葡萄籽粗多糖的體內(nèi)外抗氧化作用

裴晉紅， 栗學(xué)清， 張建斌， 衛(wèi)星星， 汪軍梅

(1.山西長治醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室， 山西 長治 046099；2.山西長治醫(yī)學(xué)院 職業(yè)與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室， 山西 長治 046099；3.山西長治醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室， 山西 長治 046099)

多糖是一類普遍存在于生物體的活性物質(zhì)，具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、免疫增強[3]、降血糖[4]、降血脂[5]等生物學(xué)功能，臨床上被用于治療多種疾病。多糖的抗氧化性與其抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功能密切相關(guān)，因此對其抗氧化性的研究有助于闡明多糖多種生理功能的作用機理。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)及功能損傷的重要原因，越來越多的研究證實許多植物提取物具有很強的抗氧化活性，可對抗細胞氧化應(yīng)激[6]。研究表明：葡萄籽含有多種成分，如不飽和脂肪酸[7-8]、多糖[9]、原花青素[10]等，具有抗腫瘤[11]、抗氧化[12]、抗炎[8]、降血壓[13]等多種功能。

葡萄籽作為葡萄制品的副產(chǎn)物，不但污染環(huán)境且造成資源浪費，因此，對葡萄籽進行開發(fā)和利用具有重要意義。目前對葡萄籽的研究較多集中在葡萄籽油和原花青素的生理功能上，也有部分學(xué)者對葡萄籽粗多糖(crude polysaccharides from grape seeds,GSCPs)的抗氧化性進行了研究，但僅停留在體外，對其體內(nèi)抗氧化活性鮮有報道。

本研究利用水提醇沉法從葡萄籽中提取粗多糖，檢測其對DPPH自由基、羥自由基清除作用及對DNA氧化損傷的抑制作用；在細胞水平研究GSCPs對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷RAW 264.7巨噬細胞的保護作用；以秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，C.elegans)為模式生物，分別檢測GSCPs對其壽命、抗急性氧化應(yīng)激能力及體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的影響。本研究從細胞外、細胞內(nèi)及動物水平多角度對GSCPs的抗氧化活性進行研究，旨在為多糖的其他生理功能的深入研究奠定理論基礎(chǔ)，為葡萄籽的開發(fā)及綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽，市售巨峰葡萄制作葡萄酒后的副產(chǎn)物；RAW 264.7巨噬細胞，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院；大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)OP50、N2野生型秀麗隱桿線蟲(C.elegansBristolN2)，長治醫(yī)學(xué)院生物實驗室保存；SOD檢測試劑盒、GSH- Px檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；活性氧檢測試劑盒、CCK8(cell counting kit 8)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PUC18質(zhì)粒，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司；維生素C、鄰菲羅啉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)，美國sigma公司；NGM培養(yǎng)基，美國MyBioSource公司；線蟲 M9 緩沖液，赫澎生物上?？萍加邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

DMI 3000 B型倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司；Sunrise- Basic型酶標儀，瑞士Tecan公司；DP/N- 2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京亞歐德鵬科技有限公司；BJPX- 150型生化培養(yǎng)箱，山東博科科學(xué)儀器有限公司；Amicon Ultra- 15型超濾管，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1GSCPs的制備

取適量葡萄籽冷凍干燥，粉碎后過60目篩，經(jīng)石油醚脫脂，熱水浸提(65 ℃，6 h)，減壓濃縮、Sevag法脫蛋白、雙蒸水過夜透析，醇沉(加入4倍的體積分數(shù)為95%的乙醇)，將粗多糖沉淀用蒸餾水復(fù)溶后，裝入截留相對分子質(zhì)量為3 000 Da的超濾管中，在上層多糖溶液中反復(fù)加入蒸餾水進行超濾，之后將超濾管上層溶液進行冷凍干燥后制得GSCPs，用于后續(xù)抗氧化實驗。

