基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的荊防顆粒治療蕁麻疹作用機制研究Δ

曹小宇，黃佳奇，陳美琳，王鵬龍，王苗苗，韓愛慶，楊恩華，鞏文橋，吳嘉瑞#

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)管理學(xué)院，北京 102488；3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司醫(yī)學(xué)部，山東 臨沂 276003)

蕁麻疹為臨床上常見的過敏性皮膚病，是由肥大細(xì)胞介導(dǎo)的局限性水腫反應(yīng)[1]。臨床治療蕁麻疹以抗組胺藥為首選，但患者長期服用化學(xué)藥易產(chǎn)生耐藥性，不良反應(yīng)大，停藥后易復(fù)發(fā)。因此，研究中藥治療蕁麻疹具有重大意義。蕁麻疹在中醫(yī)學(xué)中被稱為“癮疹”等。中醫(yī)認(rèn)為，蕁麻疹的主要誘因為素體虛弱，風(fēng)邪侵襲，肺胃不固，脾虛生濕，邪氣郁于肌膚之腠理，邪正相搏[2]。荊防顆粒方中荊芥、防風(fēng)具有祛風(fēng)之功效，柴胡疏肝斂陰，茯苓健脾化濕，諸藥合用祛風(fēng)勝濕、疏肝健脾，治療蕁麻疹有良好的效果[3]。本研究旨在探討荊防顆粒治療蕁麻疹的作用機制，為進(jìn)一步的實驗研究提供理論依據(jù)，也為中醫(yī)藥治療蕁麻疹提供思路與線索。

1 資料與方法

1.1 荊防顆粒重要化合物收集及靶點預(yù)測

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://tmspw.com/)，分別以“荊芥”“防風(fēng)”“羌活”“獨活”“柴胡”“前胡”“川芎”“枳殼”“茯苓”“桔梗”和“甘草”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索。根據(jù)口服生物利用度(OB)和化合物類藥性(DL)，設(shè)置閾值OB≥30%，DL≥0.18，篩選出符合條件的成分作為重要化合物并得到其相關(guān)的靶標(biāo)蛋白。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查詢靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因名。

1.2 蕁麻疹相關(guān)靶點篩選

以“Urticaria”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards(https://genecards.org)、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM，https://omim.org)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com)中檢索蕁麻疹疾病靶點。

1.3 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建荊防顆粒藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用在線工具Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，將荊防顆粒靶點蛋白和蕁麻疹疾病靶點進(jìn)行交集，得到兩者的共有靶點。將所得交集靶點錄入STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)得到其PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 富集分析

利用R x64 4.1.1軟件對交集靶點基因進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，并進(jìn)行可視化。

1.6 分子對接

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載荊防顆粒關(guān)鍵成分的mol2格式結(jié)構(gòu)，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載靶蛋白的pdb格式文件。使用Notepad++軟件刪除蛋白鏈中的水分子、原小分子配體等。將小分子mol2格式文件上傳至Autodock Tools-1.5.6，對其進(jìn)行加電荷，設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵等處理，并保存為PDBQT格式配體。將處理好的靶蛋白pdb文件上傳至Autodock Tools-1.5.6，對其進(jìn)行加氫、加電荷等處理。使用Autodock Vina1.1.2進(jìn)行分子對接。最后，使用Pymol軟件將對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 重要化合物篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫初步檢索得到荊防顆粒重要化合物共187個。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索重要化合物相對應(yīng)的人類基因共同靶點共261個。

2.2 藥物-成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)共428個節(jié)點，3 172條邊，見圖1。度值表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點相連的路線條數(shù)，度值較大的節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中起樞紐作用，其中對應(yīng)基因靶點最多的5個化合物，即度值最高的依次為MOL000098—槲皮素、MOL000358—β-谷甾醇、MOL000422—山柰酚、MOL000006—蘆丁和MOL004328—柑桔素。各邊表示化合物和靶點間的相互作用關(guān)系。

正方形代表藥物；六邊形代表化合物；菱形代表靶點；游離的六邊形代表藥物的共同化合物，化合物度值由小到大，六邊形大小由小到大the squares represent the drugs；the hexagons represent compounds；the diamonds represent the targets；the free hexagons represent common compounds of the drug,according to the degree of the compounds from small to large,and the size of the hexagon from small to large圖1 藥物-成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Drug-component-target network

