農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建

王民炎，俞文仙，趙耘霄，陳益存，高 暝，吳立文，吳善群，汪陽(yáng)東*

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2. 南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037；3. 杭州市富陽(yáng)區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 杭州 311400；4. 福建省大田縣森林資源管理站，福建 大田 366100)

山蒼子（Litsea cubeba(Lour) Pers.）為樟科（Lauraceae）木姜子屬（LitseaLam.）落葉灌木或小喬木，是我國(guó)重要的香料植物資源之一。其植物精油具有特殊的芳香氣味及抗菌、抗蟲(chóng)、抗氧化等多種特征，被廣泛用于香料、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)[1-3]。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及山蒼子基因組圖譜的完成，有助于解讀山蒼子中基因在各個(gè)組織、器官、個(gè)體在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)差異，全面理解基因分子生物學(xué)功能[4-5]。開(kāi)展山蒼子基因功能研究，將山蒼子中重要的功能基因?qū)氲缴缴n子植株中進(jìn)行表型鑒定和挖掘，已成為一種主要方法，其中組培再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是重要研究?jī)?nèi)容。

植物再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，不同外植體再生能力有較大差異，尤其是木本植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、再生困難，通過(guò)調(diào)整外源激素比例可提高其再生效率[6-9]。目前，有關(guān)山蒼子的腋芽器官離體再生和愈傷誘導(dǎo)研究已有一定的進(jìn)展[10-13]，但由于遺傳轉(zhuǎn)化體系的缺乏，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行山蒼子遺傳改良的研究尚未展開(kāi)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是植物遺傳轉(zhuǎn)化采用最多的一種方法，具有成本低、操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法原理：植物受傷部位產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)（乙酰丁香酮等），在酚類(lèi)物質(zhì)誘導(dǎo)下農(nóng)桿菌聚集和vir誘導(dǎo)因子表達(dá)，促進(jìn)T-DNA復(fù)合物產(chǎn)生，然后T-DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞的基因組中[14-15]。遺傳轉(zhuǎn)化步驟主要包括農(nóng)桿菌液準(zhǔn)備、侵染和共培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化組織的篩選和分化、轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)[16-19]。在篩選培養(yǎng)階段至少需要添加兩種抗生素進(jìn)行篩選，一種能抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，另一種能殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞并保留轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞。頭孢霉素能顯著抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，對(duì)植物生長(zhǎng)影響較小，而潮霉素能顯著殺死未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞組織，大幅降低假陽(yáng)性的產(chǎn)生，這兩種抗生素被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化[20-22]。然而，如抗生素濃度使用過(guò)度，會(huì)影響愈傷組織的正常生長(zhǎng)和分化，甚至造成已轉(zhuǎn)化成功愈傷組織的死亡，且不同植物對(duì)抗生素忍耐性不同[23]。因此，選擇合適的抗生素濃度能顯著提升遺傳轉(zhuǎn)化的效率。

本研究以快繁的無(wú)菌組培苗為試驗(yàn)材料，進(jìn)一步優(yōu)化山蒼子組培再生過(guò)程，研究頭孢霉素和潮霉素對(duì)山蒼子再生的影響，初步建立山蒼子的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為山蒼子種質(zhì)資源繁育及基因功能研究和遺傳改良提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

