國(guó)產(chǎn)化時(shí)間分辨免疫熒光法游離雌三醇檢測(cè)試劑盒性能驗(yàn)證

宋勝楠，王玨

江蘇省人民醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇南京 210003

對(duì)于出生缺陷疾病，目前尚無(wú)有效的治療手段，通過(guò)產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷技術(shù)在宮內(nèi)及時(shí)發(fā)現(xiàn)胎兒染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)行二級(jí)預(yù)防及干預(yù)是出生缺陷防治的重要技術(shù)手段。中孕期母血清產(chǎn)前篩查是在孕15～20+6周期間抽取孕婦的肘靜脈血（空腹），通過(guò)定量測(cè)定血清中甲胎蛋白（alphafetoprotain，AFP）、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）、游離雌三醇（unconjugated estriol，UE3）濃度值，結(jié)合孕婦年齡、孕周、體重、既往妊娠史、有無(wú)糖尿病、吸煙等因素，通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算軟件評(píng)估胎兒罹患唐氏綜合征（21三體）、愛(ài)德華綜合征（18三體）及開(kāi)放性神經(jīng)管缺陷（open neural tube defect，ONTD）的風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)高低決定是否進(jìn)行下一步產(chǎn)前診斷。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道胎兒患有21三體時(shí)，孕婦血清中游離雌三醇含量平均減少約1/4，胎兒患有18三體時(shí)UE3平均水平也會(huì)降低[1-2]。本研究按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T420-2013《臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)商品定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證》要求進(jìn)行[3]，從精密度、正確度、線性范圍3個(gè)方面，對(duì)一款國(guó)產(chǎn)化UE3時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)估，判斷該試劑盒是否能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求并滿足臨床需求，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

①精密度驗(yàn)證樣本采用市售中孕期血清學(xué)篩查測(cè)定室內(nèi)質(zhì)控品（批號(hào)：20170401）。正確度驗(yàn)證樣本采用國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心2019年中孕期母血清產(chǎn)前篩查測(cè)定室間質(zhì)量評(píng)價(jià)凍干品（批號(hào)：201911、201921、201931、201941、201951）。以上樣本均按照說(shuō)明書(shū)要求復(fù)溶后分裝保存。線性范圍樣本來(lái)源于2018年10月—2019年4月在江蘇省婦幼保健院采集的孕中期血清學(xué)篩查臨床送檢血樣，孕周為15～20+6周，血樣均在采集后24 h內(nèi)離心分裝血清，并在采樣后5個(gè)工作日內(nèi)完成定量檢測(cè)。檢測(cè)完成后血清樣本置于-70℃醫(yī)用冰箱保存。在本實(shí)驗(yàn)中所有血清樣本均提前24 h取出復(fù)溫至室溫并混合均勻[4]。

待性能驗(yàn)證的國(guó)產(chǎn)游離雌三醇檢測(cè)試劑盒（時(shí)間分辨免疫熒光法）（批號(hào)：8600106450）；室內(nèi)質(zhì)控品（批號(hào)：20170401）。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

②儀器為AutoDELFIA1235全自動(dòng)時(shí)間分辨儀。

1.2 方法

1.2.1 UE3精密度驗(yàn)證采用本實(shí)驗(yàn)室在用的中孕期血清學(xué)篩查室內(nèi)質(zhì)控品（低、中、高3個(gè)濃度）作為精密度測(cè)試樣本，共行5批實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，每批實(shí)驗(yàn)對(duì)3個(gè)濃度樣本重復(fù)測(cè)量3次，每個(gè)濃度可獲得15個(gè)測(cè)量值，計(jì)算變異系數(shù)（coefficient variations，CV），包括批內(nèi)變異系數(shù)（CV批內(nèi)）、批間變異系數(shù)（CV批間）和總變異系數(shù)（CV總），與試劑盒廠家聲稱(chēng)的CV值進(jìn)行比較，驗(yàn)證其精密度是否可靠。

1.2.2 UE3正確度驗(yàn)證采用國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心2019年第一次中孕期母血清學(xué)篩查測(cè)定室間質(zhì)量評(píng)價(jià)凍干品作為正確度測(cè)試樣本，5個(gè)濃度均在醫(yī)學(xué)決定水平范圍內(nèi)。共進(jìn)行5批實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，每批實(shí)驗(yàn)對(duì)5個(gè)濃度樣本重復(fù)測(cè)量3次，每個(gè)濃度獲得15個(gè)測(cè)量值。統(tǒng)計(jì)分析測(cè)量偏移值和參考標(biāo)準(zhǔn)不確定度，按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T420-2013[3]的要求判斷試劑盒的正確度是否可靠。