1.3.2GSCPs對DPPH自由基清除作用的檢測

GSCPs對DPPH自由基清除率的檢測參考文獻[14]稍作改動。分別取30 μL質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的GSCPs樣品，將150 μL濃度為60 μmol/L的DPPH溶液加入其中(DPPH溶液以體積分數(shù)為95%的乙醇配制)，室溫密封避光反應(yīng)1 h，517 nm處測吸光度值，每組重復(fù)3次，以維生素C作為陽性對照，按照式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式(1)中，As為實驗組吸光度值，Ab是DPPH被體積分數(shù)為95%的乙醇替代后的吸光度值，Ac為樣品被雙蒸水替代后的吸光度值。

1.3.3GSCPs對羥自由基清除作用的檢測

GSCPs對羥自由基清除率的檢測參考文獻[14]進行。40 μL FeSO4(濃度為2 mmol/L)中加入40 μL鄰菲羅啉(濃度為2 mmol/L)，再分別加入質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL多糖樣品80 μL，之后加入40 μL H2O2啟動反應(yīng)(H2O2體積分數(shù)為0.03%)，37 ℃中孵育1 h，536 nm處測吸光度值，每組重復(fù)3次。按照式(2)計算清除率。

(2)

式(2)中，Am為實驗組吸光度值，An是多糖被雙蒸水替代后的吸光度值，Ak是H2O2被雙蒸水代替后的吸光度值。

1.3.4GSCPs對DNA氧化損傷抑制作用的檢測

DNA氧化損傷抑制實驗參考文獻[15]進行。實驗設(shè)置樣品組、損傷組和無損傷組。樣品組：取8 μL PUC18質(zhì)粒DNA，加入2 μL FeSO4(濃度為2 mmol/L)與8 μL多糖樣品(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL)，混勻后，加入2 μL H2O2啟動反應(yīng)(H2O2濃度為0.1 mmol/L)；損傷組：取8 μL PUC18質(zhì)粒DNA，加入2 μL FeSO4(濃度為2 mmol/L)與8 μL雙蒸水，混勻后，加入2 μL H2O2啟動反應(yīng)(H2O2濃度為0.1 mmol/L)；無損傷組：8 μL PUC18質(zhì)粒DNA。將各組樣品置于37 ℃水浴中保溫10 min，以質(zhì)量濃度為10 g/L瓊脂糖凝電泳進行分析。

1.3.5RAW 264.7巨噬細胞活力的檢測

用細胞增殖實驗檢測RAW 264.7巨噬細胞的活力。

含體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中接種RAW 264.7巨噬細胞，37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)至細胞愈合度約80%～90%，以質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化。

96孔板中接種巨噬細胞(細胞密度為2×105個/mL)200 μL，培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基棄去，加入含不同質(zhì)量濃度GSCPs(0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL)的培養(yǎng)基，對照組培養(yǎng)基中不加多糖，各濃度分別設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加Cell Counting Kit- 8(CCK8)溶液后再培養(yǎng)3 h，450 nm處測吸光度，以式(3)計算細胞的存活率。

(3)

1.3.6RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)ROS水平的檢測

本研究團隊前期已建立RAW 264.7巨噬細胞氧化損傷模型，根據(jù)前期實驗結(jié)果，選擇濃度為0.2 mmol/L的H2O2誘導(dǎo)細胞的氧化損傷。

6孔板中接種RAW 264.7巨噬細胞，細胞密度為2×105個/mL。以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h，分別設(shè)置對照組(含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基)、H2O2組(在含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中加入H2O2，使其終濃度為0.2 mmol/L)、H2O2+GSCPs組(在含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中加入H2O2使其終濃度為0.2 mmol/L，同時加入GSCPs，使其質(zhì)量濃度達到0.2 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用無血清細胞培養(yǎng)液以體積比1∶1 000稀釋DCFH- DA探針，使其終濃度為10 μmol/L，之后在每孔中加入稀釋好的探針1 mL，37 ℃避光保溫40 min。用pH=7.4的PBS洗滌細胞3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)抗氧化酶活性的測定