本研究以‘安徽3號(hào)’優(yōu)株為山蒼子組培苗材料，采集杭州市富陽(yáng)區(qū)新沙島繁育基地的當(dāng)年生帶芽莖段為外植體，經(jīng)過(guò)消毒處理后在繼代培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽20～30 d左右，取不定芽更換至新的繼代培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，以繼代培養(yǎng)3～5 cm高的無(wú)菌苗進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)及生根等試驗(yàn)，具體消毒過(guò)程及苗繼代培養(yǎng)基的配方參照林麗媛等方法[24]。試驗(yàn)所需農(nóng)桿菌菌株采用LBA4404；載體為pCAMBIA1300-GFP，帶綠色熒光蛋白標(biāo)記（GFP）和潮霉素篩選標(biāo)記；MS固體培養(yǎng)基（M519）；6-BA、IBA、TDZ、NAA、IAA先用1 mol ·L-1NaOH溶解加無(wú)菌水配制成1 mg·mL-1母液并4 ℃保存；卡那霉素、頭孢霉素、潮霉素用無(wú)菌水配制50 mg·mL-1母液并-20 ℃保存，乙酰丁香酮和利福平直接用二甲基亞砜溶解分別配制成200 mg·mL-1、20 mg·mL-1母液并-20 ℃保存。所有培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8，除6-BA、IBA、TDZ、NAA激素外，其余激素和抗生素均滅菌冷卻至50 ℃左右加入。

1.2 山蒼子再生體系的建立

1.2.1 外源激素對(duì)愈傷組織分化的影響 將長(zhǎng)至3～5 cm高的幼嫩組培苗去掉葉片和芽并切成0.5 cm左右的莖段，用鑷子將莖段夾至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（MS 4.43 g + 蔗糖30 g + 瓊脂粉7.5 g +6-BA 2.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1，pH 5.8），弱光培養(yǎng)3周，然后弱光繼代培養(yǎng)1周。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將繼代培養(yǎng)1周的愈傷組織接種至含有3種不同濃度的激素組合6-BA（0.1～2.0 mg·L-1）、IBA（0.01～0.10 mg·L-1）、TDZ（0.01～0.50 mg·L-1）MS培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，觀察愈傷組織生長(zhǎng)和出芽情況。每個(gè)組合30個(gè)愈傷組織，進(jìn)行3次以上獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.2 外源激素對(duì)組培苗生根的影響 將長(zhǎng)至3～5 cm高的幼嫩組培苗去掉基部的大部分愈傷組織，接種至含有3種不同濃度的激素組合NAA、6BA、IBA的1/2 MS培養(yǎng)基（1/2 MS 2.17 g + 蔗糖20 g，pH 5.8），光照培養(yǎng)并觀察苗狀態(tài)。

1.3 抗生素濃度的選擇

1.3.1 頭孢霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響 將誘導(dǎo)0.5 cm左右的莖段接種至含有0、200、300、500 mg·L-1頭孢霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，觀察愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3.2 潮霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響 將誘導(dǎo)0.5 cm左右的莖段和繼代培養(yǎng)1周后的愈傷組織分別接種至含有0、5、10、20、30、50 mg·L-1潮霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化

1.4.1 農(nóng)桿菌菌液的制備 將目的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，2 d后挑單菌落接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg·L-1卡那霉素，20 mg·L-1利福平），28 ℃下200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取1 mL轉(zhuǎn)移至100 mL含相同抗生素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 h左右，至菌液OD值在0.5～0.8之間，3500 g離心5 min，用侵染液懸浮農(nóng)桿菌OD600至0.6～0.8左右（MS 2.22 g·L-1+ 20 g·L-1蔗糖 + 10 g·L-1葡萄糖 + 10 mmol ·L-1MES + 200 mg·L-1AS）。

1.4.2 侵染及共培養(yǎng) 選取繼代培養(yǎng)1周長(zhǎng)勢(shì)良好且鮮嫩的愈傷組織放入侵染液中侵染30 min，用漏勺將侵染后的愈傷組織放至無(wú)菌濾紙吸干多余水分，接種至共培養(yǎng)基中（MS 4.43 g·L-1+ 30 g·L-1蔗糖 + 10 g·L-1葡萄糖 + 1 mg·L-16BA + 0.1 mg·L-1IBA + 0.5 mg·L-1TDZ + 200 mg·L-1AS），于22～25 ℃暗培養(yǎng)2～3 d。

