TET酶的生物學(xué)功能及相關(guān)機制的研究進展

曾雨冰，何學(xué)佳，2，劉帆，3，裴培，王珊*

1.首都兒科研究所，兒童發(fā)育營養(yǎng)組學(xué)北京市重點實驗室，北京100020；

2.北京大學(xué)首都兒科研究所教學(xué)醫(yī)院，北京100020；

3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，首都兒科研究所，北京100020

DNA甲基化可以調(diào)控基因的表達及沉默，參與胚胎發(fā)育及多種疾病的發(fā)生發(fā)展，是表觀遺傳修飾相關(guān)研究中最為廣泛的一類。胞嘧啶（cytosine，C）以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）為供體，可在DNMT的催化下將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的C-5位上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）［1］，從而完成DNA的甲基化過程。但DNA甲基化狀態(tài)并非持續(xù)不變，5mC可通過氧化脫氨反應(yīng)，產(chǎn)生G/T錯配，被胸腺嘧啶DNA糖苷酶（thymine DNA glycosylase，TDG）選擇性識別，隨后通過堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER），恢復(fù)胞嘧啶形式，實現(xiàn)DNA去甲基化［2］。

DNA甲基化在胚胎發(fā)育過程中需要經(jīng)歷2次重編程。第一次發(fā)生在配子首次重編程后。受精后，DNA甲基化會被全部擦除，到植入前的囊胚期，胚胎的DNA甲基化水平降至最低水平，此后，又重新建立表觀遺傳標(biāo)記和印記；第二次發(fā)生在受精卵植入前期，父母來源的基因組均會經(jīng)歷相應(yīng)的重編程過程，清除原有的表觀遺傳學(xué)修飾，再重新發(fā)生新的甲基化，形成正常發(fā)育的全能型胚胎［3-5］。10-11易 位 蛋 白（ten-eleven-translocation protein，TET）酶家族在DNA去甲基化過程中起到了關(guān)鍵的調(diào)控功能，它普遍存在于多數(shù)動物及低等真核生物中，且在原生生物及真菌中也有發(fā)現(xiàn)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cell，mESCs）分化過程中，TET酶積極參與、介導(dǎo)DNA去甲基化過程，如TET1與轉(zhuǎn)錄抑制因子SIN3A結(jié)合，激活Lefty1，進而抑制Nodal信號通路［7］；TET3通過激活Sfrp4、抑制Wnt通路調(diào)節(jié)神經(jīng)外胚層和心臟中胚層分化傾向［8］。此外，TET酶介導(dǎo)的DNA去甲基化還參與多條代謝相關(guān)通路［9-12］，以及維持機體內(nèi)的動態(tài)平衡。

1 TET酶的分類與結(jié)構(gòu)

TET酶屬于2-氧戊二酸酯依賴性雙氧合酶（2-oxoglutarate-dependent dioxygenases，2-OGDDs）家族。2003年，Lorsbach等［13］首次在混合系白血?。╩ixed lineage leukemia，MLL）患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了TET1。目前TET酶家族共發(fā)現(xiàn)3個同源蛋白，分別命名為TET1、TET2、TET3。

人源TET酶是分子量在180～230 kD之間的大分子蛋白，此外還存在較短的TET酶變體［9，14］。TET家族成員均具有保守的C端結(jié)構(gòu)域，包含一個富半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（cysteine-rich domain，CD）和一個雙鏈β螺旋（double-stranded beta-helix，DSBH）結(jié)構(gòu)域。DSBH結(jié)構(gòu)域通過對Fe2+和α-酮戊二酸（alpha-ketoglutaric acid，α-KG）進行結(jié)合氧化5mC，CD穩(wěn)定DSBH與5mC之間的整個催化反應(yīng)結(jié)構(gòu)［15］。TET1和TET3的N端包含DNA結(jié)合的CXXC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可結(jié)合非甲基化的CpG二核苷酸；TET2由于染色體倒位缺乏CXXC結(jié)構(gòu)域，由鄰近基因IDAX編碼；由于不同的啟動子和/或可變剪接，從而產(chǎn)生了一些TET酶亞型，由于這些亞型缺乏與其相關(guān)的CXXC結(jié)構(gòu)域，因此 具 有 組 織/細(xì) 胞 類 型 特 異 性（圖1）［14，16］。2013年，徐彥輝等［15］解析了TET2-DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，為探究TET酶介導(dǎo)5mC氧化機制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 TET酶結(jié)構(gòu)示意圖[14]Fig.1 The structure of TET enzymes[14]

