腦心通膠囊對(duì)大鼠心梗后心室重構(gòu)的影響研究*

伍啟華 蔡海榮 趙 帥 劉淑玲 張為章 陳伯鈞，，3，4 曾 靖，3，4△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510004；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；3.廣東省中醫(yī)急癥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510102；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)藥防治心血管急癥臨床研究團(tuán)隊(duì)，廣東 廣州 510006）

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈堵塞導(dǎo)致心肌缺血缺氧，引起心肌細(xì)胞大量壞死、凋亡的疾病。心肌梗死由于神經(jīng)內(nèi)分泌因子分泌而導(dǎo)致心室重構(gòu)，進(jìn)而引起心臟收縮和舒張功能的改變，最終進(jìn)展為慢性心力衰竭［1］。心力衰竭是各種心血管疾病的終末期，5年病死率高達(dá)52.6%［2］，已經(jīng)超越腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)目前現(xiàn)有冠心病患者1 100萬(wàn)，心力衰竭患者890萬(wàn)［3］，心肌梗死已經(jīng)成為心力衰竭最主要的原因，而心力衰竭是心肌梗死患者死亡的主要原因。心室重構(gòu)是指心肌細(xì)胞凋亡、壞死、自噬、增生，繼發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)改變，最終引起心肌纖維化。因此，有效治療心室重構(gòu)對(duì)改善心肌梗死患者的預(yù)后具有重要的意義。

氧化應(yīng)激是心室重構(gòu)的重要啟動(dòng)基質(zhì)，還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶（NOX）主要存在于心肌組織中，心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡、壞死可以促進(jìn)NOX表達(dá)上升，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧（ROS）分泌增加、堆積，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起心室重構(gòu)［4-5］。LXRα是配體依賴性的核受體超家族成員，在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚、心肌纖維化等方面具有重要的作用［6］。本課題組前期基礎(chǔ)研究表明，腦心通膠囊可以減少心肌梗死面積和改善心功能［7-9］，但是對(duì)心梗后心室重構(gòu)的作用尚未明確。因此，本研究復(fù)制了大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)模型，給予腦心通膠囊干預(yù)，觀察腦心通膠囊對(duì)心梗后心室重構(gòu)的改善并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，5～6周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：光照和黑暗每天各12 h，溫度19～27℃，濕度50%～70%，通風(fēng)換氣每8～12小時(shí)1次。

1.2 藥物與試劑 1）藥品：腦心通膠囊［規(guī)格：0.4 g/粒，陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025001］，阿托伐他汀鈣片（規(guī)格：10 mg/粒，輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20171062）。2）試劑：Masson染液套裝（武漢純度生物科技有限公司，貨號(hào)DC389）；Trizo（lMRC，貨號(hào)Invitrogen）；M-MLV Reverse Transcriptase（Promega，貨號(hào)M3682）；GoTaq（R）qPCR Master Mix（Promega，貨號(hào)A6100）；中性樹(shù)膠（北京凱瑞基生物科技有限公司，貨號(hào)87226）；蘇木素染液（廣州威佳科技有限公司，貨號(hào)G1080）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 動(dòng)物呼吸機(jī)（南京卡爾文生物科技有限公司）；成像系統(tǒng)［徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易公司］；倒置熒光顯微鏡［徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易公司］；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（武漢純度生物科技有限公司）；紫外透射分析儀（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；基因擴(kuò)增儀（Hema）；Real-time Quantitative PCR（Bio-Rad）。