1.4.3 脫菌及篩選培養(yǎng) 將共培養(yǎng)好的愈傷放入無(wú)菌水中清洗3次，每次5 min，再用含300 mg·L-1頭孢霉素的無(wú)菌水清洗3次，每次5 min。放置無(wú)菌濾紙上完全干燥后，夾至篩選培養(yǎng)基中（MS4.43 g·L-1+ 30 g·L-1蔗糖 + 1 mg·L-16BA + 0.1 mg·L-1IBA + 300 mg·L-1頭孢霉素 + 5 mg·L-1潮霉素）。光照條件下篩選培養(yǎng)至剛好可見(jiàn)新的愈傷，然后不斷降低頭孢霉素濃度、增加潮霉素篩選濃度對(duì)抗性愈傷組織進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每15 d更換培養(yǎng)基。

1.4.4 誘導(dǎo)抗性愈傷組織分化 將1～2 cm抗性愈傷組織接種至愈傷分化培養(yǎng)基中（MS 4.43 g·L-1+ 30 g·L-1蔗糖 + 2 mg·L-16BA + 0.01 mg·L-1IBA + 0.05 mg·L-1TDZ）誘導(dǎo)不定芽，將分化出的芽接種至含20 mg·L-1潮霉素的繼代培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)繁。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

1.5.1 PCR鑒定 提取3 cm以上抗性苗葉片DNA（共16株），設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，第1對(duì)引物為插入基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為904 bp（21/MAD31-272 bp PF: ATGAATCTGTGCAGT GAAGAAGGAA和eGFP-79 bp PR: CGTCGCCG TCCAGCTCGACCAG）；第2對(duì)引物為潮霉素基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為506 bp（PF: GCGTCTGCT GCTCCATACA和PR: TGACATTGGGGAGTTTA GCG）；第3對(duì)引物為T(mén)-DNA插入?yún)^(qū)外的卡那霉素基因片段，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為443 bp（PF: ATG TTGCTGTCTCCCAGGTCG和CGGTATAAAGG GACCACCTATGA）。

1.5.2 Southern Blot印跡雜交檢測(cè) DNA提取方法參考艾德萊公司試劑盒說(shuō)明書(shū)，Southern雜交檢測(cè)流程如下：取轉(zhuǎn)化得到的抗性愈傷組織和未轉(zhuǎn)化野生型愈傷組織的DNA，各 10 ug，采用Hind III限制酶酶切回收后，按照羅氏公司Southern Blot雜交試劑盒說(shuō)明書(shū)DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I，依次進(jìn)行DNA電泳分離和轉(zhuǎn)膜、使用地高辛標(biāo)記的潮霉素基因進(jìn)行雜交、洗膜和顯色、拍照等步驟。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素對(duì)山蒼子組培再生的影響

2.1.1 外源激素對(duì)山蒼子愈傷組織分化的影響 誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的山蒼子愈傷組織置于6-BA、IBA、TDZ 3種不同激素配比培養(yǎng)基下培養(yǎng)。試驗(yàn)顯示：6-BA濃度在1.0～2.0 mg·L-1時(shí)的愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)較好，且能保持持續(xù)分裂；IBA濃度在0.1 mg·L-1左右時(shí)有利于愈傷組織的增殖繼代，而在0.01 mg·L-1IBA低濃度時(shí)有利于愈傷組織的分化；TDZ有助于細(xì)胞生長(zhǎng)及分裂，在加入0.05～0.50 mg·L-1TDZ后，愈傷組織表現(xiàn)出持續(xù)生長(zhǎng)和分化，有效防止了褐化。外源激素組合為1.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1IBA + 0.5 mg·L-1TDZ有利于愈傷增殖繼代培養(yǎng), 愈傷組織僅在2.0 mg·L-16-BA + 0.01 mg·L-1IBA + 0.05 mg·L-1TDZ激素組合下出現(xiàn)分化，分化率在16.67%～36.67%之間（表1）。

表1 外源激素對(duì)山蒼子愈傷組織分化的影響Table 1 Effects of exogenous hormones on callus differentiation in L. cubeba

