高油酸油菜遺傳育種研究進(jìn)展

咸志慧，龍衛(wèi)華*，譚筱玉，胡茂龍，浦惠明

1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，南京210014；

2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212400

油菜（主要指甘藍(lán)型油菜，Brassica napusL.）是我國重要的油料作物之一，常年種植面積7.0×106hm2，居全球油菜生產(chǎn)國種植面積首位［1］。菜籽油是油菜生產(chǎn)的最主要農(nóng)產(chǎn)品，也是我國居民消費(fèi)最廣泛的植物油種類之一。脂肪酸幾乎是菜籽油的全部組分，決定了菜籽油的品質(zhì)。脂肪酸改良一直是油菜品質(zhì)改良的主要內(nèi)容［2］。

21世紀(jì)初，我國油菜育種界通過引進(jìn)特異種質(zhì)資源改良原有油菜品種，基本實現(xiàn)了所有審定油菜品種的雙低化（菜籽餅低硫苷和菜籽油低芥酸），實現(xiàn)了我國油菜生產(chǎn)的第三次飛躍，同時完成了我國菜籽油的第一輪品質(zhì)改良［3］。由于雙低菜籽油中芥酸含量急劇降低（低至＜1%），菜籽油的脂肪酸組分得到優(yōu)化，其中不飽和十八碳脂肪酸（C18∶1≈62%，C18∶2≈19%，C18∶3≈9%）總含量超過90%，飽和脂肪酸（主要為C16∶0和C18∶0）僅占約7%，因此十八碳脂肪酸的改良成為新一輪菜籽油品質(zhì)改良的目標(biāo)。

高油酸（C18∶1）菜籽油一般是指油酸相對含量超過75%的菜籽油［4］。與普通雙低菜籽油相比，高油酸菜籽油具有三大優(yōu)勢：①貨架期較長，耐貯藏性更優(yōu)。在十八碳多不飽和脂肪酸中，亞油酸（C18∶2）和亞麻酸（C18∶3）是人體的必需脂肪酸，其中亞油酸有2個雙鍵，亞麻酸有3個雙鍵，兩者化學(xué)結(jié)構(gòu)均不穩(wěn)定，極易氧化分解而變味，產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)（包括反式脂肪酸）。高油酸菜籽油中亞油酸和亞麻酸總量降至10%左右，在滿足人體所需的脂肪酸前提下雙鍵含量更少，成分更穩(wěn)定。②對人體健康更有益，保健功能也更強(qiáng)。醫(yī)學(xué)研究表明，高油酸在降低對人體有害的低密度脂蛋白含量的同時，不影響有益高密度脂蛋白的含量，減少膽固醇形成，預(yù)防人體心血管疾病。國外流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，地中海地區(qū)國家的居民比較長壽，心血管病發(fā)病率較低，這與當(dāng)?shù)厝藗兤毡槭秤酶缓退岬拈蠙煊陀嘘P(guān)［5］。③烹飪特性更好。高油酸菜籽油在加熱到較高溫度時不冒煙，既適用于家庭烹調(diào)，也適用于餐飲業(yè)加工一些存放時間較長的快餐食品和糕點(diǎn)［6］。④高油酸菜籽油因其甲酯化程度高，燃燒值高，更有利于生產(chǎn)生物柴油［7］。因此，提高油酸含量，同時降低多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的含量，成為菜籽油品質(zhì)改良的主要目標(biāo)。當(dāng)前我國高油酸遺傳育種已取得不少成果，本研究將圍繞高油酸油菜的種質(zhì)創(chuàng)制、遺傳分析、基因克隆及品種選育等方面進(jìn)行總結(jié)，以期為高油酸油菜品種選育提供參考。

1 高油酸油菜種質(zhì)資源創(chuàng)制及遺傳模式

在傳統(tǒng)的油菜種質(zhì)資源庫中并未發(fā)現(xiàn)高油酸種質(zhì)資源的存在［8］，因此各國科研人員試圖通過人工誘變、基因干擾、基因編輯等傳統(tǒng)或現(xiàn)代生物技術(shù)來創(chuàng)建油菜高油酸資源，相關(guān)研究取得了一系列的成果。

