油菜雙單倍體誘導(dǎo)育種技術(shù)研究進(jìn)展

楊美翠，趙詩(shī)慧，高源，石浩然，李云，龔萬(wàn)灼，楊進(jìn)，王繼勝，鄒瓊，陶蘭蓉，康澤明，唐蓉，郭世星，付紹紅*

1.成都市農(nóng)林科學(xué)院，成都611130；

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都611130；

3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，成都611130

油菜是世界上主要的油料作物之一，也是我國(guó)第一大油料作物。油菜不僅提供人們生活所需的食用油還提供優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物飼料蛋白。全球油菜種植主要分布在加拿大、中國(guó)、歐洲、澳大利亞、印度等區(qū)域。2021年我國(guó)油菜種植面積和總產(chǎn)量位居全球第二，占全球油菜種植面積和總產(chǎn)量的20%左右，僅次于加拿大。但由于國(guó)內(nèi)強(qiáng)勁的消費(fèi)需求，以及國(guó)內(nèi)油菜籽價(jià)格明顯高于進(jìn)口，導(dǎo)致我國(guó)油菜籽的進(jìn)口量位居高位，成為油菜籽的主要進(jìn)口國(guó)［1］。我國(guó)油菜種植面積增加和單產(chǎn)提高是滿足消費(fèi)需求的兩個(gè)重要途徑。我國(guó)油菜單產(chǎn)提高得益于油菜雜種優(yōu)勢(shì)的利用和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)雜交種的推廣應(yīng)用，從2010年的1 775.1 kg·hm-2提高到2021年的2 104.5 kg·hm-2，年均增長(zhǎng)1.5%，單產(chǎn)已高于2 038.5 kg·hm-2的世界平均水平［2］，但遠(yuǎn)低于歐洲油菜平均單產(chǎn)水平。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)油菜種植品種中雜交種已占到年種植面積的90%以上。因此，持續(xù)加強(qiáng)油菜資源創(chuàng)新、優(yōu)勢(shì)基因聚合和雜種優(yōu)勢(shì)利用對(duì)推動(dòng)我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的作用。

油菜雙單倍體誘導(dǎo)技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種快速選育油菜新品種的技術(shù)方法，此技術(shù)中雙單倍體誘導(dǎo)系比單倍體誘導(dǎo)系顯示出更大的優(yōu)勢(shì)。最早規(guī)?；瘧?yīng)用的誘導(dǎo)系是玉米單倍體誘導(dǎo)系，利用有性雜交獲得單倍體后代，然后人工染色體加倍獲得純系，等位基因純合的純系組配雜交種。通過(guò)雙單倍體誘導(dǎo)技術(shù)選育的新品種更具有雜種優(yōu)勢(shì)，且雜交種純度、一致性均能得到保證。油菜雙單倍體誘導(dǎo)系作為父本給油菜及十字花科作物母本授粉，能直接獲得母本雙單倍體后代，省去了染色體人工加倍的環(huán)節(jié)，加速了育種進(jìn)程。在甘藍(lán)型油菜中利用此特性可快速選育雜種優(yōu)勢(shì)利用的三系親本，改良品種［3-4］。同時(shí)，利用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)種間及遠(yuǎn)緣雜交后代，不僅解決了種間及遠(yuǎn)緣雜交后代結(jié)實(shí)率低的問(wèn)題，而且保留了種間及遠(yuǎn)緣雜交后代豐富的遺傳變異，在很大程度上促進(jìn)了種質(zhì)資源的創(chuàng)新［5］。因誘導(dǎo)系作為父本誘導(dǎo)時(shí)，父本染色體消失，母本染色體加倍而形成雙單倍體。利用此特性，油菜雙單倍體誘導(dǎo)系被用來(lái)介導(dǎo)基因編輯，獲得了不含轉(zhuǎn)基因元件的突變雙單倍體植株，且克服了基因編輯對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化的依賴性［6］。此方法的應(yīng)用能夠擴(kuò)大基因編輯的應(yīng)用范圍，提高基因編輯的效率。

綜上，油菜雙單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在雜種優(yōu)勢(shì)利用、資源創(chuàng)新和強(qiáng)優(yōu)勢(shì)基因聚合的品種改良上都顯示出較大應(yīng)用價(jià)值。因此，本文對(duì)油菜雙單倍體誘導(dǎo)系育種技術(shù)從發(fā)現(xiàn)到應(yīng)用的相關(guān)研究進(jìn)行闡述，以期為以后油菜雙單倍體誘導(dǎo)系育種技術(shù)的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的發(fā)現(xiàn)

