代謝組學及其在環(huán)境毒理學中的應用

林嘉意，謝炬，朱越平，謝文玉

廣東石油化工學院，廣東省石油化工污染過程與控制重點實驗室，廣東高校石油化工污染控制重點實驗室，廣東茂名525000

代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后發(fā)展起來的一門學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。代謝組學旨在研究生物細胞內(nèi)相對分子質(zhì)量小于1 000的內(nèi)源性小分子，也用來描述整個組織中可觀察到的代謝物化學特征或指紋圖譜［1］。

由于有些藥物或者毒物的毒理學效應與生物體內(nèi)的基因表達或蛋白質(zhì)合成完全無關(guān)，所以代謝組學相較于基因組學和蛋白質(zhì)組學能夠更好地對某些藥物或毒物進行評估。同時，相較于基因組學和蛋白質(zhì)組學，代謝組學的實驗費用更低，分析速度也更快［2］。

1 代謝組學發(fā)展歷史

代謝組學的研究可以追溯到20世紀70年代的氣相色譜定量代謝譜分析，通常用于疾病診斷［3］。1999年 英 國 帝 國 理 工 大 學 的Jeremy K Nicholson［2］正式提出“metabonomics”這一概念，即代謝組學，并將其定義為“生命系統(tǒng)對病理生理刺激或基因修飾的動態(tài)多參數(shù)代謝反應的定量測量”。2000年德國馬普所的Oliver Fiehn［4］提出了新的代謝組學概念，并稱之為“metabolomics”，也可以稱作“代謝物組學”。他提出代謝物圖譜可以作為基因功能比較展示的新工具，并且認為代謝物圖譜是植物功能基因組學中一個有價值的輔助工具，值得在植物界內(nèi)外廣泛應用。1985年，Nicholson［5］首次將代謝組學應用到環(huán)境毒理學的研究中。他將不同劑量的HgCl2注入大鼠體內(nèi)，24 h內(nèi)收集大鼠尿液，利用核磁共振氫譜（1H-NMR）進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)汞會降低腎小管細胞對α-酮戊二酸和琥珀酸鹽的吸收。此后，代謝組學開始逐漸在環(huán)境毒理學評估研究中得到應用和發(fā)展。

2 代謝組學分析平臺

2.1 核磁共振

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）［6-7］是基于化學位移理論發(fā)展起來的當前研究代謝組學的主要技術(shù)。隨著科技的發(fā)展，科學家們對NMR技術(shù)進行不斷地改進。核磁共振氫譜（1HNMR）是一種關(guān)于分子中1H在核磁共振波譜法中的應用［8］。1H-NMR技術(shù)對含氫化合物均有響應，能檢測樣品中大多數(shù)的化合物并確定分子結(jié)構(gòu)，因此能夠滿足代謝組學中對盡可能多的化合物進行檢測的目標［6，8］。固態(tài)13C核磁共振技術(shù)（solid13C nuclear magnetic，13C-NMR）［9-10］以固體樣品為研究對象，是分析含碳或骨架是由碳原子組成的有機化合物結(jié)構(gòu)的有效方法，目前作為有效手段在土壤有機質(zhì)化學結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)化等研究領(lǐng)域中廣泛應用。PR-1H NMR［11］是一種將模式識別與核磁共振氫譜相結(jié)合的技術(shù)，該技術(shù)不僅可以快速便捷地研究組織提取物的代謝情況，也可以有效鑒別不同的藥材。

2.2 質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)

