桂香溫經(jīng)止痛膠囊對EMs在位內(nèi)膜細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制

叢慧芳,李陽,于洋,張?zhí)鞁?3*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

子宮內(nèi)膜異位癥(以下簡稱內(nèi)異癥)是育齡期婦女的臨床常見病，隨著醫(yī)療科技和社會環(huán)境的改變，內(nèi)異癥的發(fā)病率增高可達10%～15%[1]。內(nèi)異癥引起的痛經(jīng)、性交痛、下腹痛和不孕等，可影響患者的生活和工作，甚至影響患者的心理健康?，F(xiàn)代醫(yī)學對內(nèi)異癥機制的認識主要以子宮內(nèi)膜細胞隨經(jīng)血逆流進入盆腔生長為主導(dǎo)。內(nèi)異癥的形成需要子宮內(nèi)膜細胞經(jīng)歷腹水、腹腔細胞吞噬作用后，仍存活在腹膜進行黏附、侵襲和血管形成[2]。

郎景和教授認為內(nèi)異癥患者與非內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜分子和生物學有差異，并提出“在位內(nèi)膜決定論”[3]。根據(jù)內(nèi)異癥的在位內(nèi)膜決定論可知，在位內(nèi)膜具有更加強大的生存能力。與生存相關(guān)的細胞機制包括細胞分裂、凋亡和血管形成等。細胞凋亡是基因調(diào)控下的細胞程序性死亡，低凋亡水平可促進組織細胞更好地增殖生長，在腫瘤研究中較多，因內(nèi)異癥的侵襲轉(zhuǎn)移等特性與腫瘤相似，故內(nèi)異癥研究中凋亡機制研究日趨增多[4]。bcl-2屬于抗凋亡因子，是調(diào)節(jié)線粒體凋亡Bcl-2家族的一員，bcl-2的增加可抑制細胞凋亡[5]。Caspase3是水解酶Caspase家族的一員，可調(diào)控晚期凋亡，Caspase3表達增加可以促進細胞凋亡[6]。

西醫(yī)對于內(nèi)異癥的治療以腹腔鏡、卵巢抑制和輔助生殖為主，但在內(nèi)異癥的早期，疾病不易發(fā)現(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)早期比較可靠的血清標志物[7]。中醫(yī)對于內(nèi)異癥引起的癥狀具有很好的緩解作用，可有效縮減病灶，并可在早期進行干預(yù)，達到治療效果。叢慧芳教授臨床中治療內(nèi)異癥頗有心得，并創(chuàng)立桂香溫經(jīng)止痛膠囊用于臨床治療。前期研究表明桂香溫經(jīng)止痛膠囊具有很好的臨床療效[8-9]。本研究選取內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞模型，觀察桂香溫經(jīng)止痛膠囊含藥血清對內(nèi)異癥細胞模型中細胞凋亡情況，并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 主要藥物及試劑

桂香溫經(jīng)止痛膠囊：主要成分為肉桂、葫蘆巴、山茱萸、制吳茱萸、醋延胡索、川楝子、鹽小茴香、白芷、川牛膝、細辛、白芍、五靈脂、水蛭。批準文號：黑藥制字Z20160029，此藥為黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院院內(nèi)制劑，6粒/d，每日3次口服。Vimentin抗體試劑(北京中杉金橋公司)；CK19(北京中杉金橋公司)；MTT溶液(上海富衡生物)；DMEM/F12；PBS緩沖液(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；DMSO(Gibco公司)；RNA提取試劑盒、TRIZOL、dNTP、氯仿、MMLV、異丙醇、DEPC、ddH2O、MgCl2、瓊脂糖、溴化乙錠、MOPS、乙酸鈉、EDTA、溴酚蘭等。

1.2 主要實驗儀器

37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾371)；分光光度計(法國SECOMAM UviLine 9100/9400)；電泳槽(君意JY-SCZ2)；離心機(德國RUMA-ZENTRIFUGENM Z35B80)、Mulitskan酶標儀(美國熱電K3)、實時熒光定量PCR儀(美國羅氏LightCycler480)。

1.3 實驗動物

清潔級SD雌性大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g，用于制備含藥血清，購買于青島大任富城畜牧有限公司，動物合格證號：SCXK(魯)20140001。實驗室由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～75%。

