SARS-CoV-2中和性納米抗體的原核表達(dá)及中和活性檢測

王海寧，劉興健，高新桃，李軼女，沈興家，張志芳，易詠竹*

1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江212100；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點(diǎn)實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江212100；

3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

近年來新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在全球范圍的流行給世界人民的生命安全帶來了嚴(yán)重威脅，同時也嚴(yán)重阻礙世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展。嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2，SARS-CoV-2）是引起COVID-19的病原體，其刺突蛋白S蛋白（spike protein，S）的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（receptor binding domain，RBD）與宿主細(xì)胞膜上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合致使病毒侵入機(jī)體致?。?］。

中和性抗體作為制藥行業(yè)中規(guī)模最大、增長最快的領(lǐng)域，已成為COVID-19預(yù)防和治療的有效手段［2-5］，其中小分子抗體具有生產(chǎn)成本低、易于重組表達(dá)等優(yōu)勢［6-8］。作為小分子抗體的一員，納米抗體取自駱駝科動物體內(nèi)重鏈抗體的可變區(qū)部分（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），長度和寬度只有納米級別，是已知具有抗原結(jié)合能力的最小抗體，可以特異性結(jié)合新冠病毒S蛋白的受體結(jié)合域RBD，阻止其與細(xì)胞膜受體ACE2結(jié)合，進(jìn)而影響病毒進(jìn)入細(xì)胞。它與一般抗體相比除了具有分子量小、滲透性強(qiáng)、免疫原性弱、親和力高等優(yōu)勢，在一些條件下具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，較簡單的結(jié)構(gòu)也使其易于重組表達(dá)，因此在COVID-19的防治方面具有潛在的應(yīng)用前景［9-11］。

Huo等［12］將 純 化 后 的SARS-CoV-2 S蛋 白RBD片段注射到免疫羊駝體內(nèi)后獲得納米抗體文庫，通過噬菌體展示技術(shù)淘選出多個針對RBD蛋白的納米抗體，將親和力最強(qiáng)的納米抗體命名為H11。H11隨機(jī)突變后獲得H11-D4、H11-H4，實驗證明H11-D4和H11-H4均具有較強(qiáng)的病毒中和能力。本研究將H11-D4、H11-H4的基因序列按照大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化后進(jìn)行合成，克隆到pET28a載體上后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過簡易的純化和復(fù)性后對目的蛋白的中和活性做了初步檢測，以期為中和性納米抗體的大量原核表達(dá)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α、Rosetta（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET28a、人源胚胎腎細(xì)胞（HEK293T）、pcDNA3.1-ACE2-GFP質(zhì)粒、pcDNA3.1-S質(zhì)粒、pNL4-3.Luc.R-E質(zhì)粒均購自義翹神州生物技術(shù)有限公司；實驗所需基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司優(yōu)化合成。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4連接酶、螢火蟲熒光素酶檢測試劑盒、細(xì)胞裂解液均購自Promega公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；VigoFect高效真核轉(zhuǎn)染試劑購自蘇州拜吉氏生物科技有限公司；鼠源His-tag單克隆抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋有限公司。

Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀購自Thermo Fisher Scientific公司；4600 mini熒光及化學(xué)發(fā)光成像儀購自上海鷗翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H11-D4基因的獲取及合成 從數(shù)據(jù)庫中選取SARS-Cov-2中和性納米抗體H11-D4的氨基酸序列（PDB：6YZ5_F），去掉H11-D4后7個氨基酸，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性、GC含量等進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的核苷酸序列兩端加上限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ、EcoRⅠ，將終序列送至南京諾唯贊生物科技有限公司進(jìn)行合成，獲得pUC57-H11-D4質(zhì)粒。

1.2.2 重組表達(dá)載體pET28a-H11-D4的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ對pUC57-H11-D4質(zhì)粒以及pET28a載體進(jìn)行雙酶切，將目的片段H11-D4回收后用T4連接酶與pET28a載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans5α后涂布于具有卡納霉素的抗性平板，挑取單菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證和測序鑒定后獲得重組質(zhì)粒pET28a-H11-D4。