質(zhì)譜（mass spectrum，MS）［6］因其具有普適性、特異性和高靈敏度的優(yōu)點，在代謝組學研究領(lǐng)域得到了廣泛應用。將MS與其他技術(shù)聯(lián)用，應用范圍更廣，并且能夠獲得更多、更準確的特定信息，這是現(xiàn)代分析技術(shù)發(fā)展的趨勢，也將促進代謝組學的研究發(fā)展［12］。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）［6，12］在植物代謝組學研究中作為初級代謝分析的“黃金標準”，具有較高的分辨率和檢測靈敏度，并且能夠避免交叉感染，提高檢測速度，但它在分析揮發(fā)性低的代謝產(chǎn)物時需要對樣品做預處理，且不能分析體系中難揮發(fā)性代謝組分。與GC-MS相比，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatography mass spectrometry，LCMS）［13-14］具有較高的靈敏度，且無需繁雜的樣品預處理過程。但由于LC-MS通常采用反相填料和梯度洗脫程序，導致大量的親水性代謝產(chǎn)物不能保留或很難保留在反相色譜上［6］。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（ultra-high performance liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS）［15-16］大大提升了色譜率，不僅具有高效選擇性，還提高了靈敏度、分析速率和分辨率，能夠檢測到更多的代謝物。隨著設(shè)備的進一步改善，UPLC-MS在代謝組學研究中發(fā)揮著重要作用，并廣泛應用于藥物研究、毒物檢測、食品安全等各個領(lǐng)域。高分辨質(zhì)譜（high-resolution mass spectrometry，HRMS）可以對全掃描數(shù)據(jù)進行回溯性分析，它在高分辨率、準確質(zhì)量和高全掃描靈敏度等方面的優(yōu)勢，將會廣泛應用于環(huán)境毒理學、食品安全等領(lǐng)域的研究中［17-18］。傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，F(xiàn)T-ICR MS）［19-20］采用回旋共振的方式記錄所有離子信號，不僅能夠充分利用所有離子的信息，還能夠最大程度削弱由于離子分離不徹底帶來的相互干擾，因此具有卓越的分辨率、高的精確度和極快的分析速率。該技術(shù)可以獲得化合物的精確質(zhì)量數(shù)，為未知物鑒定提供強有力的工具，但FTICRMS的價格昂貴，運行成本也高。

代謝組學的分析技術(shù)發(fā)展至今多種多樣，本文對幾個常用分析技術(shù)的優(yōu)缺點以及取樣特點進行了比較，見表1和表2。

表1 代謝組學研究中NMR分析技術(shù)的比較Table 1 Comparison of NMR analysis techniques in metabolomics research

表2 代謝組學研究中MS分析技術(shù)的比較Table 2 Comparison of MS analysis techniques in metabolomics research

3 代謝組學在環(huán)境毒理學研究中的應用

3.1 重金屬

重金屬在自然界中分布廣泛，但由于人類過度開采等活動，導致人類生活環(huán)境出現(xiàn)大量重金屬。進入到環(huán)境中的重金屬不僅難以被降解，還會參與食物鏈循環(huán)并最終積累到生物體內(nèi)，造成人類及環(huán)境中其他生物體產(chǎn)生不同程度的毒性效應。在我國，污染環(huán)境的重金屬主要有汞（Hg）、砷（As）、鎘（Cd）等生物毒性突出的元素［27］。

Hg具有劇毒性，會對生物體健康產(chǎn)生巨大的危害。張瑞興等［28］發(fā)現(xiàn)低濃度汞離子（20 μmol·L-1）進入宮頸癌Hela細胞株內(nèi)會結(jié)合含巰基和酰胺基的酶，或者產(chǎn)生超氧陰離子，從而影響細胞的能量代謝及氨基酸代謝，同時細胞也會作出相應的應激反應以免受汞離子侵害。當Hg進入土壤環(huán)境中，也會對土壤環(huán)境及生物造成不利的影響。Tang等［29］將蚯蚓暴露于0.77±0.09 mg·kg-1汞污染的土壤中培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)低水平汞土壤會顯著降低蚯蚓的谷氨酰胺和2-己基-5-乙基-3-呋喃磺酸鹽含量，而甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、肌醇、t-甲基組氨酸和肌醇的含量顯著升高。土壤汞污染使蚯蚓的滲透調(diào)節(jié)、氨基酸和能量代謝發(fā)生顯著變化，可能導致其細胞正常代謝功能發(fā)生障礙而死亡，這一結(jié)果說明含低濃度汞的環(huán)境會對生物造成一定的影響。