2 實驗方法

2.1 樣品采集

選取2019年6月—2020年12月于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院進行開腹手術(shù)、腹腔鏡手術(shù)切除卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(巧克力囊腫)患者25例，年齡35～49歲，術(shù)后病理檢查證實為子宮內(nèi)膜異位癥，且按1985年美國生育學會修訂EMs(子宮內(nèi)膜異位癥)分期標準(r-AFS)，全部為Ⅲ～Ⅳ期病例，術(shù)后刮取宮腔內(nèi)子宮內(nèi)膜組織，標記為EMs組。選擇非EMs而進行子宮切除術(shù)的患者16例，年齡35～49歲。術(shù)后刮取宮腔內(nèi)子宮內(nèi)膜組織，標記為對照組。取得EMs組和對照組的在位子宮內(nèi)膜組織分別置入2～8 ℃的4 mL DMEM/F12培養(yǎng)液無菌瓶中，置于冰盒中立即送入實驗室，盡快進行細胞的分離培養(yǎng)。內(nèi)膜組織采集均得到患者知情授權(quán)，醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者既往月經(jīng)規(guī)律，無其他內(nèi)、外科并發(fā)疾病、無炎癥、免疫性及其他惡性疾病，術(shù)前1個月內(nèi)未接受激素類及GnRH類藥物治療。

2.2 含藥血清制備

將40只適應(yīng)性飼養(yǎng)的SD大鼠隨機分為兩組，桂香組(20只)和空白組(20只)，參照“動物和人體表面積折算的等效劑量比率表”[10]換算給藥，桂香組按照20 mL/kg體質(zhì)量進行桂香溫經(jīng)止痛膠囊濃縮劑灌胃，2次/d，連續(xù)灌胃5 d，最后1 d 2次灌胃時間相隔2 h；空白組每日按照60 mL/kg體質(zhì)量進行生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)灌胃5 d，最后1 d 2次灌胃時間相隔2 h，其他喂養(yǎng)環(huán)境一致。給藥第7天末次給藥后1.5 h，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)分別麻醉兩組大鼠，開腹并使用負壓采血管于腹主動脈采血，每只約取8 mL，3 000 r/min離心20 min，分離血清后，將同一組血清混合，用0.2 μm微孔過濾膜過濾滅菌，獲得空白血清和桂香血清組血清，置入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細胞培養(yǎng)及分組

將所取患者的EMs組、對照組在位內(nèi)膜組織從低溫運送的培養(yǎng)液中取出，生理鹽水清洗。清洗結(jié)束后吸凈生理鹽水；將內(nèi)膜組織加入10倍的消化液，并在消化液中剪碎內(nèi)膜組織，碎片體積約為1 mm3，剪碎后轉(zhuǎn)移置離心管中，放入細胞培養(yǎng)箱；離心機離心后，用含有15%胎牛血清及1.5%青鏈霉素(青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL)的DMEM培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)成功后進行傳代，取第2～3代生長良好的細胞用于后續(xù)檢測實驗。其中EMs組將作為EMs細胞模型進行后續(xù)干預(yù)實驗，將EMs細胞模型分為4組，分別為空白組、空白血清組、桂香血清組和PI3K抑制劑組，并進行加藥干預(yù)。

2.4 細胞鑒定

細胞爬片固定后PBS漂洗，再用0.5%Triton X-100室溫孵育20 min，PBS漂洗2次，滴加3% H2O2，室溫靜置15 min，PBS漂洗。正常山羊血清封閉液滴加蓋玻片，滴加Ⅰ抗(1∶100～1∶200稀釋，鼠抗人角形蛋白CK19或鼠抗人波形蛋白Vimentin)，37 ℃孵育1 h。滴加二抗，37 ℃孵育30 min。PBS漂洗蓋玻片后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育10～15 min。漂洗后滴加DAB孵育2～10 min顯色，沖洗，脫水，中性樹脂膠封片，光鏡下觀察。

