RP-HPLC法同時測定豆瓣醬中4種尼泊金酯的一測多評研究

劉超，景贊，余敏靈

(樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000)

尼泊金酯是一類高效、低毒且容易降解的防腐劑，具有化學穩(wěn)定性高、不揮發(fā)、抗菌、成本低且無氣味等優(yōu)勢。因具備羥基結(jié)構(gòu)，其抗菌性和廣譜性明顯高于其他傳統(tǒng)的添加劑。因其良好的抗菌效果，美國、日本等國家均已將尼泊金酯類物質(zhì)列入食品防腐劑目錄?，F(xiàn)有的尼泊金酯的檢測方法有氣相色譜法、液相色譜法等，但以上方法均無法實現(xiàn)一種標準物質(zhì)同時測定幾種物質(zhì)的要求。一測多評法是近年來藥品領(lǐng)域為解決標準品購買困難、性質(zhì)不穩(wěn)定等問題而誕生的一種質(zhì)量控制方法。這種方法利用待測的幾種物質(zhì)中的一種物質(zhì)標準品實現(xiàn)其余物質(zhì)的定量。徐賽華等利用一測多評法實現(xiàn)了重樓藥材中4種皂苷類含量的測定；王欣等利用一測多評法實現(xiàn)了黃連須中5種生物堿含量的測定；于雪娥等利用一測多評法實現(xiàn)了淫羊藿中7種黃酮類成分含量的同時測定；劉峰等利用一測多評法實現(xiàn)了沙棘鮮果中槲皮素、山奈素、異鼠李素含量的測定。但是，一測多評法在食品中少有報道。甲醇等化學試劑對身體有害并會對環(huán)境造成污染，若長期且不當接觸，會對身體造成較大的傷害。在試驗過程中，嘗試用乙醇代替甲醇作為提取試劑和流動相，在保證試驗數(shù)據(jù)準確可靠的基礎(chǔ)上，可以大大降低甲醇給檢驗員帶來的傷害以及對環(huán)境的污染。

試驗建立了RP-HPLC法同時測定豆瓣醬中4種尼泊金酯一測多評的檢驗方法，為一測多評法在食品中的應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豆瓣醬：市售。

1.2 試劑

無水乙醇(色譜純，CAS：64-17-5)、正己烷(色譜純，CAS：110-54-3)：成都科隆化學品有限公司;對羥基苯甲酸甲酯(CAS：99-76-3)、對羥基苯甲酸乙酯(CAS：120-47-8)、對羥基苯甲酸丙酯(CAS：94-13-3)、對羥基苯甲酸丁酯(CAS：94-26-8)：Stanford Chemicals Company。

1.3 主要儀器與設(shè)備

DGU-20A型高效液相色譜儀 日本島津公司；ME204T102型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TGL-16型臺式高速離心機 四川蜀科儀器有限公司；KQ-700型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XH-C型旋渦混合器 江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.4 色譜條件

液相色譜柱：CAPCELL PAK C(4.6 mm×250 mm，5 μm)。進樣體積：10 μL，流速：0.5 mL/min，柱溫：35 ℃，流動相A為乙醇，流動相B為水。

表1 流動相梯度洗脫

1.5 標準曲線的配制

1.5.1 尼泊金酯類標準儲備液

分別精確稱取10 mg尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯標準品至4個10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，4種尼泊金酯類溶液濃度均為1 mg/mL。

1.5.2 尼泊金酯類混合標準工作溶液

分別準確吸取4種尼泊金酯類標準儲備液0，10，20，40，60，80，100 μL置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，配制成濃度為0，1，2，4，6，8，10 μg/mL的尼泊金酯類混合標準工作溶液。

1.6 供試品溶液

稱取混勻后的豆瓣醬試樣5.0 g(精確至0.01 g)置于25 mL塑料離心管中，加入10 mL乙醇、10 mL正己烷，渦旋1 min，超聲提取30 min，8000 r/min離心5 min，除去正己烷層，吸取乙醇層至25 mL容量瓶中，殘渣中加入5 mL正己烷、10 mL乙醇重復(fù)提取1次，合并2次上清液，乙醇定容至25 mL，供上機分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流速的選擇

