臭椿酮抑制急性骨髓性白血病細胞惡性生物學行為的研究

徐奔，覃銳，向航，許京淑，廖子龍，向金平

恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院血液科，湖北 恩施445000

急性骨髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種髓性白細胞異常增殖的血液腫瘤，具有高度異質(zhì)性，死亡率較高。目前，臨床治療AML多采用化療、干細胞移植等方法，雖然可以一定程度上緩解疾病進程，但AML易復發(fā)、患者預后差等問題仍然是影響患者生命安全和生活質(zhì)量的關鍵［1-2］。因此，在臨床上需要深入探究AML的發(fā)病機制以尋找更有效的低毒藥物和潛在靶點，改善患者預后，降低死亡率。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及細胞基因組學的改變，微小RNA（microRNA，miR）作為一種非蛋白編碼單鏈RNA，可通過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控介導基因的表達，在腫瘤細胞基因組學改變過程中發(fā)揮著關鍵作用［3-4］。miR-449a是miR-449家族的一員，其在非小細胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中表達下調(diào)，能夠調(diào)節(jié)癌癥相關基因表達，被認為是一種腫瘤抑制因子［5-7］。已有研究證實［8］，miR-449a能夠調(diào)節(jié)白血病細胞分化、增殖、凋亡等生物學過程，miR-449a在AML發(fā)病、治療中可能發(fā)揮著重要作用。臭椿酮（ailanthone，AIL）是從傳統(tǒng)藥用植物臭椿中提取的具有抗腫瘤、抗炎、抗瘧疾、抗過敏等生物活性的單體化合物。有文獻報道［9］，AIL對乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用，然而，AIL對AML細胞的作用效果尚未完全明確。本研究旨在揭示AIL對AML細胞惡性生物學行為的影響，并分析其作用機制是否與調(diào)控miR-449a相關，以期為AML的治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人AML系HL-60細胞株（中國科學院上海生命科學院細胞庫）；AIL（純度＞98%，瑞芬思生物科技有限公司）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（日本同仁化學研究所）；Matrigel基質(zhì)膠（上海尚善生物科技有限公司）；Transwell小室（美國Millipore公司）；RNA提取試劑盒與反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；miR-449a mimic質(zhì)粒、mimic對照質(zhì)粒、miR-449a inhibitor質(zhì)粒、inhibitor對照質(zhì)粒（廣州銳博生物科技有限公司）；兔抗磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）單克隆抗體、鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG（H+L）和HRP標記的山羊抗鼠IgG（H+L）（美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)HL-60細胞株置于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素）中，在37℃，5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，細胞每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，取處于對數(shù)生長期的細胞開展實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染與分組 用不同濃度（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1）的AIL處理對數(shù)生長期的HL-60細胞24 h，檢測細胞增殖情況以篩選AIL適宜濃度用于后續(xù)實驗研究。將miR-449a mimic質(zhì)粒、mimic對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的HL-60細胞中，分別記為miR-449a mimic組、mimic NC組；將miR-449a inhibitor質(zhì)粒、inhibitor對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的HL-60細胞，并用適宜濃度的AIL處理細胞24 h，記為AIL+miR-449a inhibitor組、AIL+inhibitor NC組，以未經(jīng)任何處理的細胞作為陰性對照組（Control組）。轉(zhuǎn)染過程嚴格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的HL-60細胞，以5×104cell·mL-1濃度接種于96孔板貼壁培養(yǎng)，用不同終濃度（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1）AIL處理細胞，同時按照1.2.2的方法設置分組，每組設置5個復孔，于37℃條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，使用酶標儀在450 nm波長下測定每個孔的吸光度（OD450）值，按公式（1）計算細胞增殖抑制率。實驗重復3次。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將經(jīng)過相應處理的HL-60細胞以1×106cell·mL-1濃度接種于6孔板培養(yǎng)至細胞貼壁生長后，每組設置5個復孔，用200 μL移液器槍頭垂直劃線，分別干預0和24 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞遷移情況，按公式（2）計算細胞遷移率。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力 預先用Matrigel基質(zhì)膠活化Transwell小室1 h。收集經(jīng)過處理的HL-60細胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋為5×108cel·lmL-1的細胞懸液，Transwell小室上室加入400 μL細胞懸液，下室加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基600 μL，Transwell小室在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用無菌棉簽輕輕擦去上室未侵襲細胞，用甲醇固定，0.1 %結(jié)晶紫染色5 min，隨機選取5個視野，計算細胞侵襲數(shù)。實驗重復3次。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 將經(jīng)過處理的HL-60細胞以5×105cell·mL-1濃度接種于6孔板培養(yǎng)24 h，每組設置5個復孔，用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC染液和5 μL PI染液，室溫下暗室孵育15 min。在流失細胞儀上分析細胞凋亡情況，按公式（3）計算細胞凋亡率。實驗重復3次。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%(3)

