響應(yīng)面法優(yōu)化森吉木霉M75菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件

張 銘，寧少華，高 茜，謝 憲，程 元，梁 軍*

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所，國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 北京市西山試驗(yàn)林場(chǎng)，北京 100093)

松枯梢病（又名松梢枯病 shoot blight of pine）是世界范圍內(nèi)針葉樹種上分布最廣最常見的重要林木枝干病害之一[1]。自從我國自20世紀(jì)70年代末報(bào)道以來，松枯梢病已蔓延至黑龍江、吉林、遼寧、陜西、江蘇、湖北、福建、安徽、江西、廣東和廣西等10余個(gè)省份[2]，嚴(yán)重危害松屬（Pinus）、冷杉屬（Abies）、落葉松屬（Larix）、崖柏屬（Thuja）、雪松屬（Cedrus）、刺柏屬（Juniperus）、云杉屬（Picea）和黃杉屬（Pseudotsuga）約8屬60多種針葉樹種[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)的森吉木霉（Trichoderma songyi）M75菌株的無菌發(fā)酵濾液對(duì)赤松枯梢病病原菌松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea）具有較好的抑菌活性[4]，如果能繼續(xù)優(yōu)化提高森吉木霉M75的抑菌活性，這一菌株在病害防治領(lǐng)域的應(yīng)用將大有前景。但目前還未見有關(guān)森吉木霉M75的發(fā)酵優(yōu)化研究。響應(yīng)面優(yōu)化（Response Surface method）是最常見的應(yīng)用于真菌發(fā)酵領(lǐng)域的研究方法[5]。這種方法比單因素試驗(yàn)和正交分析試驗(yàn)更全面，利用擬合因素和相應(yīng)值之間的多元二次函數(shù)關(guān)系[6]，通過3D曲面圖和2D等高線圖直觀的展示出各因子之間的交互作用，而非簡單的線性關(guān)系[7]，其最大的優(yōu)勢(shì)是大大減少了試驗(yàn)次數(shù)，利用合理的理論范圍內(nèi)較少的試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件，減輕了發(fā)酵優(yōu)化的工作量[8]，也提高了優(yōu)化的準(zhǔn)確性和合理性[9]，是目前發(fā)酵領(lǐng)域應(yīng)用最多的一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析方法[10]。本研究通過Plackett-Burman試驗(yàn)從眾多因素中篩選得到顯著影響抑菌活性的關(guān)鍵因子[11]，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)使關(guān)鍵因子的取值逐步逼近響應(yīng)面的中心點(diǎn)[12]，最后利用響應(yīng)面分析法中的中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD法）確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配比[13]，最大程度的提高森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌活性。本研究通過PB試驗(yàn)、最陡爬坡以及響應(yīng)面分析等多種試驗(yàn)方法，更全面準(zhǔn)確的尋求最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的配比及培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高森吉木霉M75的抑菌效能，使生防菌株在松枯梢病的防治過程中得到更高效的利用，同時(shí)為今后大量獲取抑菌活性物質(zhì)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

松球殼孢菌（S. sapinea）由中國林業(yè)科學(xué)研究院菌種保藏中心提供。森吉木霉（T. songyi）M75由本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得，現(xiàn)保藏于中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)：CFCC54490。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液制備 將保藏的M75菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃活化5 d，用打孔器選取直徑5 mm菌餅，接入裝有250 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r·min-1、28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，10000 r·min-14 ℃離心10 min，棄沉淀，取上清液經(jīng)0.45 μm無菌微孔濾膜過濾，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌試驗(yàn)方法 取1.5 mL1.2.1中得到的M75無菌發(fā)酵濾液，與加熱并冷卻至45～50 ℃的PDA培養(yǎng)基混合均勻并傾倒平板。待平板凝固后，在平板中央點(diǎn)接活化后的直徑5 mm的松球殼孢菌菌餅，以添加無菌水制備的平板作為對(duì)照。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測(cè)量松球殼孢菌的菌落直徑。所有處理重復(fù)3次，抑菌率計(jì)算公式如下：