在諸多作物選育和純系獲得的方法中，選育效率和限制因素各不相同，各有優(yōu)缺點(diǎn)。研究者們一直致力于尋找一種效率高、操作簡(jiǎn)便、限制因素少的方法，以快速提高油菜的選育效率。Fu等［7］首次在油菜中報(bào)道了兩個(gè)人工合成的異源八倍體甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，AAAACCCC，2n=8x=76）Y3380、Y3560，當(dāng)其作為父本授粉于四倍體甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，AACC，2n=4x=38）時(shí)，可直接誘導(dǎo)后代產(chǎn)生表型特征和遺傳特征與母本一致的植株，其雙單倍體誘導(dǎo)率為30%～90%。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)該八倍體油菜不僅能誘導(dǎo)四倍體甘藍(lán)型油菜［8］、四倍體芥菜型油菜（Brassica juncea，AABB，2n=4x=36）［9］，還能誘導(dǎo)二倍體白菜型油菜（Brassica rapa，AA，2n=2x=20）［10］。因此，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟院士將其命名為“油菜雙單倍體誘導(dǎo)系”。相比單倍體誘導(dǎo)系，該誘導(dǎo)系能直接一步誘導(dǎo)母體獲得雙單倍體，省去了誘導(dǎo)后代染色體加倍的環(huán)節(jié)，在一定程度上節(jié)約了時(shí)間和人力成本，提高了育種效率，具有較大的應(yīng)用潛力。

油菜雙單倍體誘導(dǎo)系［7］是經(jīng)過(guò)種間雜交和染色體加倍人工合成的異源八倍體。通過(guò)甘藍(lán)型油菜F009（母本）與白菜型油菜YH（雅安黃，父本）種間雜交，雜交F1利用染色體加倍處理獲得穩(wěn)定遺傳的早代穩(wěn)定系P3-2（F3）［11］。以P3-2為母本與雜交F1（1325×香港菜心）雜交獲得聚合雜交種F1，以P3-2為母本與雜交F1（4247×1356）獲得聚合雜交F1，用秋水仙素加倍處理獲得八倍體Y3380和Y3560。利用這兩個(gè)八倍體給質(zhì)不育、核不育、F1雜交材料以及常規(guī)穩(wěn)定材料授粉，發(fā)現(xiàn)后代材料均出現(xiàn)不同程度的穩(wěn)定株系。通過(guò)田間表型、流式細(xì)胞術(shù)、SNP芯片技術(shù)手段證實(shí)，這些雜交或測(cè)交后代的表型、倍性、基因型均與母本一致，經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證該現(xiàn)象能穩(wěn)定獲得。利用7個(gè)不育系驗(yàn)證該雙單倍體的誘導(dǎo)效率在30%～90%，存在一定母體基因型互作效應(yīng)，且在誘導(dǎo)后代中發(fā)現(xiàn)了1%左右的單倍體［7，12］。

2 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的表型、遺傳特性及誘導(dǎo)機(jī)制

油菜雙單倍體誘導(dǎo)系是世界上首次報(bào)道的人工合成八倍體油菜，同四倍體甘藍(lán)型油菜比較，屬于多倍體，其表型特征具有特異性。八倍體油菜因染色體經(jīng)過(guò)了人工加倍，其倍性高，且屬同源染色體加倍，遺傳容易出現(xiàn)倍性分離或染色體遺傳不穩(wěn)定。但經(jīng)過(guò)十余年的自交和人工選育仍然能獲得八倍體，其遺傳穩(wěn)定性和表型特征對(duì)多倍體的進(jìn)化研究具有一定價(jià)值。

2.1 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的遺傳學(xué)特性

油菜雙單倍體誘導(dǎo)系從來(lái)源上是異源八倍體，從加倍過(guò)程來(lái)看是同源個(gè)體的加倍，通過(guò)體細(xì)胞熒光原位雜交觀察其染色體組成得以證明。通過(guò)有絲分裂、減數(shù)分裂觀察誘導(dǎo)系及其自交后代的染色體數(shù)目和染色體行為，并檢測(cè)了誘導(dǎo)系花粉的發(fā)育情況，證明其存在一系列異常行為。此外，分析誘導(dǎo)系Y3380和Y3560及其親本P3-2的甲基化模式，證明了其八倍體的遺傳事實(shí)和不同于正常四倍體的表型和遺傳特性。以上結(jié)果及遺傳學(xué)表現(xiàn)詳見(jiàn)表1。