1.4 模型制備 大鼠經(jīng)2.5%阿佛丁腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，胸腹部和頸部備皮。碘伏消毒頸部皮膚后沿頸部中線剪開(kāi)皮膚，分離肌肉和甲狀腺，暴露氣管，將氣管導(dǎo)管插入大鼠氣管中，調(diào)整呼吸機(jī)頻率、潮氣量、呼吸比等。然后用碘伏消毒胸部皮膚，橫向剪開(kāi)大鼠左側(cè)乳頭下方2 cm處的皮膚，分離肌肉至胸膜，剪開(kāi)胸膜，暴露心臟，胸腔內(nèi)放置棉球固定心臟。尋找左心耳后確定冠狀動(dòng)脈左前降支的位置，用5-0縫合線縫扎左前降支，結(jié)扎后可見(jiàn)左心室變白，室壁運(yùn)動(dòng)減弱。關(guān)閉胸腔，注射器抽吸胸腔積液和積氣，逐層縫合肌肉和皮膚。斷開(kāi)呼吸機(jī)，縫合頸部皮膚。假手術(shù)組只開(kāi)胸不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。1周后行Doppler超聲檢測(cè)，若左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）＜40%則判定為心肌梗死后心室重構(gòu)模型構(gòu)建成功。

1.5 分組和給藥 將心肌梗死后心室重構(gòu)模型構(gòu)建成功大鼠隨機(jī)分為模型組、腦心通組、他汀組。按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［10］計(jì)算大鼠藥物劑量，他汀組給予阿托伐他汀鈣片20 mg（/kg·d）灌胃，腦心通組給予腦心通膠囊378 mg（/kg·d）灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等體積的生理鹽水灌胃，灌胃時(shí)間為4周。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 1）心臟超聲檢測(cè)：在灌胃4周結(jié)束后，采用Doppler超聲檢測(cè)大鼠的心功能，包括左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVDs）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸收縮率（FS）、每搏輸出量（SV）、心排血量（CO）。2）QPCR檢測(cè)心肌組織LXRα mRNA、NOX mRNA、COLⅠmRNA、COLⅢ mRNA的表達(dá)：心臟超聲檢測(cè)結(jié)束后，大鼠腹腔注射麻醉劑，剪開(kāi)胸腔，剪取心臟組織，保存于-80℃冰箱。檢測(cè)時(shí)提取心室總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行QPCR擴(kuò)增試驗(yàn)，檢測(cè)各因子mRNA表達(dá)水平。引物序列采用Primer Express5.0設(shè)計(jì)，引物序列如下。LXRα上游引物：TGATGTTCCCACGGATGCTA，下游引物：GCCAACACAGAGGACACGG；NOX2上游引物：CAGGA TGGAGGTGGGACAA，下游引物：GTCGCCAACAATG CGGATA；COI上游引物：GCCCAGTTTGGTATCAAA GGT，下游引物：AAAAGGAACATTTGCTGGTCT；COⅢ上游引物：GCCTCCCAGAACATTACATACC，下游引物：CCAGTGTGTTTAGTGCAGCCAT。QPCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)各樣本的Ct值，然后計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。3）ROS檢測(cè)：采用 DCFH-DA（2，7-Dichlorofuorescin Diacetate）探針檢測(cè)心肌組織ROS的相對(duì)熒光度。4）HE染色：剪取心臟組織用甲醛固定后，脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，切片機(jī)切片，烘箱內(nèi)烤片，脫蠟，蘇木素和伊紅染色，脫水封片，置于顯微鏡下觀察。5）Masson染色：心肌組織制成石蠟切片后脫蠟，分別重鉻酸鉀、鐵蘇木素、麗春紅酸性品紅染色、磷鉬酸染色、苯胺藍(lán)染色，分化，透明封片，顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間采用單因素方差分析，兩兩間比較采用LSD-t法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。HE染色示假手術(shù)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠可見(jiàn)大量增生的纖維結(jié)締組織和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腦心通組和他汀組大鼠心肌纖維結(jié)締組織減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，正常心肌細(xì)胞較模型組多。

圖1 各組大鼠心肌組織（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果 見(jiàn)圖2。Masson染色示假手術(shù)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)正常，無(wú)纖維化組織；模型組大鼠可見(jiàn)膠原纖維結(jié)締組織增生；腦心通組和他汀組大鼠膠原纖維結(jié)締組織增生較模型組輕。