1.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)確定顯著因素 利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)[14]對(duì)影響森吉木霉M75菌株抑菌活性的8個(gè)因素進(jìn)行顯著性篩選，包括葡萄糖（A）、胰蛋白胨（B）、硫酸鋅（C）、溫度（D）、轉(zhuǎn)速（E）、接種量（F）、裝液量（G）和培養(yǎng)時(shí)間（H）。各因素分別設(shè)置兩個(gè)水平，即高水平（+1）和低水平（-1），各因素水平值見表1。以森吉木霉M75發(fā)酵培養(yǎng)后的無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌率作為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)12組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)處理3次，抑菌率取3次平均值。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各因素的水平值Table 1 Levels of the variables of Plackett-Burman design

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液抑菌活性有顯著影響的3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，使各因素響應(yīng)值進(jìn)一步逼近最優(yōu)區(qū)域并確定CCD設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)[15]。對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析確定出擬合方程后，依據(jù)系數(shù)的正負(fù)和大小確定3個(gè)顯著因素的最陡爬坡，其中3個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)無菌發(fā)酵濾液抑菌活性的正負(fù)值決定了爬坡方向，3個(gè)關(guān)鍵因素在方程中的相應(yīng)系數(shù)的大小決定爬坡步長值[16]。賦響應(yīng)值（Y）為森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌率（%）。共設(shè)計(jì)7組爬坡試驗(yàn)，各組重復(fù)檢測(cè)3次，對(duì)所得結(jié)果取平均值計(jì)算抑菌率。

1.2.5 中心復(fù)合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD） 根據(jù)PB試驗(yàn)確定影響抑菌率的關(guān)鍵因素、最陡爬坡試驗(yàn)確定了關(guān)鍵因素取值的中心試驗(yàn)點(diǎn)之后，利用中心復(fù)合設(shè)計(jì)法（Central Composite Design，CCD）建立3因素5水平的響應(yīng)面模型[17]，賦響應(yīng)值Y為森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌率，共設(shè)計(jì)20組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)處理3次，抑菌率取3次平均值。利用Design Expert 11.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合回歸分析，建立二次回歸方程，通過響應(yīng)面分析方法擬合出抑菌率的最大響應(yīng)值，從而得到使森吉木霉M75的無菌發(fā)酵濾液達(dá)到最大抑菌活性的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。

1.3 模型驗(yàn)證與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將森吉木霉M75分別置于利用響應(yīng)面模型擬合出的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，每組試驗(yàn)重復(fù)處理3次，測(cè)定優(yōu)化培養(yǎng)基下的無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌率，驗(yàn)證試驗(yàn)值與模型的理論值是否相一致，對(duì)模型的可靠性和有效性進(jìn)行分析和驗(yàn)證[18]，從而得出最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配比，并對(duì)優(yōu)化前后森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液的抑菌率進(jìn)行比較。采用Design Expert 11.0、SPSS 26.0和Excel 2010軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選顯著影響因子

通過PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)（N=12），對(duì)葡萄糖（A）、胰蛋白胨（B）、硫酸鋅（C）、溫度（D）、轉(zhuǎn)速（E）、接種量（F）、裝液量（G）和培養(yǎng)時(shí)間（H）8個(gè)因素進(jìn)行二水平試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合及結(jié)果見表2，PB試驗(yàn)效應(yīng)評(píng)價(jià)及顯著性分析見表3。

由結(jié)果可知，在第11組試驗(yàn)中，森吉木霉M75發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌效果最好，抑菌率達(dá)到77.33%（表2）。8個(gè)因子的顯著性排序?yàn)闇囟?葡萄糖>轉(zhuǎn)速>裝液量>硫酸鋅>胰蛋白胨>接種量>培養(yǎng)時(shí)間，其中溫度、葡萄糖、轉(zhuǎn)速的顯著性位于前三位，即溫度（D）>葡萄糖（A）>轉(zhuǎn)速（E），且P值均小于0.05，說明這3個(gè)因素為關(guān)鍵因素，能顯著影響森吉木霉M75的無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性，表明其是構(gòu)建響應(yīng)面模型的主要影響因子，將這3個(gè)因素作為主要考慮因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。其中，在選擇的二水平范圍內(nèi)，溫度（D）對(duì)抑菌活性具有負(fù)效應(yīng)，葡萄糖（A）和轉(zhuǎn)速（E）具有正效應(yīng)（表3）。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)組合及結(jié)果Table 2 Design and corresponding results of Plackett-Burman experiment