1.2.3 UE3線性范圍驗(yàn)證在驗(yàn)證范圍內(nèi)，取妊娠36周的孕婦血清作為線性范圍驗(yàn)證中的高濃度樣本[5]，取本實(shí)驗(yàn)室臨床檢測(cè)中的極低濃度樣本作為低濃度樣本。按照表1的比例混合制備不同濃度的6個(gè)血清樣本。每個(gè)樣本測(cè)量3次，在一批測(cè)量中完成?？疾鞙y(cè)量均值與理論值的線性關(guān)系[6]。

表1 UE3線性范圍實(shí)驗(yàn)樣本制備方法（混合比例）

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 UE3精密度低、中、高3個(gè)濃度樣本的CV批內(nèi)、CV批間、CV總與試劑盒廠家聲稱(chēng)的CV值進(jìn)行比較。

1.3.2 UE3正確度按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T420-2013[3]的結(jié)果判讀規(guī)則：當(dāng)實(shí)驗(yàn)室參考物質(zhì)測(cè)量偏移值＞參考物質(zhì)賦值的不確定度，則應(yīng)將此偏移值的驗(yàn)證區(qū)間與參考物質(zhì)賦值進(jìn)行比較，如在驗(yàn)證區(qū)間內(nèi)說(shuō)明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），應(yīng)認(rèn)可本試劑盒正確度驗(yàn)證可靠[7]。

本次驗(yàn)證采用國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心2019年中孕期母血清學(xué)篩查測(cè)定室間質(zhì)量評(píng)價(jià)凍干品（批號(hào)201911、201912、201913、201914、201915），作為參考物質(zhì)[8]。按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供的計(jì)算公式，根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心公布的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果，參考物質(zhì)賦值分別為2.60、4.50、1.80、6.00、6.90，并計(jì)算出本參考物質(zhì)賦值的不確定度。

1.3.3 UE3線性范圍 按照比例配置6個(gè)理想線性濃度樣本后，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以測(cè)量均值為橫坐標(biāo)，理論值為縱坐標(biāo)，擬合曲線方程，得出相關(guān)系數(shù)，按WS/T2013判讀規(guī)則，r2＞0.995v0即可判斷廠家聲稱(chēng)的線性范圍符合要求[3]。

2 結(jié)果

2.1 精密度結(jié)果

3個(gè)濃度的批內(nèi)變異系數(shù)均小于廠家聲稱(chēng)的10.00%；批間變異系數(shù)也均0小于廠家聲稱(chēng)的15.00%；總變異系數(shù)分別為低濃度5.00%、中濃度3.00%、高濃度3.90%，小于廠家聲稱(chēng)的總變異系數(shù)不超過(guò)5.00%。見(jiàn)表2。

表2 UE3精密度驗(yàn)證批內(nèi)及批間變異系數(shù)結(jié)果（%）

2.2 正確度結(jié)果

比較后發(fā)現(xiàn)，5個(gè)參考物質(zhì)的測(cè)量偏移值均大于參考物質(zhì)賦值的不確定度。因此，繼續(xù)計(jì)算各個(gè)測(cè)量偏移值的驗(yàn)證區(qū)間，結(jié)果提示5個(gè)參考物質(zhì)賦值均在測(cè)量偏移值的驗(yàn)證區(qū)間內(nèi)。見(jiàn)表3。

表3 正確度驗(yàn)證測(cè)量數(shù)據(jù)(nmol/L)

2.3 UE3線性范圍

測(cè)量均值和理論值,得出相關(guān)系數(shù)r2=0.995 4＞0.995v0，表明廠家聲稱(chēng)的線性范圍符合要求。見(jiàn)表4、圖1。

表4 UE3線性范圍驗(yàn)證血清測(cè)量濃度結(jié)果

圖1 UE3線性范圍驗(yàn)證測(cè)量值和理論值擬合曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室之前一直使用芬蘭全進(jìn)口時(shí)間分辨免疫熒光定量UE3檢測(cè)試劑盒，但由于原材料缺乏，進(jìn)口試劑停止生產(chǎn)并且完成了國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)產(chǎn)，本院在使用國(guó)產(chǎn)化試劑盒之前要按照要求完成國(guó)產(chǎn)化試劑盒的性能驗(yàn)證以確保能適用于臨床[9-10]。