2 TET酶介導(dǎo)的DNA去甲基化機制

2009年，有研究發(fā)現(xiàn)，TET1可促使5mC氧化為5-羥 甲 基 胞 嘧 啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）［17］。DNA去甲基化分為DNA被動去甲基化及DNA主動去甲基化兩種模式。①DNA被動去甲基化：指DNA復(fù)制過程中，由于DNMT1受抑制無法完成子鏈的甲基化，DNA甲基化狀態(tài)無法維持，導(dǎo)致DNA甲基化被動稀釋（passive dilution）［18］。②DNA主動去甲基化：是由TET酶將DNA序列中的5mC多次氧化，依次轉(zhuǎn)變?yōu)?hmC、5-甲酰基胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine，5caC），最終5hmC被TDG選擇性識別，通過BER，逆轉(zhuǎn)為未修飾的胞嘧啶［19］。TDG-BER途徑可能導(dǎo)致DNA鏈斷裂，使基因組完整性受損，但在敲除TDG基因的小鼠受精卵中，其5mC去甲基化未受影響［20-21］。5hmC也可通過胞苷脫氨基酶（activation induced deaminase，AID）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基尿嘧啶，再依次經(jīng)過TDG識別切除和BER途徑完成去甲基化［19］。

3 TET酶的中間產(chǎn)物5hmC特點及分布情況

TET酶介導(dǎo)DNA主動去甲基化過程中，將5mC脫氫加氧，依次轉(zhuǎn)變成5hmC、5fC和5caC，5hmC的羥甲基和5fC的甲?；謩e通過與頭蛋白（noggin，NOG）的1-羧酸酯和胞嘧啶的N4環(huán)外氮形成氫鍵，因此，5hmC的羥基和5fC的羰基朝向相反的方向。生化分析表明，TET2的底物偏好是由TET2介導(dǎo)的氧化中氫提取效率不同引起的，5hmC和5fC在催化腔內(nèi)的約束構(gòu)象可能會阻礙它們選擇有利的取氫方向，降低催化效率。因此，TET酶在進化上被調(diào)節(jié)為對5hmC反應(yīng)較弱，并促進5hmC的生成，作為一個潛在的調(diào)節(jié)功能的穩(wěn)定標(biāo)記［22］。

5hmC的分布具有組織或細(xì)胞特異性。研究表明，5hmC在腦、肝、腎和結(jié)直腸組織中含量較高，在肺組織中含量相對較低，在心臟、乳房和胎盤中含量極低［23］，在神經(jīng)元細(xì)胞中濃度最高［24］。不同神經(jīng)元細(xì)胞類型中5hmC含量也存在差異，有研究證實，大腦中5hmC較5mC的總水平相對較高，其中額葉皮層組織中5hmC含量最為顯著［25］。當(dāng)組織或細(xì)胞處于疾病狀態(tài)時，如與正常結(jié)直腸組織相比，5hmC在結(jié)直腸腫瘤組織中含量顯著下降［23］；在肝細(xì)胞癌早期，5hmC含量已表現(xiàn)出明顯下降的趨勢［26］。

4 TET酶在疾病中的作用

TET酶參與調(diào)節(jié)DNA去甲基化過程，產(chǎn)生相應(yīng)的表觀遺傳效應(yīng)，可以促進或抑制機體發(fā)育及生物進程。TET基因過表達的情況下，5mC和5hmC的水平均可能由于底物耗竭而降低［27］。以下對TET酶在血液系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)、實體腫瘤等疾病中的作用進行分析。

