GC-MS分析四川不同產(chǎn)地花椒的代謝成分

花椒是蕓香科植物花椒和青椒的干燥果實(shí)[1]，原產(chǎn)于我國，主要分布于四川省、陜西省、云南省、山西省等多省市地區(qū)[2-3]。其種植歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，在栽培馴化過程中形成了諸多栽培品種（品系），尤以西南地區(qū)最多[4-5]?；ń窔馕肚逑?、麻味濃郁，揮發(fā)性成分（如香氣成分）是花椒的關(guān)鍵品質(zhì)指標(biāo)，已有報(bào)道顯示，青花椒和紅花椒的香氣成分有一定的差異，芳樟醇、檸檬烯為青花椒的主要揮發(fā)成分，芳樟醇、乙酸芳樟酯、乙酸松油酯為紅花椒的主要揮發(fā)性成分[6]。乙酸芳樟酯和α-松油醇是區(qū)分不同產(chǎn)地青花椒的潛在化合物[7]；乙酸芳樟酯和乙酸松油酯是區(qū)分不同產(chǎn)地紅花椒的潛在化合物[8]，而檸檬烯、乙酸松油酯等為南方4產(chǎn)區(qū)紅花椒的主要共有揮發(fā)成分，在不同產(chǎn)區(qū)花椒中含量差異較大[9]。目前對(duì)不同產(chǎn)地、不同品種花椒的品質(zhì)研究愈發(fā)關(guān)注，本文收集了產(chǎn)自四川各地的13種花椒樣品，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）非靶向檢測(cè)技術(shù)對(duì)花椒樣本的代謝成分進(jìn)行檢測(cè)分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)四川產(chǎn)地的不同花椒品種在代謝成分上進(jìn)行并集分析和相對(duì)含量的差異比較，以期為不同花椒的選擇及評(píng)價(jià)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

賽默飛ISQ 7000單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS系統(tǒng)；賽默飛Trace 1300_1310氣相色譜儀；Agilent J &W Scientific公司的DB-5色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限公司）；水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司）；渦旋振蕩儀（上海力辰儀器科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.2 試劑

甲醇和BSTFA，默克化工技術(shù)（上海）有限公司；吡啶、甲氧胺和核糖醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 供試材料

本研究所有組別共13種花椒，其分組、名稱和來源等信息如表1所示。

表1 供試材料信息表

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品預(yù)處理

將材料研磨成粉末后，取適量樣本加入0.8 mL 80%甲醇溶液和5 μL內(nèi)標(biāo)（核糖醇，5 mg·mL-1），渦 旋1 min，4 ℃超 聲30 min，12 000 r·min-1離 心10 min；取200 μL于1.5 mL離心管中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和凍干后，加入35 μL的20 mg·mL-1甲氧胺吡啶溶液，強(qiáng)烈振蕩30 s，于37 ℃下反應(yīng)90 min；取出后加入35 μL BSTFA（含1%TMCS）進(jìn)行衍生，于70 ℃下反應(yīng)60 min；反應(yīng)完室溫靜置30 min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)檢測(cè)。

1.4.2 GC-MS色譜與質(zhì)譜的條件

儀器參數(shù)設(shè)定：進(jìn)樣口溫度280 ℃，EI離子源溫度230 ℃，高純氦氣（純度大于99.999%）作為載氣，分流比為10∶1，進(jìn)樣量1.0 μL，溶劑延遲5 min。升溫程序：初始溫度70 ℃，10 ℃·min-1的速度升至200 ℃，然后以5 ℃·min-1的速度升至280 ℃，并維持10 min。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)范圍為30～550（m/z）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本數(shù)據(jù)在Thermo數(shù)據(jù)軟件Chromeleon7.0下對(duì)GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行特征峰提取，并根據(jù)NIST 17數(shù)據(jù)庫對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，在Excel 2016軟件中進(jìn)行后期編輯，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包含Retention time（保留時(shí)間）、觀察量（材料樣本）和峰強(qiáng)等信息。為研究不同組內(nèi)和組間的共有成分和獨(dú)有成分，使用韋恩圖進(jìn)行組分集合分析。默認(rèn)采用的分析數(shù)據(jù)選取SI＞700物質(zhì)。每個(gè)分組作為一個(gè)集合，進(jìn)行組內(nèi)與組間的分析。相對(duì)含量采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化法進(jìn)行計(jì)算，將代謝成分對(duì)應(yīng)的峰面積除以內(nèi)標(biāo)物質(zhì)核糖醇的峰面積而得到一個(gè)相對(duì)含量值。