高油酸油菜種質(zhì)資源創(chuàng)建常用的方法是人工誘變，其中物理誘變和化學(xué)誘變是兩種主要誘變方式。美國科學(xué)家最早采用5%甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfone，EMS）溶液處理油菜種子，在M2代發(fā)現(xiàn)了低多不飽和脂肪酸株系，F(xiàn)4代篩選到油酸含量大于87%的突變體［9］。1995年Rukker等［10］報道了利用EMS誘變獲得了兩株油酸含量分別為74.1%和74.6%的油菜品系。隨后，有研究采用兩次EMS誘變的方法逐漸提高油酸含量，得到了兩株油酸含量分別為76.1%和76.6%的品系［11］。我國學(xué)者也利用不同方法開展高油酸油菜誘變研究。例如，在油菜小孢子培養(yǎng)過程中，用EMS誘變處理適期發(fā)育的小孢子后再對小孢子苗單株產(chǎn)生的種子進(jìn)行篩選，獲得了油酸含量為80.3%的高油酸突變體材料［12］。利用8～10萬倫琴60Co射線輻射雙低油菜干種子，并對輻射后代進(jìn)行高油酸極端選擇，近紅外方法檢測發(fā)現(xiàn)M3代油酸含量迅速提高，多數(shù)植株油酸含量在70%以上，最高油酸含量達(dá)93.5%［13］。以高濃度EMS溶液（1.5%）誘變處理油菜種子，在M1代就篩選到油酸 超 過70%的 單 株［14］。以 低 濃 度EMS溶 液（0.4%）誘變油菜得到突變體庫，在M3代也找到油酸含量為75.02%的高油酸突變株系［15］。此外，通過航天誘變的方法獲得了一個油酸含量達(dá)87.22%的突變株系［16］。以萌動發(fā)芽油菜種子為對象，利用60Co-?射線輻照結(jié)合在M6代篩選得到一系列油酸含量穩(wěn)定在73.51%～85.47%的后代株系［17］。以上研究結(jié)果表明，利用人工誘變篩選高油酸種質(zhì)的思路和方法是可行的，誘變效率也相對較高。

此外，利用生物技術(shù)（包括基因干擾、基因編輯）也成功創(chuàng)制了多個高油酸種質(zhì)資源。自2000年首次報道了利用共抑制技術(shù)獲得油酸含量高達(dá)89%的油菜株系后［18］，國內(nèi)外學(xué)者先后采用RNA抑制技術(shù)（RNAi）得到了一系列油酸含量顯著提高的株系，如干擾BnFAD2獲得了油酸含量高達(dá)約80%的油菜轉(zhuǎn)基因植株［19-22］。隨著基因編輯技術(shù)在油菜上的利用，各國學(xué)者也得到成功的結(jié)果［23-25］。