4.1 TET酶異常在血液系統(tǒng)疾病中的作用

TET酶最早在血液系統(tǒng)疾病中被報道，研究表明，在MLL中存在TET1突變［28］。2009年，Tahiliani等［17］確定TET1為MLL基因的融合伙伴，并通過氧化5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?hmC，但其在白血病中的確切作用尚不清楚。2013年，有研究發(fā)現(xiàn)，TET1是MLL融合蛋白的直接靶點，MLL融合蛋白結(jié)合到TET1的啟動子區(qū)，并直接促進其在人和小鼠造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的表達，在MLL重排白血病中顯著上調(diào)，導(dǎo)致5hmC水平整體增加（圖2）［29］。

圖2 MLL重排白血病中MLL融合蛋白結(jié)合TET1的作用模式圖[29]Fig.2 Diagram of MLL fusion protein binding to TET1 on MLL-rearranged leukemia[29]

TET2在造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）及其祖細(xì)胞中高表達，隨著分化的進行TET2水平下降。TET2參與造血干細(xì)胞的自我更新、譜系的承諾和造血細(xì)胞向特定譜系的最終分化［30］。TET2能調(diào)節(jié)甲基化驅(qū)動的基因沉默，進而控制基因表達。TET2缺失可造成造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞突變，導(dǎo)致多種血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生［31-32］。有研究報道，在急性髓系白血?。╝cute myeloidleukemia，AML）中存在WT1、TET2、IDH1和IDH2的互斥性突變［33］。此外，與TET2表達正常的髓系惡性腫瘤相比，除Apc、Nf1、Flt3、Cbl、Notch1、Mll2基因發(fā)生突變外，TET2突變導(dǎo)致的髓系惡性腫瘤會產(chǎn)生更多的突變事件。研究表明，在TET2突變的情況下，Notch1基因上有4個雜合突變，通過單細(xì)胞靶向外顯子組測序發(fā)現(xiàn)，在Notch1上選定的13個位點中有7個明顯突變頻率更高［34］。另有研究報道，TET3維持5hmC表觀遺傳標(biāo)記、早期骨髓祖細(xì)胞程序、關(guān)鍵葡萄糖代謝和STAT5A信號通路基因的表達，TET3在AML中被發(fā)現(xiàn)過度表達，因此，TET3消耗會阻礙AML細(xì)胞中的己糖激酶（hexokinase，HK）活性表達和L-乳酸（L-lactate）產(chǎn)生［35］。

4.2 TET酶異常在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用

大量研究表明，5hmC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，其表達水平與動物年齡呈正相關(guān)［23，36］。TET酶通過調(diào)控神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因5hmC的水平，可以影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能［37-38］。

Rudenko等［39］研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠的TET1可使皮質(zhì)和海馬中調(diào)控神經(jīng)元活動的基因Arc、Npas4、c-Fos、Egr2等失調(diào)，引起突觸可塑性改變、記憶消退中特定的認(rèn)知損傷，導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)和記憶障礙；將TET1/2雙敲除后，會導(dǎo)致圍產(chǎn)期小鼠致死率上升，并伴有外腦畸形、腦出血、生長遲緩［40］；TET1/2/3三重敲除后，會導(dǎo)致小鼠神經(jīng)中胚層及外胚層分化失調(diào)［8］。此外，在人胚胎干細(xì)胞中進行TET1/2/3三重敲除后，可影響神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Pax6去甲基化［41］。

TET酶介導(dǎo)的DNA去甲基化與相對應(yīng)的DNA甲基化過程的動態(tài)調(diào)節(jié)對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育起到了重要作用。Pax3作為參與神經(jīng)管形成最重要的基因之一，其表達抑制可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)管畸形（neural tube defect，NTD）發(fā)生［42］；發(fā)育基因GLI2啟動子區(qū)DNA甲基化程度增高可增加NTD的發(fā)生風(fēng)險［43］。

TET酶損傷的相關(guān)疾病大多與神經(jīng)精神系統(tǒng)相關(guān)。前期研究通過對抑郁樣行為小鼠模型進行慢性社會失敗應(yīng)激處理，并檢測小鼠腦中伏隔核TET1表達量的改變，發(fā)現(xiàn)僅應(yīng)激敏感小鼠會出現(xiàn)TET1表達量的降低［44］；研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)性阿爾茲海默癥和額顳葉癡呆患者中存在TET2功能突變［45］。最近有研究發(fā)現(xiàn)，TET3突變是智力障礙和顱面異常遺傳綜合征的致病基礎(chǔ)［46］。