表1 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的遺傳學(xué)特性Table 1 Genetic characteristics of double haploid induction lines in rapeseed

研究觀察到誘導(dǎo)系的減數(shù)分裂行為異常，此異常行為是造成自交后代染色體數(shù)減少以及混倍體產(chǎn)生的重要原因。在自交后代中出現(xiàn)了1%～3%的混倍體異?，F(xiàn)象，在混倍體植株中發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目有差異的不同細(xì)胞，且這些細(xì)胞的染色體數(shù)目不存在整倍關(guān)系。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)混倍體的有絲分裂和減數(shù)分裂都表現(xiàn)出了一定的染色體異常行為，而這些異常行為造成了非整倍體花粉的產(chǎn)生［13-14］，這可能是誘導(dǎo)系花粉具有誘導(dǎo)能力的關(guān)鍵。

2.2 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的表型特征

八倍體的雙單倍體誘導(dǎo)系和四倍體甘藍(lán)型油菜在外觀上大致相同，但在具體表觀上存在一定的差異［13］。八倍體油菜相比四倍體油菜，生育期延長(zhǎng)，植株矮壯，葉片大、厚且卷曲，主序短，一次分枝數(shù)少，角果粒數(shù)少，角果短，且單株角果數(shù)只是四倍體的三分之一；花器官較大，花粉粒更大、更多；部分花粉萌發(fā)孔不對(duì)稱地分布在花粉壁上，超過(guò)98%的花粉粒因?yàn)榛ǚ郾谕蛔兌鴮?dǎo)致花粉萌發(fā)孔從3個(gè)增加到4個(gè)，少數(shù)花粉粒甚至有5個(gè)及以上的花粉萌發(fā)孔，且花粉粒的體外萌發(fā)和花粉管的伸長(zhǎng)較四倍體更快，這可能與萌發(fā)孔的數(shù)量更多有關(guān)。同時(shí)，八倍體油菜花粉活性能到達(dá)90%以上，種子發(fā)芽率高達(dá)93%?？傮w而言，八倍體油菜能正常生長(zhǎng)和發(fā)育，這可能是八倍體植株能得以正常繁殖的關(guān)鍵。

2.3 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的胞質(zhì)效應(yīng)

油菜雙單倍體誘導(dǎo)系作為父本對(duì)不同母本存在誘導(dǎo)效率差異，誘導(dǎo)過(guò)程與母本的基因型、胞質(zhì)類型存在互作效應(yīng)［16-17］。當(dāng)母本細(xì)胞質(zhì)基因一致，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)效果受到核基因的影響。當(dāng)母本核基因相同時(shí)，誘導(dǎo)差異主要受到細(xì)胞質(zhì)基因影響。通過(guò)誘導(dǎo)系對(duì)相同核基因的波里馬細(xì)胞質(zhì)不育系0933A（pol胞質(zhì)）、蘿卜胞質(zhì)不育系蘿0933A（Ogura胞質(zhì)）以及保持系0933B（Nap胞質(zhì)）進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)0933B（Nap胞質(zhì)）作為母本的誘導(dǎo)效果最好，蘿0933A（Ogura胞質(zhì)）作為母本的誘導(dǎo)效果最差。誘導(dǎo)后代SNP純度檢測(cè)結(jié)果顯示，波里馬胞質(zhì)0933A（pol胞質(zhì)）作為母本時(shí)誘導(dǎo)后代的SNP位點(diǎn)純合率最高，都高于母本且沒(méi)有父本基因的滲入。而蘿卜胞質(zhì)0933A（Ogura胞質(zhì)）的誘導(dǎo)后代SNP位點(diǎn)純合率均低于母本，但存在部分父本基因的滲入現(xiàn)象?？捎|(zhì)0933B（Nap胞質(zhì)）誘導(dǎo)后代SNP位點(diǎn)純合率基本不變，與母本相近。由此可知，誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)效率與母本胞質(zhì)類型存在明顯的胞質(zhì)效應(yīng)互作關(guān)系，波里馬胞質(zhì)誘導(dǎo)的效果比蘿卜胞質(zhì)更穩(wěn)定；誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的胞質(zhì)效應(yīng)為利用誘導(dǎo)系同步選育不育系和保持系奠定了基礎(chǔ)。