1.2.3 重組蛋白H11-D4的表達(dá)與純化 將重組大腸桿菌質(zhì)粒pET28a-H11-D4轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta（DE3）中，涂布固體培養(yǎng)基后挑取單菌落至2YT液體培養(yǎng)基，37℃，12 h后以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到200 mL的2YT培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8時加入IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。搖菌后收集菌體破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)情況。將包涵體沉淀用變性裂解液重懸，4℃攪拌過夜，12 000 r·min-1，4℃離心30 min，取上清。將His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)灌柱后加入上清液，最后用變性洗脫液洗脫，收集純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

1.2.4 質(zhì)譜分析與Western Blot鑒定 蛋白純化后通過SDS-PAGE電泳獲得單一條帶，切下條帶后送往中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所中心實驗室進(jìn)行液相二級質(zhì)譜分析。

對1.4中純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以稀釋3 000倍的鼠源His-tag為一抗，稀釋6 000倍的HPR標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，孵育結(jié)束后，添加顯色液用熒光化學(xué)發(fā)光儀成像。

1.2.5 重組蛋白H11-D4的復(fù)性與濃縮 將純化后的包涵體蛋白用變性洗脫液（不含咪唑）稀釋至150 μg·mL-1后裝入透析袋中。將透析袋用密封夾夾好后按6、4、2、1、0 mol·L-1梯度依次降低透析液中的尿素濃度，透析液中添加適量的氧化還原劑，4℃低速攪拌透析，4～6 h更換新鮮透析液一次，最后用過濾后的PBS（pH 7.4），4℃透析過夜，高速離心去除沉淀。在上清中加入1%Triton X-114，冰浴30 min后37°C孵育10 min，12 000 r·min-1離心15 min，小心吸取上層水相至新的EP管中，重復(fù)此步驟2～3次即可去除內(nèi)毒素。最后用超濾管（默克）進(jìn)行超濾濃縮（pH 7.4），稀釋至1 mg·mL-1，-80℃分裝保存。

1.2.6 SARS-CoV-2假病毒構(gòu)建及感染力測定將293T細(xì)胞以2×105·孔-1接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80%。轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基。按照Vigo-Fect說明書，將pNL4-3.Luc.R-E質(zhì)粒與pcDNA3.1-S質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染12 h后更換為含有10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基。48 h后收獲細(xì)胞上清，4℃，5 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液用0.45 μm濾膜過濾后分裝，避免反復(fù)凍融，-80℃保存待用。

將293T細(xì)胞以2×104·孔-1接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80 %。將pcDNA3.1-ACE2-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，3～6 h后更換含有10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，24 h后觀察熒光，將假病毒2倍稀釋10個梯度后加入96孔板中，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)12 h后，去除假病毒上清液，更換含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。48 h后檢測熒光素酶活性，確定假病毒感染力。

1.2.7 中和試驗 將293T細(xì)胞以2×104·孔-1接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80 %時將pcDNA3.1-ACE2-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，24 h后觀察熒光。分別將H11-D4和BSA從100 μg·mL-1進(jìn)行5倍梯度稀釋，共稀釋10個梯度，與等體積假病毒（RLU=40 000）混合，DMEM與假病毒混合作陽性對照、僅加DMEM孔作陰性對照，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)孔。37℃孵育1 h后加入細(xì)胞中，培養(yǎng)12 h更換含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，48 h后檢測螢火蟲熒光素酶表達(dá)量，計算納米抗體對假病毒進(jìn)入細(xì)胞的抑制率，并用GraphPad Prism計算其IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-H11-D4鑒定

利用BamHⅠ、EcoRⅠ對重組質(zhì)粒pET28a-H11-D4進(jìn)行雙酶切，鑒定結(jié)果顯示（圖1）分別在400、5 300 bp左右有明顯條帶，符合H11-D4片段和pET28a載體片段的理論長度387、5 369 bp，測序結(jié)果也表明序列正確，這說明H11-D4基因已經(jīng)成功克隆到pET28a載體上。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-H11-D4雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET28a-H11-D4 by double enzyme digestion