6孔板中接種密度為2×105個/mL的RAW 264.7巨噬細胞，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別設(shè)置對照組(含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基)、H2O2組(在含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中加入H2O2，使其終濃度為0.2 mmol/L)、H2O2+GSCPs組(在含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中加入H2O2使其終濃度為0.2 mmol/L，同時加入GSCPs，使其質(zhì)量濃度達到0.2 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞，加裂解液，冰浴30 min，4 ℃離心15 min(12 000 r/min)，檢測GSH- Px和SOD活性(檢測方法參照劑盒說明書)。

1.3.8秀麗隱桿線蟲壽命的測定

秀麗隱桿線蟲壽命的測定參考文獻[16]進行。同期化培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲至L2期，將線蟲分別挑至含質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL GSCPs的OP50 NGM培養(yǎng)板中，計為第1天。之后每天在固定時間將存活的線蟲挑至新平板中，記錄存活的線蟲數(shù)，到線蟲全部死亡為止。每組線蟲取30條，重復(fù)3次。

1.3.9秀麗隱桿線蟲急性氧化應(yīng)激的測定

秀麗隱桿線蟲急性氧化應(yīng)激測定參考文獻[17]進行。取同期化蟲卵分別在含有質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的GSCPs的培養(yǎng)板上培養(yǎng)72 h，將線蟲挑至含有6 mmol/L H2O2的M9溶液中，隔1 h記錄一次存活的線蟲數(shù)，至線蟲全部死亡為止。每組線蟲30條，重復(fù)3次。

1.3.10秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平的測定

秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS的測定參考文獻[18]進行。采用ROS- 敏感染料DCFH- DA檢測不同濃度GSCPs對線蟲ROS水平的影響。線蟲同期化培養(yǎng)至成蟲，分別在含有質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的GSCPs的培養(yǎng)板上培養(yǎng)48 h，用M9緩沖液將線蟲洗下并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，用含有20 μmmol/L DCFH- DA的M9緩沖液20 ℃溫浴30 min，離心后去除上清液，M9緩沖液反復(fù)洗滌3次，用200 μL M9緩沖液重懸，轉(zhuǎn)移到96孔黑色酶標板中，在激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為485 nm和535 nm條件下進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，分析方法為t檢驗和方差分析，P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSCPs對DPPH自由基和羥自由基的清除作用

圖1為GSCPs對DPPH自由基和羥自由基清除作用的檢測結(jié)果，通過GSCPs對DPPH自由基和羥自由基的清除能力確定其抗氧化活性。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，當(dāng)自由基清除劑存在時，由于其自由基清除作用可使DPPH紫色消退，其最大吸收波長517 nm處測吸光度值減小。由圖1(a)可知，隨著GSCPs濃度的升高，對DPPH的清除能力逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，GSCPs對DPPH的清除率達84%，接近質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的維生素C的清除率。

羥自由基清除實驗中，鄰菲羅啉與Fe2+形成絡(luò)合物，在536 nm處有最大吸收峰。H2O2通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基可將絡(luò)合物中的Fe2+氧化為Fe3+導(dǎo)致其最大吸收峰消失。如果反應(yīng)體系中存在羥自由基清除劑，絡(luò)合物受到的破壞則相對減少。由圖1(b)可知，GSCPs具有較強的羥自由基清除能力，且隨濃度升高，清除力逐漸升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，GSCPs的羥自由基清除率為89%。

*表示組間差異顯著(P<0.05)。圖1 GSCPs對DPPH自由基和羥自由基的清除活力Fig.1 DPPH and hydroxyl radical scavenging activity of GSCPs