2.4 油菜雙單倍體的誘導(dǎo)機(jī)制

對(duì)油菜雙單倍體誘導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行研究，向誘導(dǎo)系中轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因（epsps-cp4），并在受精及胚胎發(fā)育過(guò)程中跟蹤該基因，通過(guò)誘導(dǎo)后代的多態(tài)性分子標(biāo)記、熒光原位雜交、SNP分析等大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，授粉早期胚胎中95%左右的胚胎能檢測(cè)到標(biāo)記基因，隨著胚胎的發(fā)育，標(biāo)記基因會(huì)不斷地丟失，同時(shí)伴隨胚胎的大量死亡，最后形成的種子中不含有標(biāo)記基因，且對(duì)應(yīng)的父本染色體也發(fā)生了專一性的丟失。因此，可以推斷授粉過(guò)程中誘導(dǎo)系花粉的精細(xì)胞進(jìn)入母本胚囊，與卵細(xì)胞融合受精后形成合子，在合子有絲分裂過(guò)程中，父本染色體發(fā)生專一性丟失，丟失過(guò)程中可能通過(guò)同源交換或轉(zhuǎn)座子跳躍存在部分父本基因滲入到母本基因組的現(xiàn)象，之后合子單倍體基因組發(fā)生早期加倍現(xiàn)象，加倍后的合子繼續(xù)發(fā)育成完整胚胎，最終形成雙單倍體后代［14，18］。但父本的染色體有可能丟失不完全，發(fā)生父本染色體滲入現(xiàn)象；或者父本染色體丟失未完成就發(fā)生加倍，容易形成部分染色體片段雜交的情況。Zhao等［19］在玉米誘導(dǎo)系誘導(dǎo)獲得單倍體的研究中，發(fā)現(xiàn)授粉誘導(dǎo)一周的單倍體胚內(nèi)大多數(shù)父本染色體消失；同時(shí)，在一個(gè)單倍體里發(fā)現(xiàn)有44 bp父本染色體片段的插入。Li等［20］在玉米誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的后代中，發(fā)現(xiàn)滲入的DNA來(lái)自誘導(dǎo)系，染色體消除可能是玉米單倍體誘導(dǎo)的原因。

在油菜雙單倍體誘導(dǎo)系機(jī)理的進(jìn)一步研究中，發(fā)現(xiàn)非整倍體影響誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)能力。混倍體雙單倍體誘導(dǎo)系相比八倍體誘導(dǎo)系，降低了F1代的父本滲入率和雜交位點(diǎn)率，使后代不易滲入父本基因。這可能是由于混倍體油菜在減數(shù)分裂四分體時(shí)期易形成核外染色體，增加了非整倍體配子產(chǎn)生概率，而非整倍體配子不穩(wěn)定，在后期雌雄配子融合過(guò)程中，更加容易發(fā)生染色體的丟失，從而導(dǎo)致F1代父本滲入率降低［14］。由此可知，非整倍體配子能夠提高誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)能力，且花粉產(chǎn)生非整倍體配子可能是油菜具有誘導(dǎo)能力的重要原因。同樣地，在玉米單倍體誘導(dǎo)機(jī)制研究中也有相似的推斷。Li等［21］研究玉米單倍體發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)系花粉三核階段具有高頻率的非整倍體，認(rèn)為單倍體誘導(dǎo)可能和花粉的非整倍體有關(guān)聯(lián)。在玉米和油菜中都發(fā)現(xiàn)非整倍體的雄配子對(duì)誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，那么八倍體油菜產(chǎn)生誘導(dǎo)現(xiàn)象是由于父本的倍性造成的非整倍體配子，還是由功能基因控制的？通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Y3380、Y3560的誘導(dǎo)能力來(lái)自它們共同的親本P3-2（早代穩(wěn)定系）［8，11］，該親本具有7.8%的誘導(dǎo)能力，而染色體加倍提升了誘導(dǎo)效果，其他與P3-2無(wú)親緣關(guān)系的六倍體或八倍體幾乎無(wú)誘導(dǎo)能力，或有誘導(dǎo)能力但自身不能自交繁殖，存在明顯的結(jié)實(shí)障礙［14］，說(shuō)明油菜雙單倍體高誘導(dǎo)能力可能是基因遺傳和染色體加倍的共同作用結(jié)果。

3 油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用中獲得純系的途徑

優(yōu)質(zhì)、多抗、優(yōu)勢(shì)基因聚合的親本選育和等位基因的純合，是培育強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種的前提，也是油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的關(guān)鍵。油菜雜交育種獲取純系的方法一般包括常規(guī)選育、小孢子離體培養(yǎng)和種間遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)單倍體等。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系在獲得油菜純系上顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)，對(duì)促進(jìn)油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用具有巨大的推動(dòng)作用。