1.2.7 qRT-PCR法檢測細胞中miR-449a mRNA表達水平 收集處理過的HL-60細胞懸液，加入Trizol試劑提取總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA純度和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)qRT-PCR熒光定量試劑盒說明書配置反應體系，進行qRT-PCR實驗。引物 序 列 為：miR-449a上 游 引 物：5′-CTCGCTGGCAGTGTATTGTTAG-3′，下游引物：5′-TATCGTTGTACTCCAGACCAAGAC-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。循環(huán)條件為：95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，相對表達量采用2－△△Ct法計算。實驗重復3次。

1.2.8 Western blot法 檢測PI3K/AKT信 號 通路相關蛋白表達水平 收集處理過的HL-60細胞懸液，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫下在含0.5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，TBST洗膜3次，加入PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入對應HRP標記的二抗（1∶2 000），室溫下孵育2 h，加入ECL試劑顯影，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，對計量資料進行正態(tài)性檢驗，滿足正態(tài)性且組間方差齊，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較組間差異性，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 AIL對HL-60細胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示（圖1），與Control組比較，不同濃度AIL處理HL-60細胞24 h后，細胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05），且隨著AIL濃度增加，細胞增殖抑制率呈濃度依賴性增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。AIL處理HL-60細胞24 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（0.78±0.06）μmol·L-1，基于此，本研究后續(xù)細胞遷移、侵襲和凋亡實驗選擇0.6、0.8、1.0 μmol·L-1作為AIL處理HL-60細胞的濃度。

圖1 AIL對HL-60細胞增殖的影響視圖Fig.1 Effect of AIL on proliferation of HL-60 cells

2.2 AIL對HL-60細胞遷移、侵襲能力和凋亡的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示（圖2A），與Control組比較，0.6、0.8、1.0 μmol·L-1AIL組HL-60細胞遷移率均顯著降低（P＜0.05）。Transwell小室法結(jié)果顯示（圖2B），與Control組比較，0.6、0.8、1.0 μmol·L-1AIL組HL-60細胞侵襲數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。流失細胞術(shù)結(jié)果顯示（圖2C），與Control組比較，0.6、0.8、1.0 μmol·L-1AIL組HL-60細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。上述結(jié)果提示AIL抑制HL-60細胞遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。鑒于AIL對HL-60細胞生物學行為的作用隨濃度增大而增強，因此，本研究選擇1.0 μmol·L-1的AIL濃度作為轉(zhuǎn)染后HL-60細胞的作用濃度。

圖2 AIL對HL-60細胞遷移、侵襲能力和凋亡的影響Fig.2 Effects of AIL on migration,invasion and apoptosis of HL-60 cells

2.3 AIL對HL-60細胞miR-449a mRNA表達水平的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示（圖3），與Control組比 較，0.6、0.8、1.0 μmol·L-1AIL組HL-60細 胞miR-449a mRNA表達量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明AIL能夠上調(diào)HL-60細胞miR-449a的表達。

圖3 AIL對HL-60細胞miR-449a mRNA表達水平的影響Fig.3 Effect of AIL on miR-449a mRNA expression in HL-60 cells