2.3 蕁麻疹相關(guān)疾病靶點預(yù)測

以“Urticaria”為關(guān)鍵詞在DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索到疾病相關(guān)靶點63個，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到相關(guān)疾病靶點528個，在OMIM檢索到疾病靶點13個，合并去除重復(fù)值，得到蕁麻疹疾病相關(guān)靶點共556個。

2.4 構(gòu)建藥物-化合物-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)

利用韋恩圖展示化合物和疾病共有靶點關(guān)系，見圖2。得到荊防顆粒治療蕁麻疹潛在基因75個，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。網(wǎng)絡(luò)中共225個節(jié)點，927條邊。其中對應(yīng)基因靶點最多的5個化合物，即度值最高的依次為MOL000098—槲皮素、MOL000006—蘆丁、MOL000422—山柰酚、MOL000358—β-谷甾醇和MOL000173—漢黃芩素。

圖2 韋恩圖Fig 2 Venn diagram

正方形代表藥物；六邊形代表化合物；菱形表示化合物和疾病共有靶點；游離的六邊形代表藥物的共有化合物the squares represent the drugs；the hexagons represent compounds；the diamonds represent the common targets of compounds and diseases；the free hexagons represent common compounds of the drug圖3 化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Compound-disease network

2.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

將共有靶點導(dǎo)入STRING網(wǎng)站進(jìn)行分析，利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。網(wǎng)絡(luò)中共75個節(jié)點，1 018條邊；節(jié)點顏色越深代表度值越大。

由內(nèi)到外代表其度值由大到小from inside to outside represents its degree from large to small圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Protein protein interaction network

2.6 核心基因的生物學(xué)過程及通路分析

GO功能富集分析共得到1 391個條目，其中與生物過程(BP)相關(guān)條目1 307條，主要涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性調(diào)控(regulation of protein serine/threonine kinase activity)、細(xì)胞黏附調(diào)控(regulation of cell-cell adhesion)等；與細(xì)胞組分(CC)相關(guān)條目20條，主要涉及細(xì)胞膜膜閥(membranw raft)、細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)等；與分子功能(MF)相關(guān)條目64條，涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)等。展示各自前10條顯著條目，表明荊防顆粒的重要化合物可能通過參與多種生物調(diào)控過程發(fā)揮治療蕁麻疹的作用，見圖5。

圖5 GO功能富集分析Fig 5 GO enrichment analysis

KEGG通路富集分析結(jié)果可提示荊防顆粒治療蕁麻疹可能作用的通路，富集分析共得到211個條目，展示前30條顯著的通路，P值排序靠前的通路主要有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、人類巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)和糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等，見圖6。將PI3K-Akt信號通路和JAK激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路進(jìn)行可視化展示，見圖7—8。

圖6 KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis

圖8 JAK-STAT信號通路Fig 8 JAK-STAT signaling pathway

2.7 中藥-成分-靶點—通路互相作用網(wǎng)絡(luò)圖

篩選KEGG通路富集分析結(jié)果，得到6條P值較高的通路，將荊防顆粒和成分、成分和靶點、通路和靶點的相互關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入CytoScape 3.7.2軟件中，得到中藥-成分-靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖9。

六邊形代表荊防顆粒；八邊形代表荊防顆粒重要化合物；平行四邊形代表荊防顆粒治療蕁麻疹的候選靶點；矩形代表靶點相關(guān)通路the hexagon represents Jingfang granules；the octagons represent the important compounds of Jingfang granules；the parallelograms represent the candidate targets of Jingfang granules in the treatment of urticaria；the rectangles represent the target-related pathways圖9 中藥-成分-靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 9 Traditional Chinese medicine-component-target-pathway network

2.8 分子對接

用AutoDockTools軟件對部分關(guān)鍵靶點和度值較高的化合物進(jìn)行分子對接，結(jié)合能<20.93 kJ/mol表示具有較好的結(jié)合活性，可知槲皮素(quercetin)與基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)，乙酸亞油醇酯(linoleyl acetate)與前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2),山柰酚(kaempferol)與Akt1均有較好活性，見圖10。