為對(duì)一款國(guó)產(chǎn)時(shí)間分辨免疫熒光定量UE3檢測(cè)試劑盒進(jìn)行性能驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)室從精密度、正確度、線性范圍進(jìn)行評(píng)價(jià)，了解該試劑盒的分析性能能否達(dá)到中孕期母血清產(chǎn)前篩查UE3檢測(cè)的臨床檢驗(yàn)要求[11]。采用AutoDELFIA1235全自動(dòng)時(shí)間分辨儀進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T420-2013《臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)商品定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證》要求進(jìn)行[13]。游離雌三醇檢測(cè)試劑盒用于中孕期唐氏綜合征篩查，再結(jié)合其他指標(biāo)綜合判斷胎兒罹患21-三體，18-三體，開(kāi)放性神經(jīng)缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。臨床醫(yī)生根據(jù)不同的的唐篩結(jié)果對(duì)后續(xù)的產(chǎn)前診斷做出不同的判斷[12]。

在精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)室選擇穩(wěn)定性良好的市售室內(nèi)質(zhì)控品作為測(cè)試樣本，分別計(jì)算低、中、高3個(gè)濃度樣本的批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)、總變異系數(shù)[12-13]。3個(gè)濃度的批內(nèi)變異系數(shù)分別為低濃度4.72%、中濃度2.22%、高濃度2.25%均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)的10.00%；批間變異系數(shù)分別為低濃度2.76%、中濃度2.26%、高濃度3.33%，均小于說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)的15.00%；總變異系數(shù)分別為低濃度4.00%、中濃度3.00%、高濃度3.90%，小于說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)的總變異系數(shù)不超過(guò)5.00%。按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T420-2013判讀標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)室得出的數(shù)值和說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)的數(shù)值得出，驗(yàn)證結(jié)果本試劑盒精密度符合要求并能滿足實(shí)驗(yàn)室臨床檢驗(yàn)要求。

在正確度驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，關(guān)于參考物質(zhì)的選擇，根據(jù)WS/T2013建議可首選新鮮冷凍人血清或其他未經(jīng)加工的人類(lèi)物質(zhì)，包括檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)公布的二級(jí)參考物質(zhì)，但是此類(lèi)參考物質(zhì)不易獲得。故本實(shí)驗(yàn)室按照WS/T2013建議，選擇大型能力比對(duì)或室間質(zhì)評(píng)的樣本，即國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心室間質(zhì)評(píng)樣本作為參考物質(zhì)。參考物質(zhì)的賦值及不確定度，來(lái)源于這次室間質(zhì)評(píng)國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心公布的數(shù)據(jù)[14]。

按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果判讀規(guī)則：當(dāng)實(shí)驗(yàn)室參考物質(zhì)測(cè)量偏移值＞參考物質(zhì)賦值的不確定度，則應(yīng)將此偏移值的驗(yàn)證區(qū)間與參考物質(zhì)賦值進(jìn)行比較，根據(jù)本次檢測(cè)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，5個(gè)參考物質(zhì)的賦值均在測(cè)量偏移值的驗(yàn)證區(qū)間之內(nèi)，說(shuō)明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），本試劑盒正確度驗(yàn)證可靠，同時(shí)能夠滿足臨床檢驗(yàn)需求[15]。

在線性范圍驗(yàn)證時(shí)，要求所配置的理想線性濃度樣本，盡量和臨床樣本性狀一致，因此孕婦樣本是線性范圍驗(yàn)證的理想樣本來(lái)源。本院孕婦血清學(xué)篩查樣本庫(kù)的采樣時(shí)間為孕15～20+6周，樣本游離雌三醇濃度大多＜20 nmol/L，達(dá)不到線性范圍的高值。故本次性能驗(yàn)證中，選擇了妊娠36周的孕婦血樣作為接近F點(diǎn)的高濃度樣本，在樣本庫(kù)中選擇極低濃度的孕婦血樣作為低濃度樣本，按照比例配置6個(gè)理想線性濃度樣本，使其均勻分布于試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)區(qū)間。結(jié)果顯示，本次測(cè)量均值與理想值的擬合曲線方程的相關(guān)系數(shù)符合要求，廠家聲稱(chēng)的線性范圍符合臨床檢驗(yàn)要求。

綜上所述，本國(guó)產(chǎn)游離雌三醇時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測(cè)試劑盒，從精密度、正確度和線性范圍驗(yàn)證結(jié)果顯示，其分析性能符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室臨床檢驗(yàn)需求。