2.2 GSCPs對DNA氧化損傷的抑制作用

圖2為GSCPs對DNA氧化損傷的抑制作用。泳道1、2、3分別為無損傷組、損傷組和樣品組。對3組條帶進行比較可知：泳道1中超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒DNA(scDNA)條帶清晰，說明無損傷組質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)完好；泳道2中超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA基本消失，說明損傷組質(zhì)粒DNA氧化損傷嚴重；泳道3出現(xiàn)了超螺旋條帶，說明GSCPs組與損傷組相比，損傷程度有所降低。研究結(jié)果表明GSCPs可抑制DNA氧化損傷。

泳道1為無損傷組；泳道2為損傷組；泳道3為樣品組。圖2 GSCPs對DNA氧化損傷的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of GSCPs on oxidative damage of DNA

2.3 GSCPs對RAW 264.7巨噬細胞活力的影響

圖3為GSCPs對RAW 264.7巨噬細胞活力的影響。由圖3可知，與對照組相比，質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的GSCPs對巨噬細胞存活率無明顯影響，說明該濃度可以用于后續(xù)的ROS實驗。

圖3 GSCPs對RAW 264.7巨噬細胞活力的作用Fig.3 Effect of GSCPs on cell viability of RAW 264.7 macrophages

2.4 GSCPs對RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)ROS水平的影響

ROS是機體細胞代謝過程中產(chǎn)生的含氧的化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)，正常生理狀態(tài)下參與維持機體的生理平衡，過量ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)和生物分子功能改變，進而導(dǎo)致細胞損傷。圖4是用DCFH- DA探針法檢測RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)活性氧水平的熒光顯微鏡圖和光鏡圖，由圖4可知，H2O2處理組的熒光強度最強，H2O2+GSCPs組與前者相比熒光強度降低，說明GSCPs可有效抑制H2O2誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞的氧化損傷。

圖片放大倍數(shù)均為100倍。圖4 DCFH- DA探針法檢測RAW 264.7巨噬細胞內(nèi) ROS水平Fig.4 Intracellular ROS level in RAW 264.7 macrophages indicated by DCFH- DA probe method

2.5 GSCPs對RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響

圖5為GSCPs對RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)SOD和GSH- Px水平的影響。細胞內(nèi)完善的抗氧化防御體系可清除自由基，如抗氧化酶SOD和GSH- Px即是抗氧化防御體系的重要成員。由圖5可知，與對照組相比較，H2O2組細胞內(nèi)抗氧化酶活性均有所下降，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的GSCPs處理組可使胞內(nèi)SOD活性從H2O2處理組的81.1%升高到96.3%。GSH- Px活性從H2O2處理組的92.1%升高到99.6%。說明GSCPs可正向調(diào)節(jié)H2O2介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)抗氧化酶活性，逆轉(zhuǎn)H2O2介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞的氧化損傷。

圖5 GSCPs對RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)SOD和GSH- Px 水平的影響Fig.5 Effect of GSCPs on levels of SOD and GSH- Px in RAW 264.7 macrophages

2.6 GSCPs對秀麗隱桿線蟲壽命及存活率的影響

壽命是機體衰老指標之一，而衰老理論之一是過多的自由基在體內(nèi)積聚，破壞核酸、蛋白質(zhì)等生物分子的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細胞功能受損促進衰老和死亡。圖6是GSCPs對秀麗隱桿線蟲存活率的影響，表1是GSCPs對線蟲壽命的影響。由圖6和表1可知，對照組最長壽命為16.83天，平均壽命為9.54天，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的GSCPs組的最長壽命和平均壽命分別為17.17天和9.48天，差異不顯著；質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的GSCPs組的最長壽命和平均壽命分別為19.50天和10.57天，質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的GSCPs組的最長壽命和平均壽命分別為20.50天和12.18天，差異均具有顯著性(P<0.05)，研究結(jié)果表明：GSCPs可延長線蟲壽命，其中以質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的GSCPs組效果最佳。