2.5 MTT法不同藥物的最佳干預(yù)濃度和干預(yù)時間

取生長良好的在位子宮內(nèi)膜細胞，將細胞計數(shù)調(diào)整至5×104/mL～10×104/mL，將細胞懸液加入96孔板中，每孔加入100 μL，將接種好的細胞培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，直至細胞單層鋪滿孔底(或>90%)。將培養(yǎng)好EMs細胞進行分組，分別為空白組、空白血清組、桂香血清組和PI3K抑制劑組，各組設(shè)置5個濃度梯度，其中空白血清組和桂香血清組按照2.2中血清濃度進行稀釋，① 空白組：按照正常培養(yǎng)基添加5孔；② 空白血清組：0%、5%、10%、20%、30%；③ 桂香血清組：0%、5%、10%、20%、30%；④ PI3K抑制劑組：0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L。加入不同培養(yǎng)基后的細胞分別在細胞培養(yǎng)的24 h、48 h、72 h、96 h檢測其增殖能力，檢測時將96孔板每孔培養(yǎng)液吸凈加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在Formazan結(jié)晶充分形成后，保留結(jié)晶，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩使結(jié)晶物充分溶解(避光)。酶標儀波長492 nm，參數(shù)620～630 nm，測量各孔的吸光值(OD)。

2.6 RT-PCR技術(shù)檢測Caspase3、bcl-2 mRNA的表達

PCR引物通過NCBI中Primer設(shè)計，并委托吉林省庫美生物科技有限公司合成引物序列(見表1)，收集各組細胞，TRIZOL試劑裂解的細胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR儀進行擴增，檢測各目的基因，并采用2-△△Ct方法對結(jié)果進行分析計算其表達量。配制好的PCR反應(yīng)溶液置于PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93 ℃ 1 min預(yù)變性，93 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個循環(huán)。

表1 引物序列

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，組間兩兩進行比較，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則采用t檢驗；若數(shù)據(jù)之間不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，并使用Graphpad Prism 8繪制可視化圖進行展示。

3 實驗結(jié)果

3.1 細胞鑒定

第三代培養(yǎng)的細胞進行免疫細胞化學染色，波形蛋白存在于間質(zhì)細胞內(nèi)，故免疫細胞化學染色選用間質(zhì)細胞特異的波形蛋白抗體進行[11]，染色后陽性的標志為基質(zhì)細胞胞架,呈棕黃色，如圖1a所示。角蛋白存在于腺上皮細胞內(nèi)，故免疫細胞化學染色選用上皮細胞特異的細胞角蛋白抗體進行染色，染色后陽性的標志為腺上皮細胞胞架,呈棕黃色，如圖1b所示。

注：a.波形蛋白抗體；b.角蛋白抗體。圖1 免疫細胞化學染色圖(×400)

3.2 兩組細胞凋亡因子Caspase3和bcl-2 mRNA的表達差異

經(jīng)熒光定量PCR檢測顯示，與對照組相比，bcl-2 mRNA在EMs組表達較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，Caspase3 mRNA在EMs組表達較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 兩組細胞bcl-2和Caspase 3 mRNA表達比較

3.3 MTT法測各組最佳干預(yù)劑量

增殖曲線可以看出，5%的含藥血清、10 μmol/L的LY294002為最佳干預(yù)劑量，為保持恒定變量，空白血清濃度與含藥血清濃度選擇應(yīng)一致，根據(jù)所選干預(yù)劑量對EMs進行干預(yù)，以評價含藥血清的治療作用，見圖2。

注：a.空白血清增殖曲線；b.不同劑量含藥血清增殖曲線；c.不同劑量LY294002增殖曲線。圖2 不同樣本增殖曲線圖

3.4 桂香溫經(jīng)止痛膠囊含藥血清對EMs細胞模型凋亡的影響

3.4.1 4組細胞中Caspase3 mRNA的表達

經(jīng)熒光定量PCR檢測顯示，Caspase3 mRNA在空白組和空白血清組表達較低，桂香血清組和LY294002組表達較高；其中空白組與空白血清相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；桂香血清組與LY294002相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；空白血清與桂香血清組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 4組細胞中Caspase3 mRNA水平比較

3.4.2 4組細胞中bcl-2 mRNA的表達

經(jīng)熒光定量PCR檢測顯示，bcl-2 mRNA在空白組和空白血清組表達較高，桂香血清組和LY294002組表達較低；其中空白組與空白血清相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；桂香血清組與LY294002相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；空白血清與桂香血清組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 4組細胞中bcl-2 mRNA水平比較

4 討論

子宮內(nèi)膜異位癥為婦科常見難治性疾病，在中醫(yī)中屬于“血瘀證”，所致的痛經(jīng)、不孕等可反復(fù)困擾患者。中醫(yī)藥在緩解痛經(jīng)、促進懷孕方面具有良好的臨床效果。叢慧芳教授在臨床中治療內(nèi)異癥頗有療效，并帶領(lǐng)課題組創(chuàng)立了桂香溫經(jīng)止痛膠囊，且在臨床治療中得到驗證。