由于含碳量高，乙醇的黏度較甲醇大。液相色譜流速越小，出峰越晚、峰形越寬、柱壓越低；液相色譜流速越大，出峰越早、峰形越窄、柱壓越高。試驗考察了柱溫為35 ℃，流速分別為0.3，0.5，0.7， 0.9 mL/min時峰形寬窄、出柱壓、分離度等因素，綜合選出最適流速。

由表2可知，流速除了在0.3 mL/min時峰形稍寬外，其余流速所對應(yīng)的峰形均較窄，流速在0.7,0.9 mL/min時對應(yīng)的柱壓均較大，且在流動相梯度洗脫過程中，最高柱壓分別達到15.6，18.3 MPa，對液相色譜柱不利。從分離度看，以上4種流速對應(yīng)的分離度均滿足要求。綜上，試驗選擇最佳流速為0.5 mL/min。

表2 不同流速對應(yīng)峰形、初始柱壓及分離度情況

2.2 柱溫的選擇

柱溫影響出峰時間、柱壓高低、峰形寬窄等因素。柱溫越高，出峰時間越早、柱壓越低、峰形越窄；反之，出峰時間越晚、柱壓越高、峰形越寬。試驗考察了流速為0.5 mL/min，柱溫分別為25，30，35，40 ℃時峰形寬窄、柱壓、分離度等因素，綜合選出最適柱溫。

由表3可知，柱溫對峰形的影響較小，在不同的溫度下，峰形均較窄；溫度對柱壓的影響較大，當柱溫為25，30 ℃時，對應(yīng)的初始柱壓及梯度洗脫中最高柱壓均較大；柱溫在35，40 ℃時，對應(yīng)的初始柱壓及最高柱壓均較小。柱溫的變化對分離度的影響較小，以上4種流速對應(yīng)的分離度均滿足要求。綜上及考慮到經(jīng)濟性，試驗選擇最佳柱溫為35 ℃。

表3 不同柱溫對應(yīng)峰形、初始柱壓及分離度情況

續(xù) 表

2.3 f值和t值的確定

試驗采用尼泊金甲酯為參考對象，以尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯標準曲線斜率與尼泊金甲酯標準曲線斜率的比值分別作為這3種化合物的校正因子值；以尼泊金甲酯保留時間為參考對象，以尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯保留時間與尼泊金甲酯保留時間的比值分別作為這3種化合物的相對保留時間t。

由表4可知，尼泊金甲酯回歸方程為y=141742x+281.97，校正因子=123608/141742=0.8721，=124771/141742=0.8803，=100684/141742=0.7103；由校正因子得到尼泊金乙酯校正方程為y=141742+281.97，尼泊金丙酯校正方程為y=141742+281.97，尼泊金丁酯校正方程為y=141742+281.97；相對保留時間為t=1.0851，t=1.1982， t=1.3556。

表4 4種尼泊金酯類線性方程

2.4 校正因子f值耐受性考察

實際應(yīng)用中，色譜條件的變化可能會引起值的變化，試驗考察了不同進樣體積、不同流速對值的影響，設(shè)置進樣體積分別為8.0，10.0，12.0 μL；設(shè)置流速分別為0.4，0.5，0.6 mL/min，考察二者對值的影響，結(jié)果見表5。

表5 校正因子f值耐受性考察

由表5可知，色譜條件常見的變化因子進樣量和流速的變化對校正因子值的影響極小，即校正因子值對可能影響的色譜條件的變化耐受性好。

2.5 方法檢出限及定量限

稱取混勻后的豆瓣醬試樣5.00 g(精確至0.01 g)置于25 mL塑料離心管中，分別加入4種尼泊金酯類標準儲備液各10 μL，其余按照1.6操作，采用S/N=3計算方法檢出限、S/N=10計算方法定量限。