圖6 GSCPs對秀麗隱桿線蟲存活率的影響Fig.6 Effect of GSCPs on survival rates of Caenorhabditis elegans

表1 GSCPs對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

2.7 GSCPs對秀麗隱桿線蟲急性氧化應(yīng)激的影響

圖7是GSCPs對急性氧化應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響，表2是GSCPs對急性氧化應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲生存時間的影響。由圖7和表2可知，急性氧化應(yīng)激條件下對照組線蟲的最長生存時間和平均生存時間分別為4.67 h和3.04 h，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL GSCPs組的最長生存時間和平均生存時間分別為4.33 h和3.27 h，二者無顯著性差異。質(zhì)量濃度為0.4、0.8 mg/mL GSCPs處理組線蟲的最長生存時間分別為5.67 h和6.00 h，平均生存時間分別為3.66 h和4.07 h，差異具有顯著性(P<0.05)，研究結(jié)果說明GSCPs對急性氧化應(yīng)激的秀麗隱桿線蟲有顯著的保護作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時保護作用最佳，該結(jié)果與秀麗隱桿線蟲壽命延長實驗結(jié)果一致。

圖7 GSCPs對急性氧化應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲 存活率的影響Fig.7 Effects of GSCPs on survival rates of Caenorhabditis elegans under acute oxidative stress

表2 GSCPs對急性氧化應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲生存時間的影響

2.8 GSCPs對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平的影響

圖8是GSCPs對秀麗隱桿線蟲ROS生成量的影響。由圖8可知GSCPs處理組與對照組相比ROS水平有所下降，隨濃度增加，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平逐漸降低，質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL GSCPs處理組的ROS清除效果最為顯著(P<0.05)，相比對照組降低了56.33%。研究數(shù)據(jù)表明：GSCPs可有效降低線蟲體內(nèi)的ROS，對抗由于ROS過量引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

*表示組間差異顯著(P<0.05)。圖8 GSCPs對秀麗隱桿線蟲ROS生成量的影響Fig.8 Effects of GSCPs on ROS levels of Caenorhabditis elegans

3 結(jié) 論

葡萄籽資源豐富且易獲得，但目前對葡萄籽的利用率不高，大多數(shù)被填埋或經(jīng)加工后作為動物飼料。本實驗利用水提醇沉法提取GSCPs，從體內(nèi)外研究其抗氧化活性。結(jié)果表明：GSCPs具有對DPPH自由基、羥自由基清除能力及抑制DNA氧化損傷的活性，質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的GSCPs對DPPH的清除率達84%，對羥自由基清除率為89%；GSCPs可下調(diào)氧化損傷的RAW 264.7巨噬細胞ROS水平，提高細胞內(nèi)SOD和GSH- Px活性，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的GSCPs處理組可使細胞內(nèi)SOD活性從H2O2處理組的81.1%升至96.3%，GSH- Px活性從H2O2處理組的92.1%升至99.6%。體內(nèi)抗氧化檢測表明：GSCPs可延長秀麗隱桿線蟲壽命，降低其氧化應(yīng)激水平，減少秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的ROS。質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 的GSCPs處理組秀麗隱桿線蟲的平均壽命較對照組延長27.67%，將急性氧化應(yīng)激的秀麗隱桿線蟲平均存活時間延長33.58%，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS生成量較對照組可降低56.33%。體內(nèi)實驗與體外實驗結(jié)果一致，提示GSCPs具有氧化應(yīng)激損傷的保護作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起細胞損傷或凋亡，從而引起腫瘤、心腦血管病變等多種疾病的發(fā)生[19]。目前，對氧化應(yīng)激損傷機制的研究以及由于氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的各種疾病的治療藥物的研發(fā)均未有突破性進展。未來課題組將繼續(xù)研究葡萄籽粗多糖的成分、結(jié)構(gòu)及抗氧化作用機理，以期為相關(guān)疾病的治療提供思路，同時為保健品、化妝品等功能產(chǎn)品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。