2 結(jié)果與分析

2.1 成分分析

3組樣品中的代謝產(chǎn)物成分可分為糖、有機(jī)酸、烷類、醇類、烯類和酯類等，包含有多種揮發(fā)性的香氣成分和消炎類功效成分。參考相關(guān)報(bào)道，花椒與青花椒中揮發(fā)性香氣成分相對(duì)含量高的有乙酸芳樟酯、芳樟醇、檸檬烯。對(duì)13個(gè)樣本里3種物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。青花椒組中乙酸芳樟酯的相對(duì)含量明顯低于其他11種花椒，而芳樟醇含量高于11種花椒。

表2 乙酸芳樟酯、芳樟醇、檸檬烯的相對(duì)含量表

對(duì)3個(gè)分組進(jìn)行成分的并集分析，顯示川產(chǎn)花椒、品種花椒、青花椒這3組花椒共有成分有12種，如圖1所示。其中熊果苷、奎寧酸、桃葉珊瑚苷是消炎抗氧化功效成分，此外還有常見脂肪酸-棕櫚酸、酰胺類成分-花生四烯酰胺。目前花椒中以上成分的研究較少，未有研究顯示其是花椒的麻味成分。

圖1 3組花椒共有成分圖

2.2 各組共有成分分析

對(duì)3組花椒的共有成分進(jìn)行分析，如圖1所示，川產(chǎn)花椒組和青花椒組的共有成分?jǐn)?shù)量較多，品種花椒組的成分完全被青花椒組涵蓋，不存在品種花椒組獨(dú)有成分；青花椒組和川產(chǎn)花椒組的共有成分有5種，青花椒組和品種花椒組的共有成分有2種；青花椒組獨(dú)有成分有36種，川產(chǎn)花椒組獨(dú)有成分有7種。青花椒組獨(dú)有成分是最多的，這可能與藤椒和九葉青花椒的獨(dú)特風(fēng)味有關(guān)。品種花椒組和青花椒組的共有成分，包含有原兒茶酸和10-十一酸，其中原兒茶酸成分具有一定的消炎功效[10]。

川產(chǎn)花椒組和青花椒組的共有成分有5種，見表3，其共有成分中的大根香葉烯D在六月椒、七月椒和漢源花椒中也有檢出，推測(cè)其不是某一類花椒的特有香氣成分；此外共有成分中還有兒茶素和蜜二糖這兩種消炎功效的成分，其中蜀椒2號(hào)、蜀椒4號(hào)和藤椒中檢出兒茶素的相對(duì)含量較高。

表3 川產(chǎn)花椒組與青花椒組共有成分的相對(duì)含量表

2.3 各組獨(dú)有成分分析

品種花椒組的成分均被川產(chǎn)花椒組和青花椒組涵蓋，不存在品種花椒組獨(dú)有成分。川產(chǎn)花椒組有7種獨(dú)有成分，其中香氣成分有β-桉葉油醇和法尼醇。β-桉葉油醇是一種樟腦香型成分，具有抑菌、消炎及增進(jìn)食欲的功效[11-12]；法尼醇是一種花香型的香氣成分，具有一定的抑菌消炎功效[13]。但這兩種成分在青花椒組中均未檢出，可能這兩種成分與川產(chǎn)花椒組的香味及特征等存在一定的關(guān)系。

