5株棗果實(shí)采后病原真菌分離鑒定及rDNA ITS區(qū)序列分析

姚 婷， 丁鳳蘭， 王 珂， 馬國(guó)為， 陳玉娟， 張 燕，何欣萌， 王友升,*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100048； 2.日照市疾病預(yù)防控制中心， 山東 日照 276826； 3.山東凱普菲特生物科技有限公司 日照華偉大健康產(chǎn)業(yè)研究院，山東 日照 276801)

棗(ZiziphusjujubaMill.)屬鼠李科棗屬植物，落葉小喬木，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)特色果樹(shù)[1]。我國(guó)新疆地區(qū)得天獨(dú)厚的自然資源，造就棗果實(shí)卓越的品質(zhì)，新疆紅棗種植面積占全國(guó)紅棗種植總面積的1/3[2]。新疆干制棗以從內(nèi)地引進(jìn)的富含氨基酸、蛋白質(zhì)和各種活性物質(zhì)的灰棗、駿棗等為主，鮮食品種以從山東引進(jìn)我國(guó)獨(dú)有的冬棗為主。冬棗果形美觀(guān)、味道鮮美，富含人體所需的氨基酸和多種維生素， 同時(shí)含有多種微量元素和較多的藥用成分，被譽(yù)為“活維生素丸”[2-3]。棗果實(shí)中含有cAMP和cGMP，對(duì)冠心病、心肌梗死等有輔助療效[4-5]。棗果實(shí)的食用和商品價(jià)值極高，但果實(shí)皮薄、肉厚、細(xì)嫩多汁，不僅在采后運(yùn)輸中易失水軟化造成品質(zhì)下降和經(jīng)濟(jì)損失，而且采后極易腐爛變質(zhì)，難以?xún)?chǔ)存，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約了棗果實(shí)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?？刂撇珊蟛『κ茄娱L(zhǎng)棗果實(shí)貨架期的關(guān)鍵點(diǎn)[6-7]。真菌和細(xì)菌可引起棗果實(shí)采后侵染性病害，而真菌性病害最為常見(jiàn)，主要涉及鏈格孢菌、青霉菌、莖點(diǎn)霉菌、根菌索菌、鐮刀菌、根霉菌、曲霉菌、芽枝菌等12個(gè)屬的真菌[8-9]。劉曉林等[10]對(duì)產(chǎn)生黑腐病的駿棗、灰棗和壺瓶棗進(jìn)行研究，分離鑒定后發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌為致病病原菌；沙娜瓦爾·色買(mǎi)提等[11-12]從發(fā)生霉?fàn)€病的駿棗、灰棗和哈密大棗中，發(fā)現(xiàn)了以黑曲霉為主要致病菌的曲霉屬真菌和以波蘭青霉為主要致病菌的青霉屬真菌；還有研究表明，引起冬棗青腐病的病原真菌有橘青霉、擴(kuò)展青霉[13-14]。此外，灰葡萄孢菌可引起冬棗在采后產(chǎn)生灰霉病[15]。盡管目前研究者對(duì)引起棗果實(shí)采后侵染性病害的病原菌已開(kāi)展較多研究，然而棗果實(shí)采后侵染性病害依然制約著棗果實(shí)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8]。對(duì)于引起駿棗、冬棗采后病害的其他病原真菌，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，是否存在對(duì)棗果實(shí)產(chǎn)生采后侵染性病害的其他病原真菌，需要開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

真菌rDNA包含外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(external transcribed spacer，ETS)、18S基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer，ITS1)、5.8S基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(internal transcribed spacer，ITS2)、 28S基因和基因間隔序列(intergenicspacer，IGS)[16]，保守性強(qiáng)，但不同菌株之間存在序列和長(zhǎng)度多態(tài)性。運(yùn)用ITS- 4和ITS-5擴(kuò)增rDNA ITS區(qū)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，可通過(guò)分析較短的rDNA ITS區(qū)序列信息，快速有效地對(duì)真菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定[17-18]。本研究擬從采后自然發(fā)病的新疆冬棗和駿棗果實(shí)上分離得到絲狀病原真菌，結(jié)合果實(shí)病癥、形態(tài)學(xué)特征及rDNA ITS區(qū)序列分析結(jié)果，對(duì)棗果實(shí)的絲狀病原真菌進(jìn)行分析。希望鑒定出更多引起棗果實(shí)病害的病原真菌種類(lèi)，為棗果實(shí)病害的生物防治措施的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)基

冬棗和駿棗果實(shí)采自新疆阿克蘇地區(qū)有機(jī)果園，選擇在室溫下貯藏至發(fā)病的果實(shí)進(jìn)行研究。

DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2×Taq PCR Master Mix、Marker Ⅶ，購(gòu)自天根生化試劑公司；通用引物ITS- 4和ITS-5由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成。三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、十二烷基磺酸鈉(SDS)，購(gòu)自Amersco公司，乙醇、鹽酸均為分析純。

馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：稱(chēng)取削皮后的馬鈴薯200 g，切片煮沸30 min后，過(guò)濾取汁液，加入瓊脂粉18 g、葡萄糖20 g、加水補(bǔ)足至1 L，121 ℃滅菌20 min。麥芽浸粉培養(yǎng)基(ME)：麥芽浸粉20 g、瓊脂粉18 g，調(diào)節(jié)pH值至5.5±0.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Forma ClassⅡA2型生物安全柜，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Axio Image A1型顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司MG96+型PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；CJ100型凈化試驗(yàn)臺(tái)，北京賽伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MJX- 250Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠(chǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種的分離、純化與回接

分離：取棗果實(shí)發(fā)病部位和健康組織交界處果肉，并將病斑一側(cè)倒扣于PDA固體培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)1～3 d。 純化：扣取分離菌邊緣菌塊，分別三點(diǎn)轉(zhuǎn)接到PDA和ME培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng)14 d?；亟樱禾暨x健康無(wú)損傷的冬棗和駿棗果實(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌接種針刺孔，取純化后的菌塊接種至傷口處，觀(guān)察果實(shí)接種處是否出現(xiàn)相應(yīng)病癥，并在病斑處再次分離病原菌，比較分離到的病原菌與接種病原菌的菌落形態(tài)[19]。

1.3.2菌落形態(tài)學(xué)觀(guān)察

將純化得到生長(zhǎng)于PDA培養(yǎng)基上的菌落，從菌落外沿取菌塊，分別三點(diǎn)轉(zhuǎn)接到PDA和ME培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng)14 d，分別觀(guān)察菌落形態(tài)。于潔凈載玻片上，滴1滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，將插片培養(yǎng)的蓋玻片置染色液中，然后蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀(guān)察產(chǎn)生分生孢子及分生孢子梗的形狀、色澤和分生孢子隔膜等性狀[20-21]。

1.3.3基因組DNA的提取及rDNA ITS區(qū)序列分析

采用改良后的十二烷基硫酸鈉(SDS)- 氯化芐法提取待鑒定菌株總DNA[22]。以ITS- 4和ITS-5為PCR擴(kuò)增引物，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的片段大小相符后送至華大基因進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行同源序列比對(duì)，選取相似度大于99%的同源序列進(jìn)行分析，并且構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與回接結(jié)果分析

將采后貯藏過(guò)程中自然發(fā)病的冬棗和駿棗果實(shí)病斑及從果實(shí)上分離到的病原菌回接到健康無(wú)傷棗果實(shí)上，導(dǎo)致棗發(fā)病的病斑特征如圖1所示。圖1結(jié)果表明，棗果實(shí)中分離得到5株絲狀病原真菌221#、227#、229#、230#和232#，純化后回接到健康無(wú)傷的駿棗果實(shí)上，在接種部位均出現(xiàn)同樣的病癥，并能從該病害部位再次分離得到相應(yīng)病原菌；因此，可確定為棗果實(shí)致病菌。

圖1 5株病原真菌分離與回接時(shí)的病癥Fig.1 Fruit symptoms of isolation fruits and re-inoculated fruits of five pathogenic fungi

2.2 病原菌的形態(tài)觀(guān)察結(jié)果

2.2.1菌落形態(tài)分析

從采后貯藏過(guò)程中自然發(fā)病的冬棗和駿棗果實(shí)上分離得到的5株絲狀病原真菌，經(jīng)純化后分別三點(diǎn)轉(zhuǎn)接至PDA和ME固體培養(yǎng)基上，并于25 ℃條件下培養(yǎng)14 d，菌落形態(tài)如圖2所示。圖2結(jié)果表明，菌株221#在PDA培養(yǎng)基較ME培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)7d時(shí)菌落覆蓋整個(gè)PDA板，菌絲呈白色、致密、棉絮狀，菌落中央淺黃色[圖2 (a1)]，相比而言ME板上菌絲較薄且菌絲較長(zhǎng)、中央淺黃色[圖2 (a2)]；培養(yǎng)14 d后，PDA板上的菌落顏色加深[圖2 (a3)]， ME培養(yǎng)基上的菌落顏色也加深，整體呈淺黃色，但菌絲仍未鋪滿(mǎn)ME平板[圖2 (a4)]。

菌株227#在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d時(shí)菌絲呈白色絨毛狀，中央菌絲積聚形成突起[圖2 (b1)]，而在ME培養(yǎng)基上菌落形狀不規(guī)則、菌絲厚薄不一、邊緣裂口[圖2 (b2)]；培養(yǎng)14 d后，兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)均沒(méi)有發(fā)生明顯改變[圖2 (b3)和圖2 (b4)]。