表3 Placket-Burman試驗(yàn)效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of placket-Burman test effect

標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的帕累托圖（圖1）顯示從最大效應(yīng)到最小效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的絕對(duì)值。在Pareto圖中，溫度（D）、葡萄糖（A）轉(zhuǎn)速（E）跨越了t= 3.182的參考線，表示這3個(gè)因素在a=0.05水平上具有顯著性，Pareto圖結(jié)果與PB試驗(yàn)效應(yīng)評(píng)價(jià)中的顯著性結(jié)果相一致。對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合方程回歸分析，得到多元一次方程：Y=64.686 + 2.884 A - 0.417 B + 0.743 C - 5.811 D+ 2.136 E - 0.071 F - 0.862 G + 0.056 H。該方程的決定系數(shù)（R2）= 0.9913，表明該方程擬合良好。由方程可知，溫度（D）的系數(shù)為負(fù)，提示溫度的取值對(duì)抑菌率的影響效應(yīng)為負(fù)，應(yīng)逐步降低溫度的取值；而葡萄糖（A）和轉(zhuǎn)速（E）的系數(shù)皆為正值，說明增大這兩個(gè)關(guān)鍵變量的取值對(duì)抑菌率的影響效應(yīng)為正，應(yīng)逐步提高葡萄糖的添加量，并相應(yīng)的提高轉(zhuǎn)速。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的帕累托圖Fig. 1 Pareto plot of standarized effects

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB試驗(yàn)中得到多元一次方程，其系數(shù)值決定了最陡爬坡試驗(yàn)中的爬坡方向和爬坡變化的步長值。其中葡糖糖（A）和轉(zhuǎn)速（E）系數(shù)為正，說明增大這兩個(gè)關(guān)鍵變量的取值時(shí)對(duì)響應(yīng)值抑菌率的影響為正效應(yīng)，應(yīng)增大這兩個(gè)關(guān)鍵變量的取值，而溫度（D）的系數(shù)為負(fù)，提示溫度的取值對(duì)響應(yīng)值抑菌率的影響效應(yīng)為負(fù)，應(yīng)逐步降低溫度。其他非顯著性因素的取值保持不變。共設(shè)計(jì)7組最陡爬坡試驗(yàn)（表4），第4組中森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌率最高，即當(dāng)葡糖糖（A）為2.75%，溫度（D）為31 ℃，轉(zhuǎn)速（E）為195 r·min-1時(shí)，抑菌活性達(dá)到最優(yōu)，即在中心試驗(yàn)點(diǎn)附近，以上述條件作為CCD中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and corresponding results of the steepest ascent experiment

2.3 中心組合CCD設(shè)計(jì)

以PB試驗(yàn)中篩選出的3個(gè)關(guān)鍵因素和最陡爬坡試驗(yàn)確定的最優(yōu)中心點(diǎn)進(jìn)行森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液的中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）。其中，將3個(gè)關(guān)鍵因素設(shè)置為5個(gè)水平梯度（-1.68、-1、0、1、1.68），試驗(yàn)因素及水平如表5所示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6所示。對(duì)表6中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸，得到的擬合方程如下：

表5 中心組合（CCD）試驗(yàn)變量及水平Table 5 Variables and levels for central composite design

表6 中心組合（CCD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of central composite design（CCD）

Y= 82.02 + 3.12A + 2.23D - 2.09E - 1.59AD+ 2.56 AE + 1.95DE - 3.76 A2- 8.33 D2- 2.95 E2，其中Y為森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對(duì)松枯梢病原菌的抑菌率，A為葡萄糖，D為溫度，E為轉(zhuǎn)速。