2.1.2 外源激素對(duì)山蒼子組培苗生根的影響 將長(zhǎng)至高3～5 cm的山蒼子無(wú)菌苗去除基部愈傷組織，置于不同濃度的NAA、IBA、IAA配比下進(jìn)行生根誘導(dǎo)。結(jié)果表明：NAA不能誘導(dǎo)苗生根，而IBA在適宜濃度下能誘導(dǎo)苗生根，但生根率較低，且基部有愈傷形成，阻礙了養(yǎng)分的運(yùn)輸及根的形成，導(dǎo)致葉片掉落，苗生長(zhǎng)狀態(tài)差。在培養(yǎng)基中僅添加IAA時(shí)植株生長(zhǎng)狀態(tài)較好，基部無(wú)愈傷組織形成，在0.5 mg·L-1IAA時(shí)生根率達(dá)97.33%（表2）。

2.2 抗生素臨界濃度的選擇

2.2.1 頭孢霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響 頭孢霉素能抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，濃度范圍一般控制在200～500 mg·L-1，濃度低于200 mg·L-1不能有效抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，濃度高于500 mg·L-1時(shí)影響愈傷的生長(zhǎng)及分化。本試驗(yàn)在0、200、300、500 mg·L-1不同頭孢霉素濃度下誘導(dǎo)莖段愈傷，在濃度200～300 mg·L-1時(shí)愈傷組織顏色鮮綠保持正常，與不添加頭孢霉素保持一致。在濃度500 mg·L-1時(shí)愈傷組織顏色比正常愈傷更為深綠，出現(xiàn)老化狀態(tài)。因此，篩選培養(yǎng)前期選擇頭孢霉素濃度300 mg·L-1作為農(nóng)桿菌抑制濃度，后期應(yīng)不斷降低頭孢霉素濃度，防止對(duì)愈傷分化產(chǎn)生影響（表3）。

表3 不同濃度頭孢霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of different concentrations of cefotaxime on callus induction and growth

2.2.2 潮霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響 潮霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)影響較大，潮霉素濃度在5 mg·L-1時(shí)，能很大程度地誘導(dǎo)愈傷組織，但愈傷組織整體狀態(tài)差且誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后愈傷組織全部褐化；隨著潮霉素濃度的增加，其濃度10 mg·L-1時(shí)已不能誘導(dǎo)愈傷組織（表4）。將繼代培養(yǎng)1周后的愈傷組織在含潮霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，隨著潮霉素濃度的增加愈傷組織死亡越多，10 mg·L-1濃度下愈傷組織出現(xiàn)大面積褐化死亡，濃度30 mg·L-1的愈傷組織表面已無(wú)可見(jiàn)愈傷。因此，綜合考慮遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中多步驟操作及農(nóng)桿菌對(duì)愈傷的影響，以潮霉素濃度5 mg·L-1為第1次篩選濃度，持續(xù)時(shí)間為7～10 d，潮霉素濃度20～30 mg·L-1作為愈傷組織臨界篩選濃度，持續(xù)時(shí)間應(yīng)不短于2個(gè)月。

表4 潮霉素對(duì)山蒼子愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of hygromycin on callus induction and growth of L. cubeba

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

山蒼子農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化流程見(jiàn)圖1。首先在光照條件下誘導(dǎo)愈傷組織約21 d，并繼代培養(yǎng)7～10 d，然后采用農(nóng)桿菌侵染繼代培養(yǎng)后的愈傷組織30 min，放置于無(wú)菌濾紙上超凈臺(tái)吹干至愈傷組織表面無(wú)水分；將侵染后愈傷組織轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基黑暗共培養(yǎng)2～3 d至剛好肉眼可見(jiàn)農(nóng)桿菌，立即用頭孢霉素清洗愈傷組織并吹干，此處應(yīng)完全吹干至愈傷組織表面發(fā)白為止，防止農(nóng)桿菌污染；轉(zhuǎn)移愈傷組織至含5 mg·L-1潮霉素篩選培養(yǎng)基初步篩選抗性愈傷組織30 d左右，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含30 mg·L-1潮霉素進(jìn)行繼代培養(yǎng)約60 d；最后將新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織在10 mg·L-1潮霉素下進(jìn)行抗性愈傷組織分化約30～60 d，并將誘導(dǎo)出的芽繼代培養(yǎng)約60～90 d。從農(nóng)桿菌侵染愈傷組織至產(chǎn)生抗性幼苗需要約7～9個(gè)月時(shí)間。