闡明油菜高油酸性狀的遺傳模式，對于其育種利用至關(guān)重要。以高油酸親本（C18∶1含量大于75%）和普通油酸親本構(gòu)建DH群體，對兩年三點(diǎn)的油酸含量進(jìn)行遺傳力分析表明，高油酸性狀遺傳力達(dá)到0.99，環(huán)境因素影響極?。?6］。通過對高油酸親本DMS100（C18∶1=77%）與普通品系衍生DH群體的油酸含量性狀進(jìn)行QTL定位，發(fā)現(xiàn)其高油酸性狀主要由一個主效位點(diǎn)控制［27］。以高油酸（含量87.22%）自交系Y539（C18∶1=87.22%，C18∶3=1.94%）與普通油酸雜交構(gòu)建F2群體，通過高油酸性狀緊密分子標(biāo)記確定其高油酸性狀是由A05和A01上的兩個主效位點(diǎn)控制［16］。利用高油酸品系SW Hickory（C18∶1=78%）與普通油酸雜交構(gòu)建DH群體，通過QTL定位確定其高油酸性狀位于A5染色體上，并根據(jù)這個主效QTL開發(fā)了緊密連鎖分子標(biāo)記［28］。利用高油酸親本H005（C18∶1=83.10%）與普通油酸含量親本構(gòu)建了六世代遺傳分析群體，結(jié)果表明H005的高油酸性狀由兩對主效基因控制，且具有加性和顯性效應(yīng)［29］。以高油酸種質(zhì)B161（C18∶1≈85%）與3個不同遺傳背景的常規(guī)品系構(gòu)建油酸的六世代遺傳分離群體，混合遺傳分析表明，該種質(zhì)中高油酸含量性狀均由兩對主效基因控制，加性效應(yīng)為主要遺傳效應(yīng)［17］。從現(xiàn)有高油酸性狀的遺傳模式結(jié)果看，油酸含量在75%～80%的種質(zhì)資源，其高油酸性狀一般由一對基因控制；油酸含量大于80%的種質(zhì)資源，其高油酸性狀一般由兩對基因控制。

2 油菜高油酸基因的克隆與突變位點(diǎn)

油菜為異源四倍體植物，在其基因組測序完成之前進(jìn)行基因克隆的難度較大，但模式生物擬南芥脂肪酸的合成調(diào)控途徑為解析油菜脂肪酸含量調(diào)控途徑提供了參考。脂肪酸合成過程大致為：乙酰輔酶A作為脂肪酸碳鏈的基本單元，通過還原、脫水和還原等步驟循環(huán)逐步合成長鏈（16-或18-碳）植物脂肪酸。位于質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的各種去飽和酶負(fù)責(zé)催化長鏈脂肪酸變成單不飽和（棕櫚烯酸C16∶1和油酸C18∶1）或多不飽和（亞油酸C18∶2和亞麻酸C18.3）脂肪酸，其中Δ-12脂肪酸去飽和酶2（Δ12-FAD2）可將油酸前體轉(zhuǎn)化為亞油酸前體，它也是油料作物種子中油酸含量的主要控制酶［30］。

在油菜中，雖然也有不少研究者進(jìn)行了Bn-FAD2基因克?。?1-33］，但直到2013年才首次系統(tǒng)研究了BnFAD2多個同源基因的特征［34］。油菜中4個BnFAD2基因分別為BnFAD2-A5、BnFAD2-C5、BnFAD2-A1和BnFAD2-C1，其中位于A基因組的兩個同源基因來源于白菜（Brassica rapaL.），另外兩個位于C基因組的同源基因來源于甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.）。位于A5和C5染色體上的Bn-FAD2均為組成型表達(dá)，在幼苗、葉片、莖干、根、花等不同組織以及種子不同發(fā)育時期均有表達(dá)；位于A1上的BnFAD2缺失一段序列成為非功能基因；而位于C1染色體上的BnFAD2在不同發(fā)育時期的種子中均有表達(dá)，在根、花和角果皮中保持極低表達(dá)，為種子特異性誘導(dǎo)表達(dá)基因［35］。隨后對3個BnFAD2基因的功能元件進(jìn)行了深入研究。采用酵母功能互補(bǔ)實驗進(jìn)行功能驗證，發(fā)現(xiàn)Bn-FAD2-A5和BnFAD2-C5基因的去飽和能力接近，均大于BnFAD2-C1基因。BnFAD2-A5和BnFAD2-C5是影響油菜種子油酸積累的主效基因［36］。采用Western blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，BnFAD2-C5啟動子區(qū)域-1 257～-1 020 bp和-319～-1 bp能夠誘導(dǎo)報告基因在種子發(fā)育中期高效表達(dá)，其內(nèi)含子（+631～+1 033 bp區(qū)域）具有增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄的功能［37］。BnFAD2A5在其5′-非翻譯區(qū)含有一個內(nèi)含子（1 192 bp），該內(nèi)含子具有啟動子活性，-220～-1 bp是最小啟動子區(qū)，-220～-110 bp和+34～+285 bp是賦予高轉(zhuǎn)錄水平的兩個重要區(qū)域。GATA家族的轉(zhuǎn)錄因子可以與BnFAD2-A5和BnFAD2-C5啟動子中的GT元件發(fā)生互作產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)基因［38］。BnFAD2-C1的調(diào)控區(qū)存在潛在順式作用元件，通過茉莉酸誘導(dǎo)處理可使其基因表達(dá)量發(fā)生變化［39］。