2.2 重組蛋白H11-D4的表達(dá)

誘導(dǎo)表達(dá)前，使用ExPASy軟件預(yù)測重組蛋白的分子量約為17.9 kD。通過篩選不同表達(dá)菌株、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑種類和濃度及誘導(dǎo)時間等條件，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Rosetta（DE3）37℃培養(yǎng)至OD值為0.6時，加入1.0 mmol·L-1IPTG繼續(xù)培養(yǎng)5 h后蛋白表達(dá)量最高，重組蛋白主要以包涵體沉淀形式表達(dá)，大小與預(yù)測值相符（圖2），且在上清中未見明顯條帶。

圖2 重組蛋白H11-D4的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein H11-D4

2.3 重組蛋白H11-D4的純化與復(fù)性

利用鎳柱親和層析純化得到目的蛋白，在不同濃度咪唑的洗脫液洗脫后發(fā)現(xiàn)洗脫液的最佳咪唑濃度為250 mmol·L-1。將純化后的目的蛋白與未純化表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE驗證，結(jié)果如圖3A所示：純化后目的蛋白條帶單一，純化效果良好。利用BCA法測定其濃度如圖3B所示，結(jié)果顯示每升菌液中純化后的目的蛋白產(chǎn)量達(dá)到25.16 mg·L-1。按照前述過程透析復(fù)性后，用Triton X-114去除內(nèi)毒素，濃縮、定量、分裝后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖3 H11-D4純化后的SDS-PAGE驗證與濃度測定Fig.3 SDS-PAGE analysis and concentration determination after H11-D4 purification

2.4 質(zhì)譜鑒定與Western Blot驗證

為了確定上述實驗獲得的重組蛋白為H11-D4，進(jìn)一步進(jìn)行了Western Blot驗證和質(zhì)譜分析。Western Blot驗證結(jié)果（圖4）顯示泳道2在預(yù)計的分子量附近可見特異性條帶，表明大腸桿菌中成功表達(dá)了H11-D4蛋白。質(zhì)譜結(jié)果顯示大腸桿菌表達(dá)的H11-D4蛋白分子量為17.9 kD與預(yù)測值一致，蛋白覆蓋率高達(dá)89.06%。

圖4 H11-D4 Western Blot驗證圖Fig.4 Western Blot analysis of H11-D4

2.5 SARS-CoV-2假病毒感染力測定

為了驗證假病毒能否感染表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞，首先將pcDNA3.1-ACE2-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，24 h后觀察熒光，如圖5所示，大部分細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，證明ACE2已經(jīng)在細(xì)胞中表達(dá)。用假病毒感染表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞后測得的感染力結(jié)果如圖6所示：假病毒具有感染293T細(xì)胞的能力，并且感染力與稀釋度顯著相關(guān)（P＜0.01，Pearson相關(guān)分析），同時隨著假病毒稀釋度增加，感染293T細(xì)胞的RLU值逐漸下降。

圖5 綠色熒光蛋白ACE2融合蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Expression of ACE2-GFP in 293T cells

圖6 假病毒感染力測定Fig.6 Determination of pseudovirus infectivity

2.6 中和試驗

本研究在SARS-CoV-2假病毒系統(tǒng)中插入了熒光素酶報告基因，該假病毒侵染了轉(zhuǎn)染ACE2的293T細(xì)胞后，細(xì)胞中假病毒表達(dá)的熒光素酶與熒光素反應(yīng)產(chǎn)生熒光。若納米抗體與假病毒S蛋白中的受體結(jié)合域RBD結(jié)合，就能競爭性的抑制RBD與ACE2結(jié)合，從而阻止假病毒進(jìn)入細(xì)胞，那么假病毒產(chǎn)生的細(xì)胞熒光值就會降低。根據(jù)檢測到的光量子數(shù)計算納米抗體H11-D4和BSA阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的抑制率，使用GraphPad Prism 8繪制納米抗體H11-D4對假病毒的中和活性曲線（圖7），結(jié)果表明H11-D4能有效抑制假病毒進(jìn)入細(xì)胞，且抑制率隨H11-D4濃度的增大而增大，而BSA陰性對照抑制率接近于零，無抑制假病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力。利用GraphPad Prism 8計算出H11-D4的半數(shù)抑制濃度IC50為171.1 nmol·L-1。