2.4 過表達miR-449a對HL-60細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示（圖4A），與Control組比較，mimic NC組HL-60細胞中miR-449a mRNA表達量無顯著性變化（P＞0.05）；與mimic NC組比較，miR-449a mimic組HL-60細 胞 中miR-449amRNA表達量顯著升高（P＜0.05）。提示轉(zhuǎn)染效果良好。CCK-8實驗（圖4B）、劃痕實驗（圖4C）、Transwell小室法（圖4D）及流失細胞術(shù)（圖4E）結(jié)果顯示，mimic NC組HL-60細胞增殖抑制率、凋亡率、遷移率及侵襲數(shù)目與Control組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與mimic NC組比較，miR-449a mimic組HL-60細胞增殖抑制率、凋亡率均顯著升高，遷移率及侵襲數(shù)目均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果提示過表達miR-449a抑制HL-60細胞增殖、遷移、侵襲，并誘導細胞凋亡。

圖4 過表達miR-449a對HL-60細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig.4 Effects of overexpression of miR-449a on proliferation,apoptosis,migration and invasion of HL-60 cells

2.5 抑制miR-449a表達逆轉(zhuǎn)AIL對HL-60細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示（圖5A），與Control組比較，AIL組HL-60細胞中miR-449a mRNA表達量顯著升高（P＜0.05）；AIL+inhibitor NC組HL-60細胞中miR-449a mRNA表達量與AIL組細胞miR-449a mRNA表達水平相當，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與AIL+inhibitor NC組比較，AIL+miR-449a inhibitor組HL-60細 胞 中miR-449a mRNA表達量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果提示轉(zhuǎn)染效果良好。CCK-8實驗（圖5B）、劃痕實驗（圖5C）、Transwell小室法（圖5D）及流失細胞術(shù)（圖5E）結(jié)果顯示，與Control組比較，AIL組HL-60細胞增殖抑制率、凋亡率均顯著升高，遷移率及侵襲數(shù)目均顯著降低（P＜0.05）；AIL+inhibitor NC組HL-60細胞增殖抑制率、凋亡率、遷移率及侵襲數(shù)目與AIL組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與AIL+inhibitor NC組比較，AIL+miR-449a inhibitor組HL-60細胞增殖抑制率、凋亡率均顯著降低，遷移率及侵襲數(shù)目均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果提示抑制miR-449a表達能夠逆轉(zhuǎn)AIL抑制HL-60細胞增殖、遷移、侵襲及誘導凋亡的作用。

圖5 抑制miR-449a表達逆轉(zhuǎn)AIL對HL-60細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig.5 Effects of inhibition expression of miR-449a reverses the effects of AIL on proliferation,apoptosis,migration and invasion of HL-60 cells

2.6 抑制miR-449a表達逆轉(zhuǎn)AIL對HL-60細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達

Western blot法檢測結(jié)果顯示（圖6），與Control組 比較，AIL組HL-60細 胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均顯著降低（P＜0.05）；AIL+inhibitor NC組HL-60細胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值與AIL組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與AIL+inhibitor NC組比較，AIL+miR-449a inhibitor組HL-60細 胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均顯著升高（P＜0.05）。提示抑制miR-449a表達逆轉(zhuǎn)AIL抑制HL-60細胞PI3K/AKT信號通路的作用。

圖6 抑制miR-449a表達逆轉(zhuǎn)AIL對HL-60細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達Fig.6 Effects of inhibition expression of miR-449a reverses the regulatory effect of AIL on the expression of PI3K/Akt signaling pathway related proteins in HL-60 cells