表6 4種尼泊金酯類檢出限及定量限

2.6 方法準確度及精密度試驗

圖1 4種尼泊金酯類色譜圖

稱取18份混勻后的空白豆瓣醬試樣5.00 g(精確至0.01 g)于25 mL塑料離心管中，每6份為一組，向每組中分別加入25，50，200 μL 4種尼泊金酯類標準儲備液，其余按照1.6操作，配成濃度為5，10，40 μg/kg的尼泊金酯類低、中、高濃度試樣。將上述18份溶液注入高效液相色譜儀，將峰面積代入尼泊金甲酯回歸方程，尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯校正方程計算濃度，與實際加標濃度比較并計算RSD值，得4種尼泊金酯類準確度及精密度結(jié)果，見表7。

表7 不同濃度4種尼泊金酯類準確度及精密度結(jié)果(n=6)

續(xù) 表

由表7可知，采用尼泊金甲酯回歸方程，尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯校正方程在5，10，40 μg/kg三水平下回收率、精密度依次為尼泊金甲酯85.4%～95.0%、2.7%～4.9%；尼泊金乙酯86.7%～95.0%、3.0%～3.7%；尼泊金丙酯85.2%～94.0%、2.7%～3.5%；尼泊金丁酯84.8%～96.1%、1.2%～3.7%。由此可知，在常規(guī)加標回收方式下，采用一測多評法計算4種尼泊金酯類物質(zhì)回收率較高、精密度較好，能夠滿足試驗要求。

2.7 供試品溶液及色譜柱穩(wěn)定性試驗

取1 μg/mL的尼泊金酯類低濃度試樣，按照上述測定條件，分別在0，4，8，12，16，20，24 h進樣，考察值變化情況，以RSD表示，用于供試品溶液穩(wěn)定性試驗；將所用的液相色譜柱在無水乙醇中保存，在第30，60，90，120，150，180天使用，考察理論塔板數(shù)，以RSD表示，考察柱效變化情況，用于色譜柱穩(wěn)定性試驗。結(jié)果表明，在24 h內(nèi)=0.85%、=0.64%、=0.54%；在180 d內(nèi)尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯理論塔板數(shù)變化依次為0.4%、0.3%、0.5%、0.3%。說明在24 h之內(nèi)，樣品溶液較為穩(wěn)定；液相色譜柱在180 d之內(nèi)變化均<1.0%，表明液相色譜柱用乙醇作為保存劑較穩(wěn)定。

3 實際樣品的測定

在市面上隨機抽取10種豆瓣醬，按上述方法進行前處理、上機分析，用一測多評法測定這10種豆瓣醬中的尼泊金酯類，結(jié)果見表8。

表8 樣品中4種尼泊金酯類測定結(jié)果

由表8可知，豆瓣醬中主要檢出尼泊金丙酯和尼泊金丁酯，尼泊金甲酯和尼泊金乙酯均未檢出，可能的原因是尼泊金甲酯和尼泊金乙酯疏水性較差，而尼泊金丙酯和尼泊金丁酯疏水性較好，適合油性的豆瓣醬；且尼泊金酯類的抑菌效果隨著烷鏈增長而增強，故在含油脂較多的食品中常檢出尼泊金丙酯和尼泊金丁酯。

4 結(jié)論

試驗建立了以乙醇替代甲醇作為提取溶劑和流動相同時測定豆瓣醬中4種尼泊金酯類的一測多評法，乙醇代替甲醇可以降低甲醇對檢驗員身體的傷害，降低對環(huán)境的危害；以尼泊金甲酯為參考，建立了4種尼泊金酯類的定量模型，可以實現(xiàn)在缺少尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯標準品的情況下對這4種尼泊金酯類的準確測定。試驗考察了乙醇作為流動相時，柱溫及流速的選擇，確定了校正因子值及相對保留時間t；進行了供試品溶液及色譜柱穩(wěn)定性試驗及方法學驗證。試驗表明，此方法簡單、經(jīng)濟、環(huán)保，適用于豆瓣醬中4種尼泊金酯類物質(zhì)的測定。