GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)22NC在福建漢族人群的遺傳多態(tài)性和法醫(yī)學應用價值

陳金煙， 韓俊永， 王坤， 金靜君， 薛士杰

福建省位于中國東南沿海，總面積1.24萬km2，常住人口為4.187×107人[1]，是一個多民族聚居的地方。其中，漢族為主體民族，人口為3.661×107人，占97.84%；少數民族中畬族占比最多，共37萬人，占福建省少數民族人口的45.87%；回族人口11.6萬人，滿族次之[2]。短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat, STR)基因座指由2～6個堿基重復序列組成的一段DNA，具有遺傳平衡、高度遺傳多態(tài)性、穩(wěn)定性的特點，且分析快速、廉價、易于自動化，被廣泛用于親子鑒定、法醫(yī)案件調查和大規(guī)模災難受害者的身份識別等，近年來更是成為細胞鑒定的“金標準”。GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC是由基點認知技術(北京) 有限公司研發(fā)的包含20個非CODIS (combined DNA index system) STR基因座、1個CODIS STR基因座(D3S1358) 和性別基因座Amelogenin的五色熒光STR復合擴增試劑，目前已用于檢測國內多個地區(qū)不同民族人群STR基因座基因頻率分布[3]。本研究應用該試劑盒對福建漢族人群的21個常染色體STR基因座進行檢測并分析其遺傳多態(tài)性，為福建地區(qū)漢族人口的法醫(yī)學個體識別和親權鑒定提供基礎數據，也為福建地區(qū)漢族與其他地區(qū)漢族及其他民族之間的基因頻率分布差別鑒定提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象 樣本量的估計參考群體遺傳學調查的要求[4]，常染色體STR基因座的檢測至少需要500人份以上，本次研究擬納入福建省醫(yī)學科學研究院明正司法鑒定所受理的親子鑒定案例中福建地區(qū)漢族人口，即擁有福建籍貫且在福建連續(xù)居住時間不少于5 a的562例漢族健康的無關個體，其中男性347例，女性215例。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。根據委托協(xié)議，患者均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

1.2.1 DNA提取 采集研究對象末梢血5～50 μL。采用常規(guī)Chelex-100法進行新鮮外周血DNA提取[5]。吸取5～50 μL血樣加入1 mL的Tris-EDTA (TE) 緩沖液，顛倒混勻后室溫靜置 30 min，轉速12 000 r/min 離心3 min，棄上清液留取沉淀，加入260 μL含5%的Chelex-100，置56 ℃水浴 30 min消化，再于100 ℃煮沸8 min，轉速12 000 r/min 離心 3 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 STR檢測 采用GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC 試劑盒10 μL體系對21個常染色體STR基因座(D6S477、D22-GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D17S1290、D14S608、D18S535、D13S325、D10S1435、D11S2368、D7S3048、D19S253、D1S1656、D2S441、D10S1248、D3S1744、D7S1517、D5S2500、D4S2366和D3S1358)和性別基因座Amelogenin進行復合五色熒光PCR擴增。擴增體系組成：2.5× PCR反應緩沖液4 μL ，5×引物混合液2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板0.5～2 ng；陽性對照為標準品DNA 9948 (美國Promega公司)；擴增條件：95 ℃預變性11 min；94 ℃變性30 s→60 ℃退火60 s→70 ℃延伸60 s，循環(huán)30次，60 ℃延伸30 min，15 ℃保溫；PCR擴增反應在9700型擴增儀(美國Applied Biosystems公司)上進行。PCR產物在3130型遺傳分析儀(美國AB公司)上進行毛細管電泳，STR基因座采用GeneMapper ID v3.2.1軟件進行分型。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Modified-Powerstates v1.2軟件計算21個常染色體STR基因座的基因分布頻率、Hardy-Weinberg平衡檢驗和群體遺傳多樣性參數。運用Arlequin v3.5軟件的分子方差分析(analysis of molecular variance， AMVOA)計算福建地區(qū)漢族與其他地區(qū)漢族及其他民族的相應位點基因頻率分布差別，經Bonferroni多重校正檢驗后P<0.002 4 (P<0.05/21) 為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 福建漢族人群21個常染色體STR基因座等位基因頻率分布 本研究應用GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng) 22NC 試劑盒檢測 562 例無關個體的 21 個STR基因座等位基因片段的大小，共觀察到 229 個等位基因、860 種基因型；經Modified-Powerstates v1.2 軟件計算等位基因頻率分布范圍為0.000 9～0.375 4，最高值為基因座D10S1248的基因型13；21 個等位基因呈現(xiàn)高度基因多態(tài)性，基因型分布范圍為5(D14S608)～28(D7S1517)(表1)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗及遺傳多態(tài)性分析 經Hardy-Weinberg平衡檢驗，除D6S477、D22-GATA198B05和D5S2500基因座外，其余18個等位基因的基因型觀察值與預期值比較，進行χ2檢驗，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，符合遺傳平衡定律；而D6S477(P=0.031 8)、D22-GATA198B05(P=0.031 5)和D5S2500(P=0.049 5)經Bonferroni 多重校正檢驗后也符合Hardy-Weinberg平衡定律。21個常染色體STR基因座的個體識別率(discrimination, DP)均>0.85，在群體中的累積個體識別率(combined power of discrimination, CDP)為1-3.7718×10-26(表2)?；诟骰蜃g互相獨立，運用乘法法則計算后得到該系統(tǒng)21個基因座的累積非父排除率 (combined power of exclusion, CPE) 為1-2.9531×10-9。