對(duì)擬合的回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表7所示，該回歸方程模型的F值為32.93，P<0.0001，表明模型極顯著，而失擬項(xiàng)Lack of Fit反映試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況，失擬項(xiàng)F值為2.97，P值為0.1284>0.05，表示失擬項(xiàng)是不顯著的，這表示方程擬合較好，模型穩(wěn)定且選擇正確。模型決定系數(shù)R2= 0.9674，說明整體情況的96.74%可以用此模型來解釋，調(diào)整后的相關(guān)性決定系數(shù)AdjR2= 0.9380，預(yù)測(cè)R2= 0.8005，進(jìn)一步表明所擬合的模型具有較高的穩(wěn)定性，對(duì)實(shí)際情況擬合程度良好，可以對(duì)森吉木霉無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性的變化提供一個(gè)合適的模型，也說明各試驗(yàn)因素對(duì)抑菌率的影響并不是呈現(xiàn)簡單的線性規(guī)律，而是二次函數(shù)關(guān)系。

表7 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)擬合模型的方差分析Table 7 Analysis of variance (ANOVA) for the quadratic model of central composite experimental design

2.4 中心組合CCD結(jié)果分析

對(duì)擬合的回歸模型，使用Design Expert 11.0軟件繪制響應(yīng)的3D響應(yīng)面分析圖及對(duì)應(yīng)的2D等高線圖，來探究葡萄糖、溫度與轉(zhuǎn)速之間的相互關(guān)系對(duì)抑菌活性的影響及在得到最高響應(yīng)值（即最大抑菌率時(shí)），3個(gè)因素的取值（圖2～4）。2D等高線圖是回歸方程的圖形表達(dá)形式，即用圖形語言對(duì)各因素的交互關(guān)系及最優(yōu)化條件下的變量進(jìn)行相關(guān)解釋，可直觀的展示出兩因素之間的相互作用及最大響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的各因素的最佳水平。一般情況下3D曲面越明顯彎曲，2D等高線圖越陡，則說明兩因素之間關(guān)系越顯著，反之，若3D曲面不明顯，2D等高線圖越接近于圓形，則說明兩因素之間關(guān)系不顯著。

2.4.1 葡萄糖與溫度的交互作用 如圖2所示，在轉(zhuǎn)速（E）處于零水平時(shí)，葡萄糖（A）與溫度（D）交互的2D等高線圖曲度較緩，呈近似圓形的橢圓形，表示葡萄糖與溫度交互作用不顯著。這與方差分析表7中的結(jié)果相一致（PA*D= 0.0763>0.05）。

圖2 葡萄糖和溫度交互作用效應(yīng)影響森吉木霉M75抑菌活性的3D響應(yīng)曲面圖和2D等高線Fig. 23D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of glucose and temperature on the antibacterial activity of T. songyi M75

2.4.2 葡萄糖與轉(zhuǎn)速的交互作用 如圖3所示，在溫度（D）處于零水平時(shí)，葡萄糖（A）與轉(zhuǎn)速（E）交互的2D等高線圖曲度較陡，呈明顯的橢圓形，表示葡萄糖與溫度交互作用顯著，與方差分析表7中的結(jié)果相一致（PA*E= 0.0099<0.05）。

圖3 葡萄糖和轉(zhuǎn)速交互作用效應(yīng)影響森吉木霉M75抑菌活性的3D響應(yīng)曲面圖和2D等高線Fig. 33D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of glucose and rotating speed on the antibacterial activity of T. songyi M75

2.4.3 溫度與轉(zhuǎn)速的交互作用 如圖4所示，在葡萄糖（A）處于零水平時(shí)，溫度（D）與轉(zhuǎn)速（E）交互的2D等高線圖曲度較陡，呈明顯的橢圓形，表示溫度與轉(zhuǎn)速二者之間的存在顯著的交互作用效果，與表7中的方差檢驗(yàn)結(jié)果一致（PD*E=0.0360<0.05）。

圖4 溫度和轉(zhuǎn)速交互作用效應(yīng)影響森吉木霉M75抑菌活性的3D響應(yīng)曲面圖和2D等高線Fig. 43D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of temperature and rotating speed on the antibacterial activity of T. songyi M75