圖1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化流程Fig. 1 Agrobacterium mediated genetic transformation process of L. cubeba

陽(yáng)性苗的驗(yàn)證首先采用PCR檢測(cè)目的基因的方法，共檢測(cè)了16株抗性幼苗，利用第1對(duì)和第2對(duì)引物均擴(kuò)增出目的條帶，送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序拼接后，與插入基因和載體的序列比對(duì)完全正確和無(wú)移碼突變，表明目的基因已插入山蒼子基因組中（圖2）。且通過(guò)第3對(duì)引物擴(kuò)增未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明沒(méi)有農(nóng)桿菌質(zhì)粒的干擾，排除了假陽(yáng)性的存在（圖2）。共計(jì)轉(zhuǎn)化了300個(gè)左右愈傷組織，得到約80個(gè)抗性愈傷，共2個(gè)愈傷分化，得到38株幼苗，轉(zhuǎn)化率為0.67%。

圖2 轉(zhuǎn)基因幼苗的PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of transgenic plants

PCR結(jié)果主要是利用特異性引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可能存在一定的假陽(yáng)性。而Southern雜交法是當(dāng)前鑒定外源基因整合及表達(dá)的權(quán)威方法，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、假陽(yáng)性低的優(yōu)點(diǎn)。因此，通過(guò)Southern雜交試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因是否插入山蒼子基因組中。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織中有陽(yáng)性條帶，外源基因已插入山蒼子基因組中（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)基因愈傷組織Southern鑒定Fig. 3 Southern identification of transgenic callus

3 討論

3.1 高效穩(wěn)定的山蒼子組培再生體系

山蒼子育種主要以提高果實(shí)產(chǎn)量及其品質(zhì)為目標(biāo)，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)能將外源目的基因?qū)肷缴n子中進(jìn)行遺傳改良，有助于提高果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)，創(chuàng)制新的優(yōu)良種質(zhì)資源。山蒼子全基因組測(cè)序的完成，對(duì)全面解析和利用山蒼子基因分子生物學(xué)功能具有重要意義[4]。目前山蒼子轉(zhuǎn)基因體系尚未建立，高效穩(wěn)定的離體再生體系又是影響遺傳轉(zhuǎn)化成功的一個(gè)重要因素。已有文獻(xiàn)報(bào)道中愈傷分化率較低，易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象且不穩(wěn)定，不利于開(kāi)展山蒼子基因功能的研究[24]。因此，本研究?jī)?yōu)化了莖段組織離體再生過(guò)程并初步建立山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化流程。