桂香溫經(jīng)止痛膠囊是叢慧芳教授多年治療寒凝血瘀內(nèi)異癥的經(jīng)驗方痛愈舒顆粒經(jīng)劑型變化而成，使之成為患者接受度更高、更方便攜帶的藥物。此方乃少腹逐瘀湯與當歸四逆湯化裁而來，具有溫經(jīng)散寒，化瘀止痛之功。少腹逐瘀湯對于寒凝血瘀型的痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥等具有很好的治療效果[12]，還可提高內(nèi)異癥子宮內(nèi)膜容受性，促進受孕[13]。當歸四逆湯是以桂枝湯為底方，可調(diào)和陰陽，再加當歸通草倍大棗，治療寒凝于內(nèi)的疾病尤為擅長[14]。桂香溫經(jīng)止痛膠囊以吳茱萸下行溫肝腎，暖胞宮，辛能散結(jié)，溫能行血，可入腎散寒為君藥；小茴香、肉桂、葫蘆巴，溫腎陽，散寒瘀，助吳茱萸溫腎散寒；五靈脂、元胡、川楝子止痛化瘀，細辛辛散，可散絡(luò)脈瘀滯；水蛭善于搜刮絡(luò)脈之瘀，直達病所；細辛化瘀通絡(luò)，引諸藥入絡(luò)；白芷辛散通竅，與細辛同用，可宣肺理氣；溫陽散寒不可不養(yǎng)血補氣，否則陽無所依，氣無所載，故增加白芍、當歸，活血補血，牛膝引藥下行，山茱萸補肝腎，山藥補后天之本，且可滋陰。補先天養(yǎng)后天，養(yǎng)氣血，使藥物發(fā)揮溫腎散寒，活血止痛之功。

BCL-2家族是調(diào)控線粒體凋亡的主要相關(guān)因子，Bcl-2通過與Bak相互作用，導(dǎo)致線粒體通透性增加，使其中的CytC釋放進入細胞質(zhì)中，觸發(fā)Caspase3的級聯(lián)反應(yīng)而促進細胞凋亡。Bcl-2家族中包含促凋亡因子bax和抑凋亡因子bcl-2。當線粒體凋亡啟動，則會出現(xiàn)bax的活化增加，bcl-2表達降低，從而促進細胞凋亡。有研究表示與非EMs患者相比，EMs患者子宮內(nèi)膜中Bax表達顯著降低，而bcl-2表達顯著增加，說明EMs與低凋亡水平相關(guān)[15]。李斌等[16]同樣對臨床中EMs患者和非EMs患者子宮內(nèi)膜進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)EMs在位內(nèi)膜中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及bcl-2都顯著高于異位內(nèi)膜組和對照組，而Bax顯著降低。KAYA等人[6]研究發(fā)現(xiàn)血清Caspase3水平與EMs的嚴重程度呈正相關(guān)。解勝蘭等[17]通過對EMs的在位、異位內(nèi)膜以及非EMs的在位內(nèi)膜進行免疫組化法檢測標本中Caspase3、Caspase8的表達，發(fā)現(xiàn)其在EMs的異位、在位和對照組中的表達依次下降，且隨著RAFS評分的增加表達量逐漸降低，說明Caspase3、Caspase8的低表達與EMs發(fā)生發(fā)展相關(guān)。故通過對bcl-2、Caspase3的檢測可對細胞凋亡水平進行評價，其中bcl-2體現(xiàn)了線粒體的凋亡情況，Caspase3體現(xiàn)了晚期凋亡情況。本實驗桂香溫經(jīng)止痛膠囊含藥血清與凋亡抑制劑LY294002相比，具有一致性，均可降低內(nèi)異癥細胞的增殖，并可通過促進bcl-2 mRNA的表達，抑制Caspase3 mRNA的表達抑制細胞凋亡水平。

綜上所述，本研究說明桂香溫經(jīng)止痛膠囊可抑制內(nèi)異癥細胞模型的增殖，使得bcl-2 mRNA表達上調(diào)，Caspase3表達下調(diào)抑制細胞凋亡，促進內(nèi)異癥癥狀改善。中藥對疾病的治療屬于整體調(diào)理，辨證論治，可涉及多個靶點，多條信號通路。故對中醫(yī)藥的研究可更加廣泛。