2.3 福建漢族人群與其他地區(qū)人群的基因頻率比較 將福建漢族人群的21個基因座的基因頻率分別與中國南方漢族、北方漢族、東部漢族、西部漢族、海南漢族以及海南黎族、西藏藏族、維吾爾族人群的基因頻率分布進行比較，發(fā)現(xiàn)福建漢族人群等位基因亞型分布頻率與其他地區(qū)人群存在一定差別。GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC檢測系統(tǒng)未獲得南方漢族、北方漢族、西部漢族和維吾爾族群體遺傳信息數據，本研究參考其他檢測系統(tǒng)的相同STR基因座群體遺傳學數據；22NC檢測系統(tǒng)已獲得針對東部漢族、海南漢族、海南黎族和藏族等群體的21個STR基因座群體遺傳數據。福建漢族人群與東部漢族有10個基因座的等位基因頻率分布差別無統(tǒng)計學意義，與南方漢族有6個、北方漢族有3個、西部漢族有5個基因座、海南漢族有6個基因座的等位基因頻率分布差別無統(tǒng)計學意義，與海南黎族僅有2個、維吾爾族有1個基因座的等位基因頻率分布差別也無統(tǒng)計學意義，與藏族有7個基因座的等位基因頻率分布差別無統(tǒng)計學意義。福建漢族人群在D8S1132、D10S1435、D11S2368、D1S1656和D7S3048基因座的基因頻率分布與其他幾個地區(qū)漢族差別有統(tǒng)計學意義(P<0.002 4，表3)。

2.4 實際案例應用 根據2021年發(fā)布的《生物學全同胞關系鑒定技術規(guī)范》(SF/T 0117—2021)，狀態(tài)一致性評分(identity by state score, IBS)為對于每一個STR基因座而言，兩名有爭議個體之間的狀態(tài)一致性等位基因的個數。累計狀態(tài)IBS(cumulative identity by state score, CIBS)為兩名個體在同一基因座上可出現(xiàn)相同的等位基因，這種可能來源于遺傳，也可能來源于隨機匹配的一致性被稱為狀態(tài)一致性，該等位基因也被稱為狀態(tài)一致性等位基因。當采用包含多個相互獨立的常染色體遺傳標記分型系統(tǒng)對兩名有爭議個體進行檢測時，各個遺傳標記上IBS之和為CIBS。本實驗室聯(lián)合利用PowerPlex?21 System系統(tǒng)(美國Promega公司)和GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC 試劑盒，對父母皆無的2名個體進行生物學全同胞關系的鑒定，依據規(guī)范檢測二者在39個常染色體STR基因座的分型，并計算了IBS為52，高于規(guī)范認定為全同胞的CIBS閾值(>40)，故傾向認為二者為生物學全同胞(表4)。

3 討 論

GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC共包含20個非CODIS STR基因座、1個CODIS STR基因座(D3S1358) 和性別基因座Amelogenin，其中D3S1358基因座在多種常用常染色體檢測系統(tǒng)中均有包含，可為使用不同試劑盒之間的相互驗證，同時，聯(lián)合該系統(tǒng)與PowerPlex?21 System系統(tǒng)(美國Promega公司)和AGCU 21+1 STR熒光檢測系統(tǒng)(中德美聯(lián)公司)使用，可使檢測基因座數目達到55個，具有極高的非父排除率(power of exclusion, PE)和DP，同時也能滿足中華人民共和國司法部司法鑒定管理局于2021年發(fā)布的《生物學全同胞關系鑒定技術規(guī)范》(SF/T 0117—2021)建議的補充基因座的要求。