4.3 TET酶異常在實體腫瘤中的作用

DNA甲基化及去甲基化失衡會導(dǎo)致多種實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展。TET酶突變導(dǎo)致基因功能喪失和5hmC含量降低是腫瘤發(fā)生的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）家族中的IDH1和IDH2突變常發(fā)生在膠質(zhì)瘤（gliomas）和AML中，其突變可產(chǎn)生2-羥基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG），而2-HG占據(jù)了α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）的活性位點，導(dǎo)致α-KG的活性喪失，進而抑制α-KG的依賴性雙加氧酶，包括TET酶家族，導(dǎo)致全基因組組蛋白和DNA甲基化的改變［47］（圖3）。TET3表達異常會導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤5hmC水平整體降低，TET3 mRNA水平升高有助于產(chǎn)生更好的預(yù)后［48］。此外，在乳腺癌、黑色素瘤和胃癌等多種腫瘤中，均存在TET酶表達異常的現(xiàn)象［49］。

圖3 突變IDH1/2調(diào)控TET酶模式圖[47]Fig.3 Diagram of regulation of mutant IDH1/2 on TET[47]

在兒童腫瘤中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma）、肝母細(xì)胞瘤（hepatoblastoma，HB）等實體腫瘤同樣與TET酶關(guān)系緊密，引起DNA甲基化和DNA去甲基化失衡，均會促進此類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TET2與5hmC表達均下調(diào)，但在肝母細(xì)胞瘤中，TET和5hmC均升高，說明TET和5hmC在HB和成人腫瘤中的致瘤機制不同［50-51］。有學(xué)者推測，在胚胎發(fā)育過程中，TET酶高度表達并抑制分化，進一步推測HB的發(fā)生可能是由于分化早期肝臟分化受阻所致［52-53］。

近年來，借助于液體檢驗技術(shù)的快速發(fā)展，人們有能力在外周血檢測到不同組織的細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA），這對許多疾病的早期發(fā)現(xiàn)和及時干預(yù)起重要作用［54］。TET酶介導(dǎo)的DNA去甲基化中間產(chǎn)物5hmC，含量較高且具有較高的穩(wěn)定性［55］，可被考慮作為腫瘤診斷及預(yù)后評判的金標(biāo)準(zhǔn)之一［26，56］。雖然有研究表明，小鼠胚胎干細(xì)胞中TDG的缺失可導(dǎo)致5caC蓄積至易于檢測的水平［57］，但相較于5hmC的天然穩(wěn)定性，其存在明顯不足；并且結(jié)合上述關(guān)于TET在不同疾病中的變化，可以合理推測，5hmC檢測技術(shù)也可在腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。但目前通過cfDNA檢測5hmC來診斷疾病尚存在許多不足，其實用性證據(jù)也仍需進一步驗證［58-59］。

5 展望

本文綜述了DNA甲基化及去甲基化過程和TET酶在這一過程中發(fā)揮的調(diào)控功能，并歸納了目前TET在多種疾病中的調(diào)控作用，以及其在表觀遺傳學(xué)中的主要研究進展。雖然近年來，人們對DNA去甲基化的機制和功能進行了大量的研究，但仍有一些問題亟待解決：①盡管TET酶已被證實是通過調(diào)控DNA甲基化和去甲基化平衡參與調(diào)控生長發(fā)育和多種疾病，但在生長發(fā)育、疾病發(fā)展的不同階段是否起到相同作用及機制尚未闡明；②TET酶及DNA去甲基化過程的中間產(chǎn)物作為潛在的生物標(biāo)志物，靈敏度、特異性和實用性證據(jù)有待證實；③DNA甲基化及去甲基化過程具有非常復(fù)雜的機制，由許多不同的物質(zhì)與TET酶共同調(diào)節(jié)，但該調(diào)控機制及TET酶在其中發(fā)揮的作用尚未完全闡明。未來可通過相應(yīng)的研究闡明上述問題，進一步揭示DNA去甲基化過程，以及TET酶的相關(guān)作用機制，進而為疾病診療及降低出生缺陷發(fā)病率提供新思路。