青花椒組有36種獨(dú)有成分，其中香氣成分有蛇麻烯、癸醛、D-檸檬烯、β-石竹烯、α-松油醇、異胡薄荷醇、橙花叔醇和香芹醇，這些香氣成分除在青花椒組中存在外，還在川產(chǎn)花椒及品種花椒組中的一些花椒品種中存在（表4）。雖然其中各成分在13種花椒中分布存在，沒有特殊成分，但只有青花椒組是8種香氣成分全部檢出的組別，推測(cè)這些香氣成分的組成差異性與青花椒獨(dú)特風(fēng)味的香型相關(guān)。

表4 青花椒組中香氣成分的相對(duì)含量與分布表

青花椒組獨(dú)有成分中包含有消炎成分莽草酸、紫杉葉素。莽草酸通過影響花椒共有成分花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集，抑制動(dòng)、靜脈血栓及腦血栓形成，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[14]。青花椒組獨(dú)有成分還包括多種氨基酸成分，如4-氨基丁酸、L-脯氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、L-酪氨酸和L-絲氨酸。青花椒組在氨基酸種類上明顯多于其他種類花椒。其中異亮氨酸、L-酪氨酸、L-絲氨酸僅在青花椒組中存在，是青花椒組的特殊成分。

2.4 其他成分

個(gè)別樣本獨(dú)有成分包括香葉醇、L-蘇氨酸、反式-β-羅勒烯、L-谷氨酰胺、L-色氨酸、油酸酰胺、十六碳酰胺、γ-依蘭油烯和己酰胺。

3 結(jié)論與討論

各花椒品種中的乙酸芳樟酯相對(duì)含量均高于青花椒組，推測(cè)乙酸芳樟酯是紅花椒類品種香型構(gòu)成的主要物質(zhì)。川產(chǎn)花椒組和除漢源花椒的其他花椒里都檢出了β-桉葉油醇和法尼醇，相對(duì)含量上，川產(chǎn)花椒組整體高于品種花椒組，青花椒組未檢出這兩種成分，推測(cè)β-桉葉油醇和法尼醇可能是花椒屬間的差異物質(zhì)。芳樟醇在青花椒組的相對(duì)含量明顯高于各花椒品種，其中藤椒的相對(duì)含量值最高。青花椒組是蛇麻烯、癸醛、右旋檸檬烯、β-石竹烯、松油醇、異胡薄荷醇、橙花叔醇和香芹醇共8種香氣成分都檢出的組別，推測(cè)這些香氣成分與花椒相比的組成差異性，與構(gòu)成青花椒獨(dú)特風(fēng)味的香型相關(guān)。

13個(gè)樣本中均檢出熊果苷、奎寧酸、桃葉珊瑚苷，這些物質(zhì)具有消炎抗氧化的功效，推測(cè)是花椒類植物的功效性成分。兒茶素也是一種消炎功效型成分，在蜀椒2號(hào)、蜀椒4號(hào)和藤椒中檢出兒茶素的相對(duì)含量較高。品種花椒組和青花椒組的共有成分原兒茶酸具有抑菌功能。莽草酸和紫杉葉素在多數(shù)樣本中被檢出，其中莽草酸通過影響花椒共有成分花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集，抑制動(dòng)、靜脈血栓及腦血栓形成，紫杉葉素是天然抗自由基抗氧化的黃酮類化合物。

青花椒組在氨基酸種類上明顯多于其他種類花椒，其中異亮氨酸、L-酪氨酸、L-絲氨酸僅在青花椒組中存在，是青花椒組的特殊成分，也可能是花椒屬間的差異物質(zhì)。推測(cè)氨基酸相對(duì)含量和種類組成與青花椒的呈味表現(xiàn)相關(guān)，是構(gòu)成青花椒獨(dú)特風(fēng)味的相關(guān)成分。