圖7 H11-D4對假病毒的中和活性曲線Fig.7 Neutralization activity curve of H11-D4 to pseudovirus

3 討論

傳統(tǒng)單克隆抗體普遍存在制備周期長、制備成本高等缺點(diǎn)，同時抗體相對較大還會導(dǎo)致組織滲透性較低，影響其治療效果［13］。中和性納米抗體大小只有傳統(tǒng)單克隆抗體的十分之一，在很多疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮了巨大作用［14-15］。此外，納米抗體體積小且具有良好穩(wěn)定性，可通過吸入給藥，比較適合呼吸道疾病的治療，在臨床上具有巨大的應(yīng)用潛力［16］。目前為止，納米抗體已經(jīng)可以在原核、酵母、昆蟲細(xì)胞、真菌、哺乳動物細(xì)胞甚至植物細(xì)胞中表達(dá)，而大腸桿菌作為原核生物的金標(biāo)準(zhǔn)，是實驗室環(huán)境下重組蛋白最重要的表達(dá)平臺之一，其結(jié)構(gòu)簡單且操作簡便，生產(chǎn)成本較為低廉，一般可以獲得每升數(shù)十mg的產(chǎn)量［17-20］。

本研究將SARS-CoV-2中和性納米抗體H11-D4基因序列根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，在大腸桿菌中進(jìn)行高效重組表達(dá)，37℃，OD600為0.6時添加1.0 mmol·L-1IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)5 h為最優(yōu)誘導(dǎo)條件。大腸桿菌表達(dá)載體攜帶的His標(biāo)簽方便了重組蛋白的鎳柱純化，純化后采用簡易的透析復(fù)性并在復(fù)性液中添加一定量氧化還原劑，可大大提高目的蛋白的復(fù)性率，這種方法在納米抗體H11-D4的純化復(fù)性上效果較為理想［21］。復(fù)性后用TritonX-114重復(fù)抽提能夠除去98%以上的細(xì)菌內(nèi)毒素，蛋白回收率高達(dá)85%以上［22］。納米抗體H11-D4的純化和復(fù)性結(jié)果表明用上述方法能達(dá)到相當(dāng)?shù)募兓Ч趽u瓶條件下，純化后的納米抗體H11-D4表達(dá)量高達(dá)25.16 mg·L-1，通過假病毒中和試驗可驗證其具有較好的中和活性，IC50為171.1 nmol·L-1。Huo等［12］為了獲得二聚體表達(dá)的納米抗體將H11-D4與人IgG1-Fc結(jié)構(gòu)域融合，用H11-D4-Fc納米抗體進(jìn)行中和試驗所得IC50為161 nmol·L-1，然而Fc段分子量較大，二聚體形式的表達(dá)在臨床應(yīng)用上有可能失去納米抗體分子量較小的優(yōu)點(diǎn)，而本研究所用目的蛋白為單體表達(dá)，其分子量不到18 kD，但中和活性與二聚體表達(dá)形式的相應(yīng)納米抗體中和活性基本相當(dāng)，足以說明本研究用較為簡單的方式表達(dá)、純化和復(fù)性了中和活性較高的新冠病毒中和抗體。綜合來講，本研究獲得了新冠病毒中和納米抗體H11-D4在大腸桿菌中的高效表達(dá)，建立了簡易的純化、復(fù)性過程，并通過中和試驗驗證了其中和活性，為納米抗體表達(dá)的深入研究、小分子藥物的生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)，在新冠病毒的預(yù)防和治療中具有一定的應(yīng)用前景。