5種植物半胱氨酸蛋白酶在肉類加工中的研究進(jìn)展

張瓊，鄒強(qiáng)，劉雨蝶

(成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610106)

酶，作為一種高效的生物催化劑，能夠加快生化反應(yīng)速率，在肉制品加工中具有不可替代的作用，肉制品加工中參與的酶種類眾多，基本可分為水解酶、轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶這3大類。半胱氨酸蛋白酶屬于水解酶類中的一個(gè)子集。半胱氨酸蛋白酶在肉制品實(shí)際應(yīng)用中多為植物半胱氨酸蛋白酶，相比于其他動(dòng)物、微生物來(lái)源的半胱氨酸蛋白酶，具有安全、易獲取、易保存、熱穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。因此,早在20世紀(jì)末期，植物半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶就作為食品添加劑中的一員被廣泛應(yīng)用于肉制品加工中。隨著科技的不斷發(fā)展，其余的植物半胱氨酸蛋白酶(菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、獼猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，皆表現(xiàn)出良好的催化水解效果。不僅如此，這些植物半胱氨酸蛋白酶聯(lián)合各種物理干預(yù)方式、化學(xué)試劑、其他酶類在肉制品的加工中應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，其價(jià)值也進(jìn)一步得到提升。因此，我們匯集了近些年來(lái)的相關(guān)研究報(bào)道，認(rèn)為有必要對(duì)以上內(nèi)容做一次綜述，突出其在肉品中的應(yīng)用價(jià)值及潛力。

1 半胱氨酸蛋白酶的簡(jiǎn)介

半胱氨酸蛋白酶(EC3.4.22)，也被稱為硫醇蛋白酶，分子量約為21～30 kDa，其活性中心的催化位點(diǎn)上含有親核的Cys殘基，屬于水解酶中的一大類。半胱氨酸蛋白酶能夠催化水解多種類型的化學(xué)鍵，包括肽鍵、酰胺鍵、酯鍵、硫酯鍵等，作用底物選擇面相對(duì)較廣，總體上表現(xiàn)為廣譜特異性。半胱氨酸蛋白酶從來(lái)源上分為植物半胱氨酸蛋白酶、動(dòng)物半胱氨酸蛋白酶和微生物半胱氨酸蛋白酶。從剪切基團(tuán)上又可進(jìn)一步細(xì)分為外肽酶和內(nèi)肽酶，兩者對(duì)于蛋白底物切割位點(diǎn)的偏愛(ài)有明顯的差異。例如：外肽酶偏向于切割靠近底物末端氨基或羧基的肽鍵，能夠釋放出具有特殊功能和風(fēng)味的氨基酸。而內(nèi)肽酶則偏向于切割遠(yuǎn)離N-或C-末端的肽鍵，能夠生成短肽、部分功能性肽及氨基酸。

2 5種植物半胱氨酸蛋白酶的基本特性

在肉類加工中，常見(jiàn)的植物半胱氨酸蛋白酶主要包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、獼猴桃蛋白酶以及生姜蛋白酶，它們屬于半胱氨酸家族中的內(nèi)肽酶。分別從分子質(zhì)量、來(lái)源、最適活性范圍、活性基團(tuán)、催化作用等方面對(duì)它們的基本特性進(jìn)行了簡(jiǎn)單的概述，見(jiàn)表1和表2。

表1 5種植物半胱氨酸蛋白酶的基本理化特性

表2 5種植物半胱氨酸蛋白酶的基本催化特性

3 5種植物半胱氨酸蛋白酶在肉類加工中的應(yīng)用

3.1 在肉類加工中的使用形式和引入方式

植物半胱氨酸蛋白酶在肉類加工中通常有兩種使用形式：選用商業(yè)酶制劑或富含半胱氨酸蛋白酶的食品來(lái)提供所需的酶類。引入方式大多分為3種：注射、腌制、作為配方原料。商業(yè)酶制劑具有較高的活力和純度，且使用方便，但成本相對(duì)較高。添加含有所需酶類的食品，如菠蘿汁、生姜汁等，使用成本相對(duì)較低，但成分復(fù)雜，可能會(huì)影響加工肉制品的品質(zhì)。以注射方式引入，肉品處理時(shí)間較短，但通常有肉眼可見(jiàn)的組織損傷。腌制則使時(shí)間成本顯著增加，且易受其他不確定因素影響。作為配方原料使用時(shí)，對(duì)加工肉的形態(tài)及環(huán)境有相對(duì)較高的要求，因此在實(shí)際應(yīng)用中常根據(jù)不同的加工方式和產(chǎn)品特性選擇適宜的使用方法和引入方式，以獲得理想的產(chǎn)品。