3 討論

AML是血液系統(tǒng)患者死亡的主要原因之一，近年來，針對AML的治療已經(jīng)取得了一定進展，但仍無法徹底根治該疾病，因此，明確AML的發(fā)病機制，尋找新的治療策略勢在必行［10］?，F(xiàn)代中醫(yī)藥研究證實，中藥活性成分提取物在惡性腫瘤的防治中具有多靶點作用、毒性小等優(yōu)勢［11］。AIL是一種來源于中草藥臭椿的天然活性化合物，大量研究表明AIL可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。肝癌細胞中AIL可通過誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡阻止細胞生長［12］；黑色素瘤細胞中AIL通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路和線粒體介導的凋亡信號通路分別誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡［13］；研究還發(fā)現(xiàn)，AIL通過上調(diào)miR-148a表達及抑制AMPK和Wnt/β-catenin信號通路的活化抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲［14］；AIL通過下調(diào)miR-21和阻斷Ras/Raf/MEK/ERK及mTOR途徑抑制人前庭神經(jīng)鞘瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡和自噬［15］。上述研究結(jié)果表明，AIL可通過介導多種信號轉(zhuǎn)導通路和基因靶點調(diào)控腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、細胞周期阻滯、凋亡和自噬。本研究以不同濃度AIL處理白血病HL-60細胞發(fā)現(xiàn)，AIL對HL-60細胞具有增殖抑制作用，且增殖抑制作用隨AIL濃度增加而增強。本研究進一步檢測AIL對HL-60細胞遷移、侵襲和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)AIL能夠顯著抑制HL-60細胞遷移、侵襲并誘導細胞凋亡，說明AIL具有顯著的抗AML活性。

人體內(nèi)多種miR表達異常和腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關［16］。miR-449家族分布于5號染色體細胞分裂周期基因20B（cell division cycle gene 20B，CDC20B）的第二個內(nèi)含子上，該區(qū)域（5q11.2）是癌癥的強易感性位點，人體miR-449表達異?？赡芤鹉[瘤的發(fā)生及發(fā)展。miR-449a是miR-449家族的一員，在腫瘤生長、增殖以及分化中發(fā)揮著重要作用。相關研究指出，miR-449a可抑制腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，并通過多種途徑促進細胞凋亡和分化［17］。miR-449a在骨肉瘤中表達下調(diào)，并通過調(diào)控B細胞淋巴瘤/白血病-2（BCL2）促進細胞凋亡［18］。肝癌中miR-449a通過下調(diào)Calpain 6和POU2F1的表達促進細胞凋亡［19］。非 小 細 胞 肺 癌 中miR-449a通 過 靶 向HMGB1介導的NF-κB信號通路抑制腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲［20］。本研究中，不同濃度AIL處理HL-60細胞后，細胞中miR-449a mRNA表達顯著上調(diào)，說明AIL對HL-60細胞中miR-449a表達具有促進作用。進一步調(diào)控miR-449a表達發(fā)現(xiàn)，過表達miR-449a可抑制HL-60細胞增殖、遷移、侵襲并誘導細胞凋亡，而抑制miR-449a表達可減弱AIL抑制HL-60細胞增殖、遷移、侵襲及誘導細胞凋亡的作用，提示AIL可能是通過上調(diào)miR-449a表達發(fā)揮抑制HL-60細胞增殖、遷移、侵襲，誘導細胞凋亡的作用。與Zhang等［21］研究結(jié)果一致，AIL上調(diào)miR-449a抑制急性骨髓性白血病的生長、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號通路是細胞內(nèi)參與細胞增殖、凋亡、血管生成等過程的重要信號轉(zhuǎn)導通路。已有研究證實［22］，PI3K/AKT信號通路是miR-449a下游信號通路之一，miR-449a可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路在細胞生物學行為中發(fā)揮重要調(diào)控作用。同時，PI3K/AKT信號通路的激活與AML的發(fā)生具有密切相關性［23］。本研究檢測PI3K/AKT信號通路蛋白發(fā)現(xiàn)，AIL作用于HL-60細胞后PI3K/AKT信號通路中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低，表明AIL抑制HL-60細胞中PI3K/AKT信號通路活化，而抑制miR-449a表達逆轉(zhuǎn)AIL對HL-60細胞PI3K/AKT信號通路的抑制作用。這提示，AIL抑制HL-60細胞增殖、遷移、侵襲和誘導凋亡的作用可能與調(diào)控miR-449a表達、抑制PI3K/AKT信號通路活化有關。

綜上所述，本研究證實AIL通過上調(diào)HL-60細胞中miR-449a的表達發(fā)揮抑制細胞增殖、遷移、侵襲，誘導細胞凋亡的作用，其作用機制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號通路的活化有關。本研究為治療AML提供了可選藥物和潛在治療靶點。但本研究實驗內(nèi)容有限，AIL對AML的抗癌作用仍需在動物實驗中進一步驗證。