為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)能夠影響油菜油酸含量的其他基因，科學(xué)家進(jìn)一步利用全基因組關(guān)聯(lián)分析、QTL定位等方法獲得了其他油菜高油酸控制基因。尹明智等［40］發(fā)現(xiàn)DOF轉(zhuǎn)錄因子含有一個獨(dú)特的富含Cys殘基的單鋅指DNA結(jié)合區(qū)域。將干擾載體pADOF1成功轉(zhuǎn)入野生型擬南芥后，發(fā)現(xiàn)種子油酸含量明顯上升，說明Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物油酸代謝途徑中有重要作用［40］。一個CCCH型轉(zhuǎn)錄因子BnZFP1通過提高diacylglycerol O-acyltransferase 1（Dgat 1）基因的表達(dá)，從而提高油酸的含量［41］。利用GWAS技術(shù)對375個雙低油菜品系的油酸含量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)了一個新的QTL位點(diǎn)，其候選基因編碼一個金屬離子結(jié)合蛋白，能使油酸含量提高3～5個百分點(diǎn)［42］。吲哚-3-丙酮酸單氧合酶基因BnaYUCCA10在角果期及開花5 d的花中的表達(dá)量與油酸含量呈極顯著正相關(guān)，在高油酸材料中的表達(dá)量顯著高于非高油酸材料的表達(dá)量，推測BnaYUCCA10基因可能參與種子的油酸代謝［43］。由此表明，影響植物油酸合成的基因可能并未被完全發(fā)掘，需要進(jìn)一步探索。

油菜全基因組測序以及生物技術(shù)的發(fā)展有利于研究高油酸種質(zhì)資源的功能基因以及功能基因上的突變位點(diǎn)（表1）。利用RNA干擾BnFAD2得到了高油酸油菜株系，表明BnFAD2是顯著提升油菜油酸含量的關(guān)鍵基因。通過對不同油菜高油酸突變體控制基因的分析發(fā)現(xiàn)，目前大部分的高油酸種質(zhì)，其控制基因均為BnFAD2，而且大部分突變位點(diǎn)均發(fā)生在BnFAD2-A5和BnFAD2-C5這兩個基因上。

表1 非轉(zhuǎn)基因油菜高油酸種質(zhì)的BnFAD2突變Table 1 BnFAD2 mutation in non-transgenic rapeseed germplasm with high oleic acid

3 高油酸品種創(chuàng)制以及我國高油酸品種發(fā)展趨勢

國際上以歐美國家最早開展高油酸油菜品種的選育工作。2004年，加拿大Cargill種子公司推出CNR604（油酸含量75%）、CNR603（油酸含量85%）等品系參加品比試驗［48］。澳大利亞最早于2007年推出兩個替代品種Cargill102和Cargill103［49］。歐洲第一個高油酸品種SPLENDOR于2004年在法國注冊，油酸含量為76%，且具有較好的農(nóng)藝性狀（根系正常）。歐洲油菜育種家也將高油酸性狀轉(zhuǎn)入蘿卜質(zhì)不育系統(tǒng)培育三系雜交高油酸品種。