不同植物再生效率具有較大差異，可通過(guò)調(diào)整激素的種類(lèi)及配比促進(jìn)植株再生[25-26]。細(xì)胞分裂素能增強(qiáng)細(xì)胞的分裂與膨大，生長(zhǎng)素促使細(xì)胞的伸長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素比例較高時(shí)能促進(jìn)芽的分化，比例適中有利于愈傷組織的誘導(dǎo)與苗的生長(zhǎng)，比例較低時(shí)促進(jìn)根的生長(zhǎng)[27-29]。先前研究表明，山蒼子愈傷組織誘導(dǎo)最適激素比例6-BA∶IBA為20∶1[24]。本試驗(yàn)結(jié)果中也得到證實(shí)，6-BA濃度低于1.0 mg·L-1時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)較差，6-BA∶IBA比例在10∶1至20∶1時(shí)能誘導(dǎo)愈傷組織且正常生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)降低IBA濃度使細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素比例達(dá)到200∶1時(shí)愈傷組織開(kāi)始分化形成不定芽，而低于此比例愈傷不分化。因此，山蒼子愈傷組織誘導(dǎo)生長(zhǎng)培養(yǎng)基6-BA濃度采用2.0 mg·L-1，IBA濃度采用0.1 mg·L-1，在愈傷分化階段應(yīng)提高6-BA∶IBA的比值，采用2.0 mg·L-16BA和0.01 mg·L-1IBA濃度。TDZ是一種多功能性人工合成的植物類(lèi)激素，能誘導(dǎo)芽和愈傷組織的形成與增殖，促進(jìn)體細(xì)胞胚的發(fā)生，降低褐化，被廣泛應(yīng)用于木本植物組織培養(yǎng)[30-31]。山蒼子愈傷組織分化較困難，長(zhǎng)期培養(yǎng)易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。先前山蒼子組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，僅添加6-BA和IBA的激素組合，愈傷組織不能保持持續(xù)的增殖繼代，而本研究中添加0.05～0.50 mg·L-1濃度范圍的TDZ后能有效地保存愈傷組織的繼代繁殖能力，褐化現(xiàn)象降低。同時(shí)，只有在TDZ存在時(shí)，愈傷組織才能分化出不定芽，表明TDZ是一種對(duì)山蒼子高效再生的激素，在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

不定芽生根是組培再生過(guò)程形成完整植株的重要步驟，發(fā)達(dá)粗壯的根系有利于幼苗的移栽成活和植株的生長(zhǎng)。細(xì)胞分裂素能抑制植株生根，而生長(zhǎng)素有利于植株生根[32-34]。已有山蒼子組培生根文獻(xiàn)報(bào)道中，NAA、IBA、IAA 3種生長(zhǎng)激素不同組合均能誘導(dǎo)生根，但生根過(guò)程中植株下部葉片脫落，基部有愈傷形成，根數(shù)量少且形成一個(gè)長(zhǎng)的主根，移栽成活率低[11-12,35-36]。本研究3種激素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IAA有助于山蒼子不定芽生根，單獨(dú)添加IAA誘導(dǎo)生根率達(dá)97.33%，且較少有葉片的衰老掉落現(xiàn)象。這可能是誘導(dǎo)生根過(guò)程中，在不定芽底部產(chǎn)生傷口后，添加高活性生長(zhǎng)素NAA、IBA誘導(dǎo)了愈傷組織形成，阻礙整個(gè)植株吸收培養(yǎng)基養(yǎng)分，表現(xiàn)出葉片掉落，甚至出現(xiàn)植株死亡的現(xiàn)象（活性NAA>IBA>IAA）。試驗(yàn)中基本無(wú)側(cè)根產(chǎn)生，但移栽穴盆1個(gè)月后能產(chǎn)生大量的側(cè)根，形成發(fā)達(dá)的根系。原因可能是植物具有適應(yīng)環(huán)境的能力，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分比在土壤中更易吸收，不需要產(chǎn)生更多的側(cè)根吸收營(yíng)養(yǎng)來(lái)保證植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育，或由于培養(yǎng)基中某種元素成分相對(duì)豐富抑制了側(cè)根的發(fā)育，具體原因有待研究。同時(shí)存在誘導(dǎo)生根過(guò)程中過(guò)小的苗大部分死亡，過(guò)大組培苗也不能誘導(dǎo)生根的現(xiàn)象，且移栽成活率不高。因此，應(yīng)充分考慮植株大小、生根時(shí)間和移栽過(guò)程，提高植株存活率。

