綜合征均選擇終止妊娠，2例18三體均終止妊娠，8例性染色體異常中，1例超雌綜合征的孕婦33周早產(chǎn)，未見明顯異常，5例克氏綜合選擇終止妊娠，另外2例超雄綜合征孕婦足月分娩目前新生兒未見明顯異常。4例嵌合體中1例嵌合型21三體綜合征與2例嵌合型特納綜合征選擇終止妊娠，另外1例嵌合型特納綜合征失訪。3例致病性CNV均引產(chǎn)，3例可能致病CNV選擇繼續(xù)妊娠，出生后胎兒未見異常。10例臨床意義未明病例，其中5例做了父母CNV驗證，證實臨床意義不明片段來源于父母，隨訪7例足月分娩未見明顯異常，其余3例失訪。

3 討論

拷貝數(shù)變異（copynumbervaria-tion，CNVs）在人類基因組中存在廣泛，在1 000 bp上范圍內(nèi)會發(fā)生缺失、插入、重復(fù)等多位點的復(fù)雜變異，一般是染色體亞顯微水平缺失或者重復(fù)，該情況的發(fā)生多是因為基因組重排導(dǎo)致的[3]。CNV-Seq主要是對CNV進(jìn)行檢測，在全基因組范圍內(nèi)完成，能夠?qū)NA進(jìn)行全基因組低深度高通量測序，也能進(jìn)行CNV的檢測，期間使用的方法為短序列比對、counts計算統(tǒng)計方法。

CNV-Seq多應(yīng)用在果蠅的染色體CNV檢測、腫瘤基因組檢測中[4-5],后期開始檢測人類遺傳病有關(guān)的CNV。

本研究回顧性分析了368例高齡孕婦產(chǎn)前診斷的結(jié)果，共檢出30例異常，檢出率8.2%（30/368），其中21三體7例，18三體2例，性染色體數(shù)目異常8例，嵌合體4例，染色體平衡變異6例，不平衡易位變異3例。CNV-Seq檢測出異常40例，檢出率10.9%（40/368）。其中除了染色體核型結(jié)果6例平衡易位未檢出，其他24例致病性改變CNV-Seq均檢測出。此外CNV-Seq還額外檢測出3例CNV≤10 Mb明確致病性樣本，3例可能致病性樣本，占比1.6%（6/368），10例臨床意義不明樣本。3例CNV可能致病性病例均進(jìn)行父母染色體CNV驗證，其中1例為母源性，另外2例為新發(fā)突變，3例病例孕婦均選擇繼續(xù)妊娠，出生后未見明顯異常。10例臨床意義未明病例中有5例選擇夫妻雙方CNV驗證，證實異常片段均來源于父母，另外5例未做驗證。10例病例3例失訪，其余7例出生后均未見明顯異常。

本研究中選取的均為高齡孕婦，即預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的孕婦，368例高齡孕婦中染色體異常CNVSeq檢出率高于染色體核型檢測檢出率，由此可見CNV-Seq在高齡孕婦的產(chǎn)前診斷中具有重要的臨床意義。經(jīng)過大量數(shù)據(jù)研究分析，產(chǎn)前診斷指征為高齡、血清學(xué)篩查提示染色體異常高風(fēng)險或者因焦慮自愿選擇產(chǎn)前診斷的孕婦中，當(dāng)染色體核型分析正常時，采用分子檢測手段還能發(fā)現(xiàn)額外1.0%～1.7%的具有臨床意義的CNV異常[6-7]。Wang J等[8]開展了3 429例產(chǎn)前診斷樣本前瞻性研究，其中包括高齡孕婦，研究提出CNV-Seq可作為產(chǎn)前診斷的一線檢測手段。吳曉霞等[9]通過高齡孕婦人群中CNV發(fā)生率研究，發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的CNV發(fā)生率為1.9%。本研究染色體核型異常的孕婦中額外檢測出1.6%的具有臨床意義的CNV。

CNV-Seq用于產(chǎn)前診斷對比染色體核型分析，該方法需要的樣本少，且分析速度快、準(zhǔn)確，具備較高的分辨率，能實現(xiàn)染色體微缺失、微重復(fù)檢測等優(yōu)勢。本研究中對于染色體核型正常的孕婦CNVSeq檢測額外檢測出6例具有臨床意義的CNV,并且對于大片段的染色體重復(fù)缺失，染色體核型雖然也能檢測出異常，但是由于染色體核型分析制片過程中受多種因素影響，有時顯帶并不是很理想，或者分辨率低無法準(zhǔn)確地定位染色體斷裂的位點，CNV-Seq可準(zhǔn)確地定位到染色體斷裂的位點[10-12]。染色體核型相比較CNV-Seq也有獨特的優(yōu)勢，可直觀觀察全染色體組形態(tài)，檢測染色體結(jié)構(gòu)變異，可從形態(tài)學(xué)上解釋染色體異常機(jī)理。本研究中染色體核型分析準(zhǔn)確地診斷出6例CNV-Seq無法檢測出的染色體平衡易位。因此，防止漏檢，高齡孕婦在行產(chǎn)前診斷羊水染色體核型檢測時可聯(lián)合CNVSeq檢測，提高染色體異常檢出率。CNV-Seq由于是全基因組隨機(jī)測序，測序位點沒有偏向，會增加更多的拷貝數(shù)變異[13-15]，能夠有效發(fā)現(xiàn)新基因，但工作量較大，臨床醫(yī)生可在羊膜腔穿刺前向孕婦交代清楚，由孕婦知情選擇。