Cd和As的毒性較大，進入生物體后也會產(chǎn)生危害。將紫貽貝成貝分別暴露在50 μg·L-1Cd、50 μg·L-1As（V）和海水環(huán)境中培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)50 μg·L-1Cd能夠使紫貽貝的甘氨酸、牛磺酸和龍蝦肌堿發(fā)生明顯變化，說明Cd的暴露干擾了紫貽貝的滲透壓調(diào)節(jié)過程；而丙二酸和磷酸膽堿的下降，以及糖原和葡萄糖的上升說明Cd暴露影響了紫貽貝的能量代謝過程。50 μg·L-1As（V）導致紫貽貝中龍蝦肌堿和?；撬岬葷B透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)明顯升高，但亞?；撬帷⑻K氨酸和甘氨酸等滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)物質(zhì)明顯下降，從而導致紫貽貝滲透壓調(diào)節(jié)紊亂。而丙二酸和琥珀酸含量的變化與Cd暴露相反，說明As（V）干擾了紫貽貝的能量代謝過程［30］。利用蛋白質(zhì)組學和代謝組學研究Cd和As（V）對海洋生物的毒理機制，發(fā)現(xiàn)高濃度Cd能夠使許氏平鲉幼魚（Sebastes schlegelii）引起強烈的免疫和氧化應激反應，而在應對低濃度As（V）脅迫時，能更全面地做出能量代謝調(diào)整。這兩種組學研究內(nèi)容互相驗證和補充能更好地解釋Cd和As（V）對許氏平鲉幼魚的毒理效應［31］。

3.2 有機污染物

有機污染物是指以碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸以及脂肪等形式存在的天然有機物質(zhì)及某些可生物降解的人工合成有機物質(zhì)為組成部分的污染物。近年來，越來越多的有機污染物被鑒定出來，主要包括二噁英類（dioxins）、多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）、多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyl，PCB）、持久性有機污染物（persistent organic pollutant，POPs）等。

多氯代二苯并-對-二噁英和多氯代二苯并呋喃統(tǒng)稱為二噁英類，共包含有210種化合物，其中2，3，7，8-四氯代二苯并-對-二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodiben20-P-dtoxin，TCDD）的 毒 性 最 強。TCDD不僅能夠干擾生物體內(nèi)分泌活性，還具有強致癌性和致畸性等［32］。張保琴等［33］使用四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法和HPLC-MS/MS發(fā) 現(xiàn)0.01 nmol·L-1TCDD會使 人體內(nèi)脯氨酸和谷氨酸含量明顯下降，且隨著TCDD濃度的增加，谷氨酸合成能力逐漸降低（劑量-效應關(guān)系）。此外，有研究表明，采用基于LC-MS的代謝組學研究PCBs（Aroclor 1254，10 mg·kg-1）、TCDD（10 μg·kg-1）以及聯(lián)合染毒（10 μg·kg-1TCDD和10 mg·kg-1Aroclor 1254）對大鼠代謝的影響，發(fā)現(xiàn)3種污染物均會干擾大鼠的脂代謝，并對免疫系統(tǒng)、肝臟以及神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生障礙，其中毒性大小為：聯(lián)合染毒＞TCDD＞PCBs［34］。

多氯聯(lián)苯因其具有獨特的物理和化學性質(zhì)，被廣泛的應用于生產(chǎn)中。但由于廢物排放以及消費過程中的滲漏，導致PCBs污染范圍不斷變大，進而影響生物體的健康［35］。劉耀軒等［36］將赤子愛勝蚓放在不同氯代多氯聯(lián)苯環(huán)境中，通過結(jié)合GC-MS、TEM、流式細胞和酶反應檢測等方法，發(fā)現(xiàn)隨著氯代數(shù)目的增加，糖代謝的促進作用減弱，蛋白代謝和脂代謝的影響增強。其中三氯聯(lián)苯PCB28的暴露使淀粉、蔗糖和三羧酸循環(huán)等代謝增強，四氯聯(lián)苯PCB52則主要影響蛋白代謝，五氯聯(lián)苯PCB101會抑制類固醇和脂肪酸合成。復合PCBs的代謝毒性最強，糖、蛋白和脂質(zhì)代謝都被顯著影響。這些結(jié)果說明不同濃度的PCBs以及不同氯代多氯聯(lián)苯都會對生物體產(chǎn)生一定影響，且隨著氯原子數(shù)目增多，其毒性也會增加，對生物體代謝的影響也愈加顯著。此外，Liao等［37］通過UPLC-MS/MS方法，發(fā)現(xiàn)PCB95及其代謝產(chǎn)物的毒性作用還可能擾亂雞胚肝細胞的免疫系統(tǒng)，導致能量代謝紊亂和肝功能障礙，其中PCBs的代謝產(chǎn)物羥基多氯聯(lián)苯（OH-PCBs）對雞胚干細胞的毒性大于PCBs。