圖2 各組大鼠心肌組織（Masson染色，100倍）

2.3 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。灌胃4周結(jié)束后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs升高，LVEF、FS、SV、CO降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，腦心通組大鼠LVIDd、LVIDs降低，LVEF、FS、SV、CO升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別假手術(shù)組模型組腦心通組他汀組n 10 10 10 10 LVIDd 5.96±0.30 9.20±0.79*6.67±0.49△6.53±0.37△LVIDs 3.67±0.39 7.57±0.91*4.32±0.32△4.03±0.23△LVEF 61.92±3.53 26.54±4.86*53.93±5.26△57.90±3.41△FS 35.17±2.21 16.35±1.81*31.60±2.62△32.89±2.36△SV 130.33±4.10 92.09±3.33*121.34±7.24△124.72±5.78△CO 53.38±7.16 32.86±7.24*42.89±4.92△48.74±6.45△

2.4 各組大鼠心肌LXRα、NOX、COLⅠ、COLⅢmRNA和ROS表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。灌胃4周結(jié)束后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織LXRα mRNA表達(dá)降低，NOX、COLI、COLⅢ mRNA表達(dá)水平和ROS活性增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，腦心通組大鼠心肌組織LXRα mRNA表達(dá)增加，NOX、COLI、COLⅢmRNA表達(dá)水平和ROS活性降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌LXRα、NOX、COLI、COLⅢmRNA和ROS表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠心肌LXRα、NOX、COLI、COLⅢmRNA和ROS表達(dá)水平比較（±s）

組 別n LXRα mRNA NOX mRNA ROS COLI mRNA COLⅢmRNA假手術(shù)組模型組腦心通組他汀組10 10 10 10 1.02±0.10 0.37±0.08*0.87±0.10△1.05±0.30△1.02±0.10 3.25±0.27*1.11±0.15△0.94±0.07△1.01±0.08 3.10±0.37*1.25±0.17△1.11±0.12△1.09±0.17 2.98±0.27*1.13±0.18△0.83±0.15△1.00±0.13 3.16±0.21*1.22±0.23△0.89±0.13△

3 討論

心肌梗死屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣虛血瘀是心肌梗死后心室重構(gòu)的核心病機(jī)［11］?！端貑?wèn)·痹論》曰“心痹者，脈不通……倘若心陽(yáng)不振，則搏動(dòng)無(wú)力，致血行緩滯而積瘀”。氣與血相互為用，氣為血之帥，氣行則血行，心肌梗死患者多為中老年人群，正氣虧虛，心氣不足，心主血脈，心氣虛則無(wú)力推動(dòng)血行，血行瘀滯，瘀血內(nèi)生，痹阻血脈，不通則痛；且瘀血為有形之邪，瘀血留滯心絡(luò)、心肌，隨著病程進(jìn)展，瘀血日漸堆積，引起血管狹窄、增生和心肌增厚等。因此，心肌梗死后心室重構(gòu)應(yīng)以益氣活血為法則。腦心通膠囊出自補(bǔ)陽(yáng)還五湯，方中黃芪重用為君，補(bǔ)氣益氣，氣足則心脈通暢，心有所主。地龍活血通絡(luò)，全蝎息風(fēng)通絡(luò)，水蛭破血消癥，3藥合用為臣，活血化瘀，通絡(luò)止痛。川芎為血中之氣藥，理氣活血；牛膝活血化瘀；當(dāng)歸、雞血藤補(bǔ)血活血，活血不傷正；紅花活血痛經(jīng)；桃仁活血化瘀；赤芍涼血活血；丹參活血化瘀、清心除煩。8味藥合用為佐，加強(qiáng)活血化瘀功效。桂枝溫陽(yáng)通經(jīng)，桑枝通經(jīng)絡(luò)，二藥合用為使藥，引藥入心絡(luò)、血脈。諸藥合用，共奏益氣活血功效。已有研究發(fā)現(xiàn)，腦心通膠囊具有減少心肌梗死面積和改善心功能的作用［7-8］。