2.5 模型驗(yàn)證分析

對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化模型及結(jié)果可靠性進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，抑制率均值為81.50%，與模型預(yù)測(cè)的理論值十分接近，說明該模型的設(shè)計(jì)具有可靠性。而優(yōu)化前的抑菌率只有74.47%，優(yōu)化后森吉木霉M75的無菌發(fā)酵濾液的抑菌率提高了9.44%，松球殼孢菌在帶菌平板上的菌落直徑只有1.45 cm，比優(yōu)化前縮減了27.5%，菌落的生長受到更明顯的抑制（圖5）。這也證明了利用中心復(fù)合設(shè)計(jì)法所得到的二次回歸方程模型的有效性，證明了利用響應(yīng)面法優(yōu)化森吉木霉M75的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件是準(zhǔn)確、有效且可行的。

圖5 森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對(duì)松枯梢病原菌的抑菌效果Fig. 5 Ihibition activities of sterile culture filtrates produced by T. songyi M75 against S. sapinea

3 討論

培養(yǎng)條件的優(yōu)化是微生物實(shí)現(xiàn)大批量工業(yè)化生產(chǎn)必不可少的環(huán)節(jié)之一，而不同的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配比對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量密切相關(guān)[19]。利用響應(yīng)面分析法這種優(yōu)化試驗(yàn)條件的科學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，可以準(zhǔn)確的利用較少的試驗(yàn)數(shù)據(jù)模擬出使目標(biāo)對(duì)象達(dá)到最優(yōu)值時(shí)的各因素的條件[20]，可以有效提高優(yōu)化效率與試驗(yàn)進(jìn)程[21]。通過改善和優(yōu)化森吉木霉M75的初始培養(yǎng)基配比及培養(yǎng)條件等，使它的無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑菌率達(dá)到了81.50%，大大提高了抑菌活性，說明利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化森吉木霉產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件是有效可行的。本研究利用PB試驗(yàn)篩選出關(guān)鍵組分，使關(guān)鍵因素的取值逐步逼近中心點(diǎn)，最后利用CCD中心復(fù)合設(shè)計(jì)找到最優(yōu)點(diǎn)，這些因素之間并不是相互獨(dú)立影響抑菌活性，他們之間的交互作用可能會(huì)使抑菌活性有所增減[22]。中心復(fù)合設(shè)計(jì)結(jié)果表明，在葡萄糖、溫度與轉(zhuǎn)速3個(gè)關(guān)鍵因素之間，葡萄糖與溫度之間的交互作用不顯著，說明單純?cè)黾悠咸烟堑暮?，提高溫度，不提升轉(zhuǎn)速，液體培養(yǎng)基中的充足的糖分和氧氣得不到有效利用，就限制了森吉木霉M75產(chǎn)抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量，影響了抑菌活性。而葡萄糖與轉(zhuǎn)速兩關(guān)鍵因子之間的交互作用顯著，溫度與轉(zhuǎn)速兩關(guān)鍵因子之間的交互作用也是顯著的，表明在合適的轉(zhuǎn)速水平上，液體培養(yǎng)基中的糖分和氧氣能被森吉木霉M75菌株得到充分的分解和利用，提高了抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量，從而使此時(shí)的無菌發(fā)酵濾液對(duì)松球殼孢菌的抑制效果達(dá)到最優(yōu)水平。本研究尋求到的適合森吉木霉M75發(fā)酵優(yōu)化的培養(yǎng)基配比及培養(yǎng)條件，為森吉木霉M75菌株作為生防菌株，進(jìn)行后續(xù)的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)，為其生防菌劑的開發(fā)提供了理論支撐。

4 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得一株對(duì)赤松枯梢病病原菌松球殼孢菌具有顯著拮抗作用的森吉木霉菌株M75，通過響應(yīng)面法明確其最優(yōu)抑菌活性的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：葡萄糖2.75%，胰蛋白胨1.2%，硫酸鋅0.2%，馬鈴薯浸汁1000 mL，溫度31.0 ℃、轉(zhuǎn)速195 r·min-1，接種量5%，裝液量180 mL，發(fā)酵培養(yǎng)5 d。優(yōu)化后無菌濾液對(duì)赤松枯梢病病原菌的抑制率達(dá)到81.50%，比優(yōu)化前提高了約10%，病原菌菌落擴(kuò)展直徑從優(yōu)化前的2.0 cm縮減至為1.45 cm，比優(yōu)化前降低了27.5%，抑菌效果得到了大幅提高。