A.乙酸亞油醇酯與PTGS2的分子對接；B.山柰酚與Akt1的分子對接；C.槲皮素與MMP9的分子對接；D.槲皮素與VEGFA的分子對接A.molecular docking of linoleyl acetate and PTGS2；B.molecular docking of kaempferol and Akt1；C.molecular docking of quercetin and MMP9；D.molecular docking of quercetin and VEGFA圖10 分子對接結(jié)果Fig 10 Molecular docking result

3 討論

本研究通過靶點預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分子對接等方法，進(jìn)行荊防顆粒治療蕁麻疹作用機制的預(yù)測和闡釋。通過靶點預(yù)測得到261個潛在靶點，其中度值較高的3個重要化合物為槲皮素、蘆丁和山柰酚，均為黃酮類成分。黃酮類化合物具有抗氧化、降血脂、降血壓、抗腫瘤和抗炎活性[4-5]。槲皮素可通過血清免疫球蛋白E(IgE)高親和力受體(FcεRIα)交聯(lián)，抑制肥大細(xì)胞系HMC-1分泌內(nèi)胰蛋白酶和白細(xì)胞介素(IL)6，下調(diào)其組氨酸脫羧酶(HDC)mRNA轉(zhuǎn)錄，減少組胺的釋放[6]；還可通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路下調(diào)炎癥因子IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[7]。蘆丁具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和降血壓等多種活性，通過調(diào)控絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)通路抑制NO和環(huán)氧合酶2(COX-2)的產(chǎn)生，從而達(dá)到抗氧化應(yīng)激、抗炎的作用[4]。山柰酚對氧化應(yīng)激、炎癥、腫瘤、糖尿病和內(nèi)皮功能障礙等具有治療作用，通過抑制NF-κB介導(dǎo)的信號通路，減弱炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制肥大細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，還可以用于治療肥胖、心血管疾病等[3,8-9]。

通過對“中藥-成分-靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖”分析，認(rèn)為FAS配體、IL-6、TNF、Akt1和腫瘤蛋白p53(TP53)可能為荊防顆粒治療蕁麻疹的關(guān)鍵靶點，所述靶點多涉及炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和血管通透性的調(diào)節(jié)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在免疫應(yīng)答過程中，IL-6作為關(guān)鍵免疫因子，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長與分化，并在機體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用[10]。IL-6為重要的促炎因子，可以刺激肥大細(xì)胞表面Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)，釋放細(xì)胞因子IL-4，IL-4對多種免疫細(xì)胞均有調(diào)節(jié)作用，因此，IL-6可通過對TLR4的上調(diào)以及IL-4的釋放加重炎癥反應(yīng)[11-12]。也有研究結(jié)果表明，Akt1基因的缺失會導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的血管生成，從而增加傷口、炎癥反應(yīng)以及血管通透性[3]。同時，PI3K-Akt是介導(dǎo)蕁麻疹發(fā)病的通路之一，Akt1是該通路的分子之一[13]?？赏ㄟ^降低Akt1的表達(dá)水平來抑制PI3K通路，進(jìn)而對蕁麻疹起到治療作用。

GO功能富集結(jié)果表明，主要涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性調(diào)控、細(xì)胞黏附調(diào)控、細(xì)胞膜膜閥、細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞因子受體結(jié)合和受體配體活性等，表明荊防顆粒重要化合物可能通過參與多種生物調(diào)控過程發(fā)揮治療蕁麻疹的作用，主要涉及細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡以及免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)[14]。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，主要富集的通路有PI3K-Akt信號通路、人類巨細(xì)胞病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、Jak-STAT信號通路、膀胱癌、瘧疾、TNF信號通路和胰腺癌等。其中，PI3K-Akt信號通路參與調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，因此，抑制該通路可以治療蕁麻疹等炎癥疾病[15]。JAK-STAT信號通路可傳導(dǎo)多種信號，研究結(jié)果表明，通過抑制JAK-STAT信號通路的激活，進(jìn)而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型(促炎)極化，可緩解炎癥反應(yīng)[16-17]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，明確荊防顆粒中有效化學(xué)成分在治療蕁麻疹的過程中具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)血管通透性等作用，揭示了其潛在的藥理學(xué)機制，說明荊防顆粒是基于多成分、多靶點、多通路的特點相互協(xié)同治療蕁麻疹，為進(jìn)一步的實驗研究提供了理論依據(jù)，也為中醫(yī)藥治療蕁麻疹提供了線索和思路。