3.1 常規(guī)選育

傳統(tǒng)的純系選育是連續(xù)世代的近交，主要有系譜法和單粒傳法。系譜法從雜種第一次分離世代開(kāi)始選株，然后分別種成株行，形成系統(tǒng)，以后各世代均在所選優(yōu)良系統(tǒng)中選擇優(yōu)良單株，直到選出性狀優(yōu)良一致的系統(tǒng)。在選擇的過(guò)程，選中的單株及系統(tǒng)都予以編號(hào)，這有利于考察株系的歷史和親緣關(guān)系。但系譜法每一代都需要進(jìn)行選擇，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，工作繁瑣，至少五代以上等位基因才能達(dá)到純合狀態(tài)。

相比系譜法，單粒傳法是一種簡(jiǎn)單且有效的近交繁殖選育方式，經(jīng)過(guò)系譜法改良而來(lái)［22］，其每個(gè)世代的每個(gè)單株只選擇一粒種子繁殖下一代。作為一種快速世代改良方法，單粒傳法避免了自交世代的選擇，一般在第六代之后出現(xiàn)最有利于選擇的一代，才開(kāi)始選擇［23］，這使得選育工作簡(jiǎn)單又省時(shí)省力。由于前期沒(méi)有選擇，得到群體的每個(gè)單株可追溯到每一個(gè)株系的原始單株。但是這樣的選擇易受到限制，容易漏選優(yōu)異變異，且到了后期，工作量巨大。

這樣的連續(xù)世代近交能增大基因重組的頻率，增加選到最佳重組組合的機(jī)會(huì)。但如果目的基因存在連鎖，在連續(xù)世代的選擇過(guò)程中，可能會(huì)丟失有利基因。此外，這樣的近交系選育耗時(shí)耗力，選育年限長(zhǎng)、效率低、盲目性大。

3.2 油菜小孢子離體培養(yǎng)

目前，作物雜交親本等位基因的快速純合常用體外單倍體培養(yǎng)技術(shù)。體外單倍體培養(yǎng)技術(shù)主要包括花藥培養(yǎng)和小孢子離體培養(yǎng)。1964年，Guha和Maheshwar［24］利用花粉培養(yǎng)首次得到單倍體毛曼陀羅（Datura innoxiaMiller）植株。1982年Lichter［25］首次報(bào)道用甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）離體小孢子獲得單倍體。通過(guò)花粉小孢子離體培養(yǎng)獲得的單倍體，經(jīng)過(guò)人工加倍就能獲得雙單倍體（DH系/純系）。相比小孢子離體培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)產(chǎn)胚率低，易受花藥壁等體細(xì)胞組織影響。Siebel和Pauls［26］在甘藍(lán)型油菜中進(jìn)行了花粉培養(yǎng)和小孢子離體培養(yǎng)的比較，發(fā)現(xiàn)小孢子離體培養(yǎng)的產(chǎn)胚率是花粉培養(yǎng)的2～10倍，小孢子離體培養(yǎng)的效率更高。小孢子離體培養(yǎng)是應(yīng)用最普遍的體外單倍體獲取途徑，在小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）、煙草（Nicotiana tabacum）和油菜等作物上得到了廣泛應(yīng)用。

相比傳統(tǒng)的選育需要6～8年才能獲得純系，小孢子離體培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體經(jīng)過(guò)秋水仙素處理，即可獲得純系，在很大程度上節(jié)省了時(shí)間，加速了育種進(jìn)程。但同時(shí)，小孢子離體培養(yǎng)也受到了一些限制［27-28］，如供體植株的生長(zhǎng)條件、供體植株基因型、小孢子的發(fā)育階段、培養(yǎng)基的組成成分、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境和預(yù)處理等因素均會(huì)影響胚狀體發(fā)育和單倍體的產(chǎn)生。同時(shí)，秋水仙素具有毒性，在操作上也受到一定的限制。這些因素致使小孢子培養(yǎng)的誘導(dǎo)率、染色體加倍效率低。此外，小孢子培養(yǎng)會(huì)受到環(huán)境和基因型的限制，應(yīng)用普及受限。