菌株229#在PDA和ME培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)相近，培養(yǎng)7 d菌落表面干燥、邊緣清晰，菌絲呈白色、絨毛狀，有色素產(chǎn)生[圖2 (c1)和圖2 (c2)]；培養(yǎng)14 d后，PDA培養(yǎng)基上的菌落中央突起，出現(xiàn)較深的褶皺，由于色素的產(chǎn)生而導(dǎo)致培養(yǎng)基呈現(xiàn)深紅色[圖2 (c3)]，ME培養(yǎng)基上菌落同樣出現(xiàn)突起，但不集中在中央，而是呈輪紋狀分布，產(chǎn)生色素較少，培養(yǎng)基呈黃褐色[圖2 (c2)和圖2 (c4)]。

菌株230#在PDA和ME培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較為緩慢，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落邊緣清晰、中央黏稠；邊緣干燥呈明顯的根狀[圖2 (d1)和圖2 (d2)]；繼續(xù)培養(yǎng)至14 d，PDA板菌落仍呈白色，ME板上菌落呈淺褐色，中央顏色較深，PDA板上黏稠部分較ME板上范圍更大[圖2 (d3)和圖2 (d4)]。

菌株232#在PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較ME培養(yǎng)基上旺盛，培養(yǎng)7 d時(shí)PDA板上菌落淡黃色、致密、絨毛狀，有紅褐色色素產(chǎn)生[圖2 (e1)]，而ME板上的菌落則不產(chǎn)生色素，但菌落較PDA板更為致密、菌絲較短且菌落邊緣清晰[圖2 (e2)]；繼續(xù)培養(yǎng)至14 d后， 兩種培養(yǎng)基上菌絲均已滿(mǎn)板，PDA板上色素含量顯著增加、培養(yǎng)基呈深紅褐色[圖2 (e3)]，而ME培養(yǎng)基上菌落顏色不均一[圖2 (e4)]。

圖2 5株病原真菌在PDA和ME培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)7 d和14 d的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of five pathogenic fungi cultured on PDA and ME plates for 7 d and 14 d at 25 ℃

參考《真菌鑒定手冊(cè)》等文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)菌株的菌落及形態(tài)描述[20-21]，菌株221#和227#為鐮孢菌，229#和232#為葡柄霉，230#為短柄霉屬真菌。

2.2.2顯微形態(tài)分析

從采后貯藏過(guò)程中自然發(fā)病的冬棗和駿棗果實(shí)上分離到的5株絲狀病原真菌，接種在PDA固體培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)，顯微鏡下觀(guān)察孢子及菌絲或孢子梗形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，菌株221#的菌絲著色較淺、分枝多且內(nèi)部隔膜觀(guān)察明顯[圖3(a2)]，孢子梗分枝明顯、分生孢子狹長(zhǎng)呈新鐮刀狀或彎月形[圖3(a1)]；菌株227#的菌絲著色較淺、分枝多且內(nèi)部隔膜觀(guān)察明顯[圖3(b2)]，分生孢子橢圓形、孢子壁光滑[圖3(b1)]；菌株229#在PDA板上培養(yǎng)14 d后有孢子產(chǎn)生，菌絲著色較深、分枝多且內(nèi)部隔膜觀(guān)察明顯[圖3(c1)和圖3(c2)]；菌株230#呈現(xiàn)兩種顯微形態(tài)：?jiǎn)渭?xì)胞個(gè)體和菌絲，單細(xì)胞呈橢圓形，菌絲體具隔[圖3(d1)和圖3(d2)]；菌232#菌株的孢子暗褐色、形狀不規(guī)則、表面粗糙、有壁磚狀分隔[圖3(e1)]，菌絲著色較淺、分枝多且內(nèi)部隔膜觀(guān)察明顯[圖3(e2)]。

圖3 5株病原真菌的顯微形態(tài)觀(guān)察結(jié)果Fig.3 Micromorphological characteristics of five pathogenic fungi

2.3 rDNA ITS區(qū)序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

采用改良后的SDS-氯化芐方法提取總DNA，本研究所提取的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)未出現(xiàn)降解，提取質(zhì)量較好。以基因組DNA為模板，ITS- 4和ITS-5為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到 rDNA ITS區(qū)目的片段，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。圖4結(jié)果表明，221#菌株[圖(4 a)]、227#菌株[圖(4b)]、229#菌株[圖(4c)]、230#菌株[圖(4d)]和232#菌株[圖(4e)]目的條帶在600 bp左右。

圖4 5株病原真菌的rDNA ITS區(qū)PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.4 Electrophoresis results of rDNA ITS PCR product of five pathogenic fungi