我國于21世紀(jì)初開展高油酸油菜品種的培育工作。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、西南大學(xué)等均自行創(chuàng)制了高油酸種質(zhì)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所等單位陸續(xù)登記了高油酸新品種。浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院于2015年審定了高油酸品種浙油80，油酸含量超過80%，并且推出了“愛是?！备哂退峤】挡俗延推放疲?0］。2017年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)在湖北省荊門市大面積種植的高油酸菜籽油獲得成功，并與油脂加工公司合作開展高油酸油菜訂單農(nóng)業(yè)，產(chǎn)業(yè)化規(guī)模逐漸加大［51］。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)與衡陽市合作發(fā)展高油酸油菜產(chǎn)業(yè)，組建了高油酸油菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟［52］。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用自創(chuàng)高油酸種質(zhì)轉(zhuǎn)育骨干系，于2020年登記了高油酸三系雜交油菜品種益康1號（GPD油菜（2021）320278），油酸含量高達(dá)82.01%，目前該品種已在多點(diǎn)示范種植。與此同時，國內(nèi)多個大型油脂加工廠已經(jīng)表示出對高油酸油菜的極大興趣，正在對接各高油酸油菜品種研究單位進(jìn)一步開展合作。

4 當(dāng)前高油酸油菜品種的不足及改良途徑

盡管國內(nèi)外均有高油酸油菜品種的登記和商業(yè)化生產(chǎn)，但這些品種的缺點(diǎn)是產(chǎn)量水平較低。油菜有3個BnFAD2同源基因能正常發(fā)揮功能，但目前可查詢的商業(yè)化高油酸油菜品種主要利用BnFAD2-1和BnFAD2-2這兩個組成型表達(dá)的高油酸突變基因。一個可能的原因是，這兩個同源基因的組成型表達(dá)特征，高油酸品種的各個組織在全生育期油酸含量低于正常值。當(dāng)遇到低溫時，高油酸油菜較普通油菜細(xì)胞中脂肪酸不飽和度較低，抗低溫凝固性能較差，營養(yǎng)器官細(xì)胞生長更容易受到抑制，故而在表型上表現(xiàn)為葉色更綠、生長緩慢等。正是由于營養(yǎng)階段生物量的降低，造成高油酸油菜在花期和結(jié)角期植株相對較小、角果量較少，產(chǎn)量較低。

高油酸品種的改良，一是要保證高油酸基因不丟失，確保高油酸性狀；二是要持續(xù)提高其產(chǎn)量水平。基于此，我們提出了高油酸品種的改良途徑。①篩選高效實用型分子標(biāo)記，防止基因丟失。油菜BnFAD2-1和BnFAD2-2雖位于不同的染色體上，但其表達(dá)框同源性超過97%。如利用分子標(biāo)記進(jìn)行后代單株篩選，必須設(shè)計高效準(zhǔn)確的分子標(biāo)記。②將高油酸基因轉(zhuǎn)育至多種遺傳背景。國內(nèi)高油酸品種培育工作開啟不久，育種體系尚未規(guī)模化。將高油酸基因轉(zhuǎn)育至更多的遺傳背景進(jìn)行產(chǎn)量水平鑒定，是當(dāng)前高油酸油菜育種工作亟需解決的問題。③進(jìn)一步利用新的高油酸基因進(jìn)行資源創(chuàng)制工作。先前研究中，BnFAD2-C1為種子特異型表達(dá)基因，但其突變體報道較少。如果對其開展定向突變工作，有可能獲得營養(yǎng)生長不受影響的油菜種質(zhì)，或許其產(chǎn)量性狀與普通油菜無異。另外，隨著基因編輯技術(shù)的興起與應(yīng)用，也可以對其他類型的油酸控制位點(diǎn)或基因開展定向突變工作。④與雜種優(yōu)勢利用途徑相結(jié)合進(jìn)一步提高產(chǎn)量。雜種優(yōu)勢利用是公認(rèn)提高油菜單產(chǎn)的方式，將高油酸基因轉(zhuǎn)育至雜交親本中，利用雜種優(yōu)勢來提高高油酸品種的產(chǎn)量。