3.3 油菜種間遠(yuǎn)緣雜交

在植物中可以通過(guò)種間雜交，獲得母體單倍體，該方法在小麥和大麥中發(fā)現(xiàn)并得到了較好的應(yīng)用。Symko［29］用球莖大麥（Hordeum bulbosum）作為父本給大麥?zhǔn)诜?，獲得了大麥單倍體。Gupta和Fedak利用芒穎大麥草（Hordeum jubatum）和小黑麥（Triticosecale wittmack）雜交，得到大麥草單倍體［30］。Bains等［31］將小麥和玉米雜交，通過(guò)胚挽救法得到了小麥單倍體。在油菜中母體單倍體的產(chǎn)生也早有發(fā)現(xiàn)和研究，在1928年Noguchi［32］和Mohammad等［33］在油菜等蕓薹屬（Brassica）植物中觀察到孤雌生殖現(xiàn)象。Olsson等［34］和Ramanujam等［35］在甘藍(lán)型和白菜型油菜田中找到了孤雌生殖來(lái)源的天然單倍體。Stringnm等［36］研究了油菜單倍體自然發(fā)生的頻率，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜的孤雌生殖發(fā)生頻率為0～0.364%。四川大學(xué)羅鵬教授用遠(yuǎn)緣花粉授粉，特別是同屬異種花粉授粉的方式，誘發(fā)孤雌生殖單倍體，誘發(fā)頻率較高。該團(tuán)隊(duì)選用白菜型鄱陽(yáng)油菜花粉給甘藍(lán)型勝利油菜授粉，其誘發(fā)頻率為1.25%，并利用獲得的單倍體加倍選育得到了油菜純合自交系“3529”“9316”，利用“3529”自交系與“奧羅”“非洲12”雜交組配出了強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合［37］。但該方法誘導(dǎo)效率極低，在生產(chǎn)上少有成功應(yīng)用的報(bào)道，限制了育種家利用該技術(shù)開(kāi)展廣泛育種實(shí)踐的可能。

3.4 單倍體誘導(dǎo)基因

1958年，Coe［38］首次報(bào)道了玉米單倍體誘導(dǎo)系Stock6，其誘導(dǎo)率在1%～2%之間。之后在Stock6基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，在玉米中衍生出了CAUHOI、WS14、RWS和MHI等［20］一批優(yōu)質(zhì)的高誘導(dǎo)率誘導(dǎo)系，并廣泛應(yīng)用于玉米自交系的選育中。近年來(lái)，經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的不斷努力，已經(jīng)成功克隆了誘導(dǎo)玉米單倍體的相關(guān)功能基因（MATL/ZMPLA1/NLD和ZmDMP）［39-40］，同時(shí)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中也發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)單倍體發(fā)生的關(guān)鍵基因CENH3［41］。Li等［42］利用帶有綠色熒光蛋白的CRISPR/Cas9載體敲除甘藍(lán)型油菜Westar中4個(gè)與玉米DMP具有相同結(jié)構(gòu)域的BnaDMP基因以創(chuàng)制甘藍(lán)型油菜單倍體誘導(dǎo)系，產(chǎn)生的BnaDMP突變體在T0、T1和T2代的單倍體誘導(dǎo)率達(dá)到2.53%。

母本體內(nèi)和體外產(chǎn)生的單倍體，需加倍為雙單倍體形成純系。單倍體加倍的方式有人工加倍和自然加倍兩種，自然加倍發(fā)生的頻率很低。Wu等［43］在單倍體誘導(dǎo)系CAUHOI做父本誘導(dǎo)玉米時(shí)，在誘導(dǎo)后代中發(fā)現(xiàn)了早期雙單倍體植株（自然加倍），但其自然加倍頻率極低，不超過(guò)0.1%。

4 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系在油菜品種選育中的作用

4.1 快速選育甘藍(lán)型油菜保持系、恢復(fù)系

利用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系可快速選育恢復(fù)系和保持系。首先，確定甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系和保持系選育的目標(biāo)性狀，將至少兩個(gè)具有目標(biāo)性狀的甘藍(lán)型油菜雜交或聚合雜交，根據(jù)目標(biāo)性狀要求進(jìn)行回交或多代回交，形成雜交后代、聚合雜交后代或回交后代。然后用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)這些雜交或回交后代，得到的誘導(dǎo)后代再自交，即可獲得穩(wěn)定系。此穩(wěn)定系再與核不育系或質(zhì)不育系進(jìn)行測(cè)交。若測(cè)交后代全可育則得到的穩(wěn)定系為恢復(fù)系；若測(cè)交后代全不育，則得到的穩(wěn)定系為保持系。利用此誘導(dǎo)系已獲得波里馬細(xì)胞質(zhì)不育恢復(fù)系C2859、核不育恢復(fù)系C2994、波里馬細(xì)胞質(zhì)質(zhì)不育保持系B4653、蘿卜細(xì)胞質(zhì)不育恢復(fù)系C4707，此外，還利用所選育的波里馬細(xì)胞質(zhì)不育恢復(fù)系C2859與蓉A0068配組，選育了雙低優(yōu)質(zhì)甘藍(lán)型油菜旺成油8號(hào)［3，44］。