圖5 以rDNA ITS區(qū)序列為分子標(biāo)記的5株病原真菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of five pathogenic fungi strains based on rDNA ITS sequence as molecular marker

真菌rDNA ITS區(qū)具有序列長(zhǎng)度和堿基排列多態(tài)性，同源性分析并且構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖5所示。由圖5結(jié)果可知：221#與木賊鐮孢菌(Fusariumequiseti)在同一分枝上，親緣距離小于0.05，該結(jié)果置信度達(dá)99%[圖5(a)]；227#與變紅鐮孢菌(Fusa-riumincarnatum)在同一分枝上，親緣距離小于0.05，置信度達(dá)95%[圖5(b)]；229#與番茄匍柄霉(Stemphyliumlycopersici)在同一分枝上，親緣距離為零，置信度達(dá)99%[圖5(c)]；230#與產(chǎn)酶短梗霉(Aureobasidiumproteae)在同一分枝上，親緣距離為零，置信度達(dá)99%[圖5(d)]；232#與葡柄霉(Stemphyliumarmeriae)在同一分枝上，親緣距離小于0.05，置信度達(dá)94%[圖5(e)]。因此rDNA ITS區(qū)鑒定221#為木賊鐮孢菌(F.equiseti)，227#為變紅鐮孢菌(F.incarnatum)，229#為番茄匍柄霉(S.lycopersici)，230#為產(chǎn)酶短梗霉(A.proteae)，232#為葡柄霉(S.armeriae)。

3 討 論

據(jù)報(bào)道，棗果實(shí)常見(jiàn)的病害有噬棗歐文氏細(xì)菌引起的縮果病，真菌性病害有小穴殼菌引起的褐斑病，盤(pán)長(zhǎng)孢狀炭疽菌引起的蕉葉病，鐮孢菌引起的蒂腐病，鏈格孢或毀滅莖點(diǎn)霉或殼梭孢屬引起的鐵皮病，以及由炭疽菌、鐮孢菌、莖點(diǎn)霉和鏈格孢等多種真菌侵入引起的爛果病[23-24]。

鐮刀菌是葡萄、華萊士瓜等水果常見(jiàn)病原真菌[25-26]，有研究者從棗果實(shí)上分離到尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)，證實(shí)該菌可導(dǎo)致棗軟果腐病或?qū)е聽(tīng)€果[27-28]。本研究從采后貯藏期間棗果實(shí)上分離的221#木賊鐮刀菌(F.equiseti)和227#變紅鐮孢菌(F.incarnatum)同樣會(huì)導(dǎo)致棗果實(shí)軟化并腐爛，但目前未見(jiàn)到這兩種菌侵染棗果實(shí)的報(bào)道。因此，本研究分離到了兩株引起棗果實(shí)采后病害的鐮刀菌，希望為該屬真菌對(duì)宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求及其代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制的研究提供新思路。

短柄霉屬病原菌可以侵染果實(shí)，引起果實(shí)采后病害。有研究從葡萄和棗果實(shí)上分離得到出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，證實(shí)該菌可導(dǎo)致果實(shí)腐爛[29-30]。本研究從棗果實(shí)上分離到1株產(chǎn)酶短梗霉230#(A.proteae)，該菌已有導(dǎo)致小麥赤霉病的報(bào)道[31]，但其引起的水果采后病害情況鮮有報(bào)道，尤其是該菌引起棗果實(shí)采后貯藏過(guò)程中的病害未見(jiàn)報(bào)道。

本研究分離到的229#番茄匍柄霉(S.lycopersici)可導(dǎo)致番茄和蘆筍等葉斑病[32-33]，而目前未見(jiàn)該種菌可侵染棗果實(shí)導(dǎo)致棗采后病害發(fā)生的報(bào)道。目前未見(jiàn)菌株232#葡柄霉(S.armeriae)引起的植物病害的報(bào)道，尤其是引起果蔬采后病害的報(bào)道。

4 結(jié) 論

本研究從采自新疆阿克蘇地區(qū)的冬棗和駿棗果實(shí)上分離得到5株絲狀病原真菌。結(jié)合5株絲狀真菌形態(tài)學(xué)特征及rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，確定病原菌221#為木賊鐮孢菌(F.equiseti)、227#為變紅鐮孢菌(F.incarnatum)、229#為番茄匍柄霉(S.lycopersici)、230#為產(chǎn)酶短梗霉(A.proteae)和232#為葡柄霉(S.armeriae)，目前這5種菌均未發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致棗采后病害發(fā)生的報(bào)道，其中S.armeriae未見(jiàn)引起的植物病害的報(bào)道。本研究在采后侵染性病害的棗果實(shí)中發(fā)現(xiàn)了文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道的5株絲狀真菌，希望本研究結(jié)果可為新疆棗果實(shí)病害的有效防治提供進(jìn)一步的參考。