3.2 肉制品的嫩化

植物半胱氨酸蛋白酶能夠在一定程度上破壞肌纖維和結(jié)締組織的完整性，并在肌原纖維和膠原蛋白層面上實(shí)施降解，進(jìn)而使肉品得到嫩化。Ha等[1]發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、獼猴桃蛋白酶以及生姜蛋白酶均能有效水解牛肉中的肌原纖維和膠原蛋白。Doneva等[2]設(shè)置了木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的不同濃度梯度和處理時(shí)間，結(jié)果表明，兩者之間的主體效應(yīng)顯著影響了火雞肉膠原蛋白的降解。Ramezani等[3]添加無(wú)花果蛋白酶到牛肉香腸中，觀察到肉蛋白的溶解度增加。Aminlari等[4]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃蛋白酶能夠降解牛肉半腱肌中的肌漿和肌球蛋白，蛋白質(zhì)溶解度增加，牛肉嫩度得到改善。Abdel-Naeem等[5]觀察到在添加了0.05%木瓜蛋白酶和5%生姜汁的駱駝肉漢堡肉餅中，膠原蛋白溶解度明顯增加，剪切力值降低。

3.3 制備功能性產(chǎn)品或調(diào)味料的原料

肉類制品在加工過(guò)程中通常會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物和下腳料，同時(shí)市場(chǎng)上也存在許多低值的肉類，植物半胱氨酸蛋白酶則可以將這部分材料轉(zhuǎn)化為具有高附加值的產(chǎn)品，提高其利用率和商業(yè)價(jià)值[6]。植物半胱氨酸蛋白酶能夠降解肌肉中的大分子肉蛋白，生成多肽類物質(zhì)，其中就含有部分功能性肽，可用于制作功能性產(chǎn)品[7]。同時(shí)肉蛋白的深度水解會(huì)釋放出具有特殊功能和風(fēng)味的酯、氨基酸等有機(jī)化合物，可用于制作調(diào)味料。孫曉東等[8]以紅島蛤蜊肉為作用對(duì)象，添加8000 U/g的木瓜蛋白酶，酶解4 h，制備出氨基態(tài)氮含量為0.430 g/mL的海鮮風(fēng)味酶解液，可作為風(fēng)味調(diào)料的原料。Tanuja等[9]添加木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶來(lái)制備蛋白水解物，獲得的產(chǎn)物均顯示出接近90%的自由基清除能力，可作為食品添加劑改善產(chǎn)品的功能及營(yíng)養(yǎng)狀況，將其轉(zhuǎn)化為高端產(chǎn)品。Elavarasan等[10]使用菠蘿蛋白酶水解淡水鯉魚肉制備魚蛋白水解產(chǎn)物，結(jié)果表明，其具有很高的清除DPPH自由基的活性，可作為功能性食品和保健品的原料。劉艷等[11]研究無(wú)花果蛋白酶酶解牡蠣肉，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了牡蠣酶解液的最佳工藝參數(shù)，其所得的酶解液DPPH自由基和OH自由基清除率分別高達(dá)71.80%和16.19%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，可用于抗氧化肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)。

3.4 改善肉制品的風(fēng)味

植物半胱氨酸蛋白酶作用于肉蛋白通常會(huì)產(chǎn)生游離氨基酸等影響肉制品風(fēng)味的前體物質(zhì)或中間產(chǎn)物，有利于加速肉制品風(fēng)味的形成，同時(shí)對(duì)改善肉制品風(fēng)味具有一定的效果[12-13]。肖夏等[14]在牛肉腌制過(guò)程中添加同等比例的木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，不僅改善了牛肉的品質(zhì)，而且牛肉中游離氨基酸、必需氨基酸以及與風(fēng)味相關(guān)的氨基酸含量均明顯上升。陳析等[15]采用0.3%的無(wú)花果蛋白酶作為腌制液，結(jié)果顯示，在6～8 ℃條件下腌制6～8 h，牛肉獲得最佳風(fēng)味。玉素甫·蘇來(lái)曼等[16]添加獼猴桃蛋白酶進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)對(duì)馬肉發(fā)酵香腸成品進(jìn)行感官分析，發(fā)現(xiàn)獼猴桃蛋白酶賦予其特殊的風(fēng)味和口感。卜寧霞等[17]使用姜汁嫩化雞肉干，在最佳工藝參數(shù)下檢測(cè)并分析出烴類、醇類、酮類、醛類、酯類共35種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

4 5種植物半胱氨酸蛋白酶在肉類加工中的發(fā)展趨勢(shì)