4.2 快速同步選育甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)不育系和保持系

在研究中發(fā)現(xiàn)，油菜雙單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)nap胞質(zhì)純合母本，其誘導(dǎo)后代會(huì)同時(shí)出現(xiàn)表型基本一致的可育和不育株，利用60K SNP芯片分析該不育和可育單株，其遺傳相似系數(shù)超過(guò)90%，最高可達(dá)98%，推測(cè)可育和不育是保持系和不育系的關(guān)系，并自交和姊妹交，同步選育出了保持系和不育系［45］。通過(guò)重測(cè)序和線粒體染色體組裝，線粒體共線性分析不育系和保持系轉(zhuǎn)化的原因，發(fā)現(xiàn)原有的保持系線粒體發(fā)生了重排，導(dǎo)致其從可育變成了不育。誘導(dǎo)系誘導(dǎo)雜合母本具有相似的結(jié)果。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為油菜快速同步選育保持系和不育系提供了新途徑，也為種質(zhì)資源的創(chuàng)新提供了新模式。

先用已知待改良的甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)保持系或不育系作母本與其他具有優(yōu)良性狀的甘藍(lán)型油菜雜交或測(cè)交，再用油菜DH系對(duì)產(chǎn)生的F1代進(jìn)行授粉誘導(dǎo)，產(chǎn)生核基因純合的F2代單株。然后篩選具有優(yōu)良品質(zhì)的F2代單株并自交，得到的F3代出現(xiàn)育性分離，并從中篩選出遺傳相似系數(shù)大于95%的可育與不育株，進(jìn)行姊妹交。當(dāng)姊妹交后代全不育及完全可育后代不再分離不育單株時(shí)，則得到核基因一致的不育系和保持系。當(dāng)完全可育單株后代依舊分離為不育和可育后代時(shí)，則重復(fù)進(jìn)行多個(gè)單株的成對(duì)姊妹交，直到不再分離。這樣不僅能快速同步選育新品種，也可最快在2～4代左右獲得穩(wěn)定、純合的保持系與不育系［4］，但如果用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)雜合的不育單株，出現(xiàn)了優(yōu)良的不育系，沒(méi)有成對(duì)等位的保持系保持不育狀態(tài)，也可用高誘導(dǎo)能力的誘導(dǎo)系作為萬(wàn)能保持系，以使保持多個(gè)不育的不育狀態(tài)并維持核基因組的遺傳穩(wěn)定性［46］。

4.3 在種間及遠(yuǎn)緣雜交獲得甘藍(lán)型油菜育種資源中的應(yīng)用

油菜及十字花科作物遠(yuǎn)緣雜交可產(chǎn)生大量的遺傳變異，是種質(zhì)資源創(chuàng)新的有效途徑。遠(yuǎn)緣雜交存在生殖障礙現(xiàn)象，包括雜交不親和、雜種不育。有研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜雜交，產(chǎn)生三倍體的甘白雜交后代，此雜交后代表現(xiàn)出自交不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率低等現(xiàn)象［5］。經(jīng)過(guò)油菜雙單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)甘白雜交F1代，得到的誘導(dǎo)后代為四倍體甘藍(lán)型油菜，其擁有大量來(lái)自白菜型油菜的遺傳特性且遺傳穩(wěn)定。該誘導(dǎo)過(guò)程利用種間或遠(yuǎn)緣雜交中雜交F1代雌配子遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)于雄配子的普遍自然現(xiàn)象，借助誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)母體卵細(xì)胞的加倍，使孤雌生殖獲得穩(wěn)定遺傳后代。誘導(dǎo)系誘導(dǎo)使種間雜交后代快速達(dá)到純合穩(wěn)定狀態(tài)，縮短了育種年限，避免了因分離世代長(zhǎng)且不穩(wěn)定而丟失有益變異的問(wèn)題。因此，誘導(dǎo)系誘導(dǎo)可使種間雜交后代快速得到遺傳穩(wěn)定純系，并保留了親本豐富的遺傳變異，拓寬了種間雜種后代的遺傳距離［5，47］，對(duì)油菜及十字花科作物的遺傳改良具有極大的促進(jìn)作用。