表1 福建漢族人群21個常染色體STR基因座的等位基因頻率

我國是一個以漢族為主的多民族聚居國家，幅員遼闊、人口眾多，但生產力分布不均，決定了人口分布不平衡，因此，調查各基因座在不同地區(qū)漢族人群的基因頻率，對我國漢族人群遺傳學研究、法醫(yī)學DNA數據庫的建立及親權鑒定的應用均有重要意義。本研究中，筆者運用GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC對福建漢族人群的21個常染色體STR基因座的遺傳多態(tài)性進行調查，并獲得相應的群體遺傳學數據。每一套檢測系統(tǒng)的遺傳分析、個體識別與親權鑒定均在Hardy-Weinberg平衡定律的基礎上統(tǒng)計分析。本研究21個基因座在福建漢族人群的基因型、基因頻率分布及遺傳多態(tài)性等，均符合Hardy-Weinberg平衡定律。除D3S1358基因座外，其余20個STR基因座均為高鑒別力(DP>0.9)、高多態(tài)信息含量(PIC>0.7)的高度多態(tài)性基因；CPE和CDP均符合司法部《親權鑒定技術規(guī)范》(GB/T 37223—2018)的相關要求。本研究結果表明，這21個STR基因座在福建漢族人群中具有良好的遺傳多態(tài)性，聯(lián)合應用具有高度法醫(yī)學個人識別和親權鑒定應用價值。

表2 福建漢族人群21個常染色體STR基因座群體遺傳和法醫(yī)遺傳學參數

表3 福建漢族人群21個STR基因座與中國不同地區(qū)人群等位基因頻率比較

表4 生物學全同胞姐弟39個STR基因座的基因分型檢測結果及IBS評分

最新版《生物學全同胞關系鑒定技術規(guī)范》(SF/T 0117—2021)中提到：在雙親皆無情況下，檢測規(guī)定的19個必檢STR基因座基礎上增加20個不存在連鎖不平衡的其他常染色體STR基因座，以提高系統(tǒng)效能。本研究的實際案例應用中，PowerPlex?21 System系統(tǒng)包含了19個必檢STR基因座，但其系統(tǒng)效能僅為0.565 5，而GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC 試劑盒則提供了規(guī)范中推薦的補充檢測20個STR基因座，使檢測系統(tǒng)效能高達0.978 2，大大提高了本鑒定的系統(tǒng)效能，并降低了錯判風險。

本研究應用Arlequin Version 3.5軟件分析比較福建漢族和其他地區(qū)漢族及其他民族的相應基因座基因頻率分布差別。根據文獻[13]報道，我國漢族可分為南方漢族和北方漢族。然而，在漫長的歷史進程中，我國漢族經歷了多次的遷移、融合和分化，不同地區(qū)漢族人群已形成不同亞群獨特的分子遺傳結構特征[14]。福建漢族與東部漢族等位基因頻率分布中，21個基因座有10個差別無統(tǒng)計學意義，具有一定的共性，這可能與福建地區(qū)地處東南沿海、位置相近及歷史人口遷徙等原因有關；福建漢族與北方漢族的等位基因頻率分布差別性較大，共18個基因座，有15個差別有統(tǒng)計學意義，約占83%，僅D22-GATA198B05、D15S659和D18S535 3個基因座差別無統(tǒng)計學意義；同時，與西部漢族(共15個基因座，有10個差別有統(tǒng)計學意義)、南方漢族(共16個基因座，有10個差別有統(tǒng)計學意義)和海南漢族(共21個基因座，有15個差別有統(tǒng)計學意義)等位基因頻率分布差別也比較大，這與張蒙等[14]的研究結論一致，即福建、浙江和上海等漢族亞群與其他南方漢族亞群的遺傳距離較遠。由此可見，不同地域的漢族人群同一基因座的基因頻率分布也不盡相同，這可能與不同地區(qū)漢族群體的起源不同、歷史上的人口遷徙及長江地理隔離等有關。福建漢族與部分少數民族的基因頻率分布比較，差別更為顯著，說明彼此之間的基因交流和融合很少。綜上所述，本研究對不同地區(qū)人群基因頻率分布進行比較分析，對研究人群的源流、人口遷移及人類遺傳學具有重要意義，同時也提示在法醫(yī)學等實際應用中應注意不同地區(qū)人群或民族基因頻率的選擇。