持久性有機污染物是一類有機化合物，因其在環(huán)境中具有持久性而受到全球關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，暴露在POPs中會影響腸道微生物區(qū)系與宿主的相互作用，改變生物體的新陳代謝，使其活性降低。Li等［38］采用基于UPLC-MS的代謝組學方法，發(fā)現(xiàn)全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）改變了人體淋巴細胞中與免疫功能相關(guān)代謝物的含量，而代謝物的變化可以作為風險評估的生物標志物，用以確定環(huán)境污染物對淋巴細胞的毒性。Tian等［39］用UPLC-MS分析腸道微生物暴露在POPs后的脂質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)POPs的短期暴露會影響腸道微生物的總新陳代謝能力，導致微生物代謝活性顯著下降。此外，多種POPs的聯(lián)合對腸道微生物會產(chǎn)生更大的影響。

3.3 抗生素

目前抗生素可分為兩類，一類是抑菌抗生素，包括林可酰胺類、四環(huán)素類和氯霉素類等；另一類是殺菌抗生素，包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類等。在過去一段時間內(nèi)，抗生素因其具有良好的殺菌或抑菌作用被人們過度使用，但由于沒有注意到抗生素在人體和環(huán)境中具有富集性，導致細菌耐藥性呈迅速上升趨勢［40］。

抗生素雖然具有殺菌或抑菌作用，但對生物體也具有一定毒性。Zhang等［41］采用UPLC-MS/MS技術(shù)研究三氯卡班（triclocarban，TCC）在大鼠體內(nèi)的分布，利用HRMS的非靶向代謝組學監(jiān)測小鼠肝臟內(nèi)源性代謝的擾動和生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)當皮膚反復暴露在與化妝品中TCC濃度（0.5%和1.5%）相似的環(huán)境時，會對小鼠肝臟氧化受損，上游糖酵解和葉酸依賴的一碳代謝增加，且因耐藥性的增加，導致腸道微生物群的組成發(fā)生改變，對生物體產(chǎn)生危害。此外，Antunes等［42］通過使用基于傅里葉變換離子回旋共振直接進樣（DI-FTICR MS）的代謝組學方法，發(fā)現(xiàn)450 mg·L-1鏈霉素、50 mg·L-1萬古霉素（vancomycin）、750 mg·L-1甲硝唑（metronidazole）和250 mg·L-1四環(huán)素（tetracycline，TET）的聯(lián)合染毒不僅破壞小鼠腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，還會影響腸道內(nèi)糖、核苷酸和脂肪酸的代謝，以及膽汁酸、二十烷類化合物和類固醇激素合成等，表明多種抗生素聯(lián)用會擾亂生物體機體代謝及其代謝產(chǎn)物的合成。

不同種類的抗生素對生物體產(chǎn)生的影響也不同，例如倪江等［43］用基于1H-NMR代謝組學方法，發(fā)現(xiàn)4 mg·kg-1鹽酸林可霉素會減少肉雞腸道中三甲胺、乳酸鹽、延胡索酸鹽和鹽酸鹽等代謝產(chǎn)物含量，對腸道菌群的代謝和合成產(chǎn)生了顯著的影響，而20 mg·kg-1硫酸粘桿菌素減少了乳酸鹽含量，增加了煙鹽酸含量，對其影響較小。