4.4 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系在基因編輯中的應(yīng)用

依賴轉(zhuǎn)基因的基因編輯技術(shù)是研究基因功能以及作物性狀改良的重要工具。其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于許多作物中精確修飾重要的農(nóng)藝性狀［48］。基于誘導(dǎo)系作為父本授粉誘導(dǎo)時(shí)，父本染色體在受精后選擇性消失的誘導(dǎo)作用機(jī)制，出現(xiàn)了單倍體誘導(dǎo)系介導(dǎo)的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)（HI-Edit system）［49］，CRISPR載體導(dǎo)入到單倍體誘導(dǎo)系，誘導(dǎo)系作為父本授粉誘導(dǎo)需要改良的母本，就得到了性狀被改良且沒(méi)有Cas9載體的單倍體。Li等［50］首次利用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)油菜及甘藍(lán)基因進(jìn)行直接修飾。此方法利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建基因編輯載體，然后將基因編輯載體遺傳轉(zhuǎn)化到油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380中，此轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)系作為父本給甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜授粉，父本染色體在受精后消失，基因編輯元件隨著染色體消失而消除，之后母本染色體加倍，最后得到不含轉(zhuǎn)基因元件的突變的雙單倍體植株，編輯效率最高可達(dá)12.97%。此方法不僅繞過(guò)了自交多代獲得純合體的過(guò)程，且對(duì)重要的育種材料進(jìn)行直接或批量基因編輯而不依賴于受體的遺傳轉(zhuǎn)化效率，這為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在多種植物的應(yīng)用提供了新思路［6，50］。但利用此方法獲得的編輯后代沒(méi)有實(shí)現(xiàn)突變體位點(diǎn)的等位基因純合，推測(cè)編輯過(guò)程發(fā)生在母本染色體加倍之后。

5 展望

誘導(dǎo)系誘導(dǎo)母體產(chǎn)生單倍體或雙單倍體，對(duì)作物育種特別是等位基因的快速純合具有巨大的作用。首次報(bào)道的誘導(dǎo)系是玉米單倍體誘導(dǎo)系Stock6［38］，誘導(dǎo)率僅為2%。迄今為止，由Stock6衍生出了許多高誘導(dǎo)率的單倍體誘導(dǎo)系，誘導(dǎo)率可達(dá)到16%～30%［51］。單倍體誘導(dǎo)技術(shù)已成為玉米工程化、規(guī)模化育種的重要技術(shù)手段，科學(xué)家經(jīng)過(guò)不斷地努力已挖掘到兩個(gè)誘導(dǎo)相關(guān)的功能基因，即玉米花粉特異性磷脂酶A基因MATRILINEAL（ZMPLA1）和編碼DUF679結(jié)構(gòu)域的ZmDMP基因，現(xiàn)已將這兩個(gè)基因的應(yīng)用拓展到了其他作物上。此外，在模式植物擬南芥中開(kāi)發(fā)了一種著絲粒介導(dǎo)染色體消失產(chǎn)生單倍體的方法。表2為單倍體誘導(dǎo)系和雙單倍體誘導(dǎo)系的作用機(jī)制及應(yīng)用。

表2 誘導(dǎo)系的作用機(jī)制及應(yīng)用Table 2 Mechanism and application of induction lines

除玉米之外，單倍體誘導(dǎo)系在其他作物包括雙子葉作物上也得到了應(yīng)用。但對(duì)于像甘藍(lán)型油菜這樣的多倍體植物，由于基因冗余現(xiàn)象，很難利用基因編輯技術(shù)對(duì)ZmDMP和CENH3基因進(jìn)行編輯而實(shí)現(xiàn)高水平的母本誘導(dǎo)，因此需要開(kāi)發(fā)更多的具有誘導(dǎo)能力的功能基因。

在油菜上報(bào)道的雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380、Y3560，其誘導(dǎo)率達(dá)30%～90%。此誘導(dǎo)系可直接省去染色體加倍的環(huán)節(jié)得到純系，在一定程度上縮短了育種時(shí)間，促進(jìn)了育種進(jìn)程，具有非常大的應(yīng)用潛力。油菜雙單倍體誘導(dǎo)系，除在甘藍(lán)型油菜直接應(yīng)用外，在十字花科作物也得到了應(yīng)用，這是目前唯一的直接利用花粉實(shí)現(xiàn)跨作物誘導(dǎo)的應(yīng)用。目前，雙單倍體誘導(dǎo)系正在更多作物上進(jìn)行應(yīng)用探索。同時(shí)，相關(guān)雙單倍體誘導(dǎo)的功能基因的定位和克隆研究也正在進(jìn)行之中，為未來(lái)的油菜、十字花科及其他作物應(yīng)用該基因奠定了基礎(chǔ)。