心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生率為25%［12］，一旦出現(xiàn)心力衰竭，心肌梗死患者的病死率明顯升高。心室重構(gòu)是心肌梗死發(fā)生心力衰竭的重要機(jī)制，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡、壞死、自噬、纖維化，進(jìn)一步導(dǎo)致心室壁增厚和心腔擴(kuò)大，LVEF下降。HE染色可以顯示心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞排列循序和纖維化等，Masson染色可以直接顯示心肌組織膠原纖維增生的程度。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列有序，未見(jiàn)纖維化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變；模型組大鼠正常細(xì)胞心肌細(xì)胞大部分消失，代之以增生的纖維細(xì)胞，并可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示模型組大鼠出現(xiàn)了心室重構(gòu)。而經(jīng)過(guò)腦心通膠囊干預(yù)后大鼠正常心肌細(xì)胞增多，心肌纖維化程度減輕。Masson染色示假手術(shù)組大鼠心肌組織無(wú)膠原纖維增生，模型組大鼠可見(jiàn)大量膠原纖維增生，而腦心通膠囊干預(yù)后心肌組織膠原纖維減輕。提示腦心通膠囊可以減輕心肌梗死后心室重構(gòu)大鼠的纖維化。

心肌梗死后心室重構(gòu)會(huì)出現(xiàn)心力衰竭，心功能是臨床上重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。心室重構(gòu)患者心室壁增厚，心腔增大，故LVIDd和LVIDs增大，而心肌收縮能力下降，故LVEF、FS、SV、CO均降低。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs升高，EF、FS、SV、CO降低；經(jīng)過(guò)腦心通膠囊干預(yù)后，大鼠LVIDd、LVIDs降低，EF、FS、SV、CO升高。提示腦心通膠囊可以抑制心肌梗死后心室重構(gòu)和改善心功能。

LXRα是配體依賴性的核受體超家族成員，在調(diào)節(jié)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)方面均起到重要的作用。有研究指出，LXRα基因敲除小鼠出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡、壞死、纖維化，減少心臟血管新生，從而加重心室重構(gòu)［13］。氧化應(yīng)激也是心室重構(gòu)的重要機(jī)制，氧化應(yīng)激主要是氧化應(yīng)激物質(zhì)產(chǎn)生過(guò)多或機(jī)體抗氧化能力不足，導(dǎo)致ROS堆積，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起心肌細(xì)胞凋亡、壞死、膠原纖維增生和纖維化，發(fā)生心室重構(gòu)。NOX2是ROS生成的主要來(lái)源，NOX2主要存在于心肌細(xì)胞中，心肌梗死后心肌分析大量NOX2，催化大量ROS生成，引起氧化應(yīng)激損傷［14］。細(xì)胞外基質(zhì)是心肌細(xì)胞外的主要成分，主要包括膠原和成纖維細(xì)胞。心肌梗死后ROS可以激活金屬基質(zhì)酶家族，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌大量的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，導(dǎo)致心肌纖維化和疤痕形成［15］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌LXRα mRNA表達(dá)降低，NOX、COLI、COLⅢmRNA表達(dá)水平和ROS活性增加；腦心通膠囊干預(yù)后大鼠心肌LXRα mRNA表達(dá)升高，NOX、COLI、COLⅢmRNA表達(dá)水平和ROS活性下降；提示腦心通膠囊可以上調(diào)LXRa mRNA的表達(dá)，抑制NOX、COLI、COLⅢmRNA的表達(dá)水平和ROS活性。

綜上所述，腦心通膠囊可能通過(guò)上調(diào)LXRα mRNA，抑制NOX、COLI、COLⅢ mRNA的表達(dá)和ROS活性，從而延緩心肌梗死后心室重構(gòu)。