不同抗生素劑量也對生物體的代謝具有顯著差異。采用UPLC-Q-TOF/MS方法研究4-差向土霉素（4-epioxytetracycline，4-EOTC）對大鼠尿液和血液的代謝組學，發(fā)現(xiàn)4-EOTC通過減少大鼠體內(nèi)的氨基乙酸、5-L-谷氨基甘氨酸、精氨酰-絲氨酸和脫氧輔蛋白含量，引起大鼠機體糖代謝和氨基酸代謝的紊亂；并且中、高劑量4-EOTC還會導致大鼠血液中溶血卵磷脂顯著增加，從而影響大鼠體內(nèi)的脂肪酸代謝。這些結(jié)果表明隨著4-EOTC劑量的增加，對大鼠血液及尿液代謝組變化的影響也越來越大［44］。尹金寶等［45］運用基于1H-NMR的代謝組學技術(shù)研究酸四環(huán)素對小鼠血清和尿液代謝物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)隨著TET劑量的增加，小鼠肝臟切片細胞脂滴數(shù)量逐漸增加，造成小鼠肝臟細胞病變愈加嚴重，并且存在劑量效應。此外，還發(fā)現(xiàn)中高濃度的TET（10 g·L-1）對小鼠代謝產(chǎn)生的影響在短時間內(nèi)難以消除，具有持久性，這表明抗生素在生物體內(nèi)富集成中高濃度可能會對機體產(chǎn)生不可逆或持久性的影響。

4 展望

代謝組學是系統(tǒng)生物學中發(fā)展較晚但處于核心地位的一種組學。高通量、高分辨率的分析技術(shù)與完整的生物信息學相結(jié)合，使代謝組學在疾病診斷、新藥研發(fā)、藥物毒性評價、環(huán)境毒理學等方面的研究中快速發(fā)展。隨著科技的不斷進步，代謝組學從NMR和MS技術(shù)的單獨使用到目前LC-MS、GC-MS、UPLC-MS、FTICR-MS等多技術(shù)的聯(lián)用，其在檢測評估的靈敏度、分辨率、分析速度、選擇性得以不斷提升。代謝組學作為環(huán)境毒理學研究中重要的檢測分析手段，不僅能發(fā)現(xiàn)環(huán)境中污染物暴露的相應靶器官和生物標志物，還能高效地解釋其毒理作用及機制。

將代謝組學與基因組學、蛋白組學、轉(zhuǎn)錄組學聯(lián)用不僅更加有利于科學家們探索環(huán)境污染物對機體的毒理作用及其發(fā)生機制，還可以為環(huán)境污染的監(jiān)測、健康損害及其綜合治理提供理論依據(jù)和新思路［12］。基于轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學聯(lián)用發(fā)現(xiàn)環(huán)烷的脂溶性成分（lipophilic components，LPC）調(diào)節(jié)了擬南芥的特定代謝途徑，從而增強其對冰凍脅迫的耐受性［46］。采用轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學研究麻蠅耐冷性的分子機制，發(fā)現(xiàn)快速硬化（rapid cold-hardening，RCH）對麻蠅的耐寒性有顯著影響，但對其轉(zhuǎn)錄組的影響不大［47］。組學的聯(lián)用將會成為探究污染物毒理學效應的有力工具，從而促進環(huán)境毒理學的發(fā)展。

目前關(guān)于某些污染物對生物體的毒性及其作用機理的研究較少，并且在代謝組學研究中選擇和/或識別生物標記物后，很少發(fā)表有關(guān)回歸模型預測方面的研究論文［37，41］。大部分研究環(huán)境毒理學實驗所用的重金屬、有機污染物或抗生素的暴露方式是單一的化合物暴露，而污染地區(qū)的實際情況往往較為復雜，應進一步考慮模擬污染地區(qū)的實際情況再開展復合暴露研究，這將成為研究者們長期探索研究的重任［30，48］。隨著代謝組學技術(shù)的發(fā)展及其在環(huán)境毒理學中應用的不斷成熟，它必將幫助人們更好地了解環(huán)境污染物對生態(tài)環(huán)境及生物體各種機制的影響。