隨著人們生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者對(duì)肉類加工產(chǎn)品提出了越來(lái)越高的要求，促使外源酶的應(yīng)用不僅需要突破在肉類加工過(guò)程中的局限性，而且更注重于對(duì)其內(nèi)在潛力和應(yīng)用空間的開發(fā)，因此部分研究人員傾向于將這5種植物半胱氨酸蛋白酶與各種物理干預(yù)方式或多種化學(xué)試劑結(jié)合，甚至與其他酶類形成復(fù)配酶來(lái)共同使用，增大其作用面，最大程度達(dá)到預(yù)期的品質(zhì)效果。酶在肉塊加工工藝中傳統(tǒng)的引入方式有注射和腌制，但無(wú)論采用何種方法，始終都存在酶在肉塊中均勻滲透及分布的問(wèn)題。目前為止，滾揉、超聲波是解決這一問(wèn)題相對(duì)有效的方式。滾揉是一種機(jī)械力，可拉伸肌纖維，促使肌節(jié)變長(zhǎng)，韌性降低，同時(shí)肌內(nèi)膜、肌束膜等包裹和支撐肌肉、筋腱和神經(jīng)的致密性結(jié)締組織因受到外力沖擊而出現(xiàn)松散破碎的現(xiàn)象。酶被注入肉塊后，可隨著滾揉的機(jī)械性動(dòng)作滲透到肉塊的各個(gè)部位，實(shí)現(xiàn)均勻分布。蔣小鋒等[18]向大小為3 cm×3 cm×4 cm的馬肉肉塊中注射菠蘿蛋白酶液，并結(jié)合滾揉處理，獲得了馬肉肉塊整體的最佳嫩化參數(shù)。超聲波是一種聲能，其輸出的能量可通過(guò)調(diào)控設(shè)定的功率和持續(xù)時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)。超聲波在液態(tài)系統(tǒng)中會(huì)產(chǎn)生空化作用，可促進(jìn)介質(zhì)的攪動(dòng)，具有強(qiáng)烈的傳質(zhì)效應(yīng)。使用酶液靜態(tài)腌制肉塊時(shí)，酶基本上聚集在肉塊的表面，沒(méi)有外在的驅(qū)動(dòng)力，很難進(jìn)入到內(nèi)部，因此肉塊內(nèi)部和表層品質(zhì)差異較大，整體處理效果難以把控。采用超聲波和半胱氨酸蛋白酶同步處理肉塊，可將超聲波作為一種推動(dòng)力，促使酶均勻且快速地滲透到肉塊內(nèi)部。Barekat等[19]將牛肉腰最長(zhǎng)肌部位分割為3 cm3的肉塊，同時(shí)采用0.1%的木瓜蛋白酶溶液和頻率為20 kHz的超聲波同步處理30 min，處理后的樣品由表及里人工切割為0.5 cm厚的牛肉切片，通過(guò)對(duì)比每層切片樣品的總蛋白酶水解活性，在光學(xué)顯微鏡以及場(chǎng)外發(fā)射掃描電鏡中觀察到肌纖維結(jié)構(gòu)變化，證明了超聲波能夠協(xié)助木瓜蛋白酶在肉塊中的均勻滲透和分布。植物半胱氨酸蛋白酶與糖類化合物聯(lián)用，對(duì)于肉的口感和風(fēng)味有協(xié)同增效的作用。半胱氨酸蛋白酶降解肉蛋白形成了小肽、游離氨基酸、揮發(fā)性羰基化合物等多種小分子風(fēng)味物質(zhì)，這些風(fēng)味物質(zhì)易與肉制品中添加的糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)，進(jìn)而生成新的風(fēng)味化合物和呈味物質(zhì)。劉劭等[20]為了得到更好的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，確定了最佳反應(yīng)條件：木瓜蛋白酶和D-木糖添加量分別為1.8 mg/g和3%，水解和美拉德反應(yīng)時(shí)間分別為35 min和45 min，生成了大量類黑精的前體物質(zhì)和中間產(chǎn)物。植物半胱氨酸蛋白酶與不同酶類之間具有協(xié)同作用，酶類復(fù)配可多位點(diǎn)水解肉蛋白，獲得多樣化水解產(chǎn)物，提升肉類加工過(guò)程中產(chǎn)生的邊角料的利用率。就蛋白酶而言，不同種類的蛋白酶作用的蛋白底物也不盡相同。如:半胱氨酸蛋白酶類主要水解甘氨酸、賴氨酸和精氨酸等蛋白底物；金屬蛋白酶類主要水解苯丙氨酸、亮氨酸和色氨酸等蛋白底物；絲氨酸蛋白酶類主要水解賴氨酸、精氨酸等蛋白底物。李園等[21]以牡蠣肉為原料，用雙酶(無(wú)花果蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)水解制備的酶解液具有較高的抗氧化性和蛋白質(zhì)回收率，解決了單酶水解中水解度低的問(wèn)題。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著技術(shù)的不斷革新，以上5種植物半胱氨酸蛋白酶的潛力被陸續(xù)開發(fā)，在肉制品加工中的使用面和作用范圍不斷增加，將為我國(guó)肉類行業(yè)在降低成本、提高肉制品質(zhì)量等方面取得更大的成就。但與此同時(shí)，不可忽略的是社會(huì)的發(fā)展也會(huì)帶來(lái)消費(fèi)者更多的訴求，促使肉類加工者考慮到更多的因素，肉類加工也將面臨更多的難題。因此，未來(lái)這些植物半胱氨酸蛋白酶如何突破工業(yè)化應(yīng)用上的各種限制來(lái)提高其實(shí)用性，最終創(chuàng)造收益將是一直存在的挑戰(zhàn)。