3.2 山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中抗生素臨界濃度的選擇十分重要?？股貪舛冗^(guò)高不利于愈傷組織的分化及芽的正常生長(zhǎng)，過(guò)低不能有效篩選出抗性植株。頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌抑制范圍一般選擇在200～500 mg·L-1[37-39]。本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)頭孢霉素濃度在500 mg·L-1時(shí)愈傷組織顏色較深綠，成熟過(guò)早不利于愈傷的分化。200～300 mg·L-1濃度范圍愈傷組織與不添加頭孢霉素?zé)o顯著性差異，因此選擇頭孢霉素濃度300 mg·L-1作為農(nóng)桿菌臨界濃度，但后期步驟中應(yīng)不斷降低濃度，減少頭孢霉素對(duì)愈傷分化增殖的影響。

潮霉素能顯著抑制非轉(zhuǎn)化植株的生長(zhǎng)，假陽(yáng)性低，被廣泛應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化體系中，且隨轉(zhuǎn)化過(guò)程不斷調(diào)整抗生素濃度，以達(dá)到最佳轉(zhuǎn)化目的。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中，一般采用先高后低的原則，即先使用高濃度潮霉素最大程度地殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，降低后期篩選的工作量，保證極少的嵌合體存在。而后因潮霉素不斷累積毒害作用，應(yīng)適當(dāng)降低潮霉素濃度，保證愈傷分化及芽的生長(zhǎng)[40-43]。本試驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在篩選培養(yǎng)初期階段，由于采用高濃度的潮霉素和農(nóng)桿菌對(duì)愈傷的雙重毒害，愈傷褐化嚴(yán)重，并局部出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化的愈傷已不能存活。因此，在高濃度潮霉素篩選前，先采用5 mg·L-1低濃度潮霉素預(yù)篩選7～10 d左右，保證已轉(zhuǎn)化愈傷的正常生長(zhǎng)，再使用30 mg·L-1高濃度潮霉素進(jìn)行篩選，愈傷20～30 d后有抗性愈傷的產(chǎn)生。

在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的頻率較低，通常只有小部分細(xì)胞獲得了外源DNA，而目的整合到基因組并實(shí)現(xiàn)表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞則更少。必須采用多種方法反復(fù)印證，才能精確篩選和鑒定出轉(zhuǎn)基因植株，包括基因組、轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上的檢測(cè)。PCR檢測(cè)具有方便快速、需求更少樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株驗(yàn)證的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)前期采用PCR方法對(duì)插入片段進(jìn)行檢測(cè)，較準(zhǔn)確地篩選出陽(yáng)性植株且測(cè)序驗(yàn)證，并大概率排除了農(nóng)桿菌殘留的污染。但PCR檢測(cè)仍可能存在假陽(yáng)性，某些未轉(zhuǎn)化植株操作在DNA提取過(guò)程中的污染也能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。Southern雜交法是進(jìn)行核酸序列分析、重組子鑒定及檢測(cè)外源基因整合表達(dá)的有力手段，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可清除操作過(guò)程中的污染以及轉(zhuǎn)化愈傷組織中質(zhì)粒殘留所引起的假陽(yáng)性信號(hào)[44-45]。本研究中，通過(guò)Southern雜交方法檢測(cè)到陽(yáng)性條帶，證實(shí)了目的基因已插入山蒼子基因組中。山蒼子是一種次生代謝產(chǎn)物豐富的木本油料植物，在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中極易產(chǎn)生褐化導(dǎo)致遺傳轉(zhuǎn)化困難，轉(zhuǎn)化效率較低。因此，后續(xù)將進(jìn)一步提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率，如侵染農(nóng)桿菌菌液濃度、時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間及AS濃度的條件優(yōu)化，尤其在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中減少愈傷組織褐化方面進(jìn)行重點(diǎn)研究。

4 結(jié)論

植物組培再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系是培育優(yōu)良種質(zhì)資源的重要基礎(chǔ)。本研究?jī)?yōu)化了山蒼子組培再生體系，愈傷分化率為16.67%～36.67%，生根率為97.33%。對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行初步研究，確定了遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中最適頭孢霉素和潮霉素濃度，且已成功將目的基因?qū)肷缴n子基因組中，初步建立山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步開(kāi)展基因功能研究及遺傳改良提供了技術(shù)支持。