降香化學(xué)成分研究

焦瑩瑩，梅文莉，戴好富，陳惠琴，袁靖喆，曲有樂，王 昊*

1佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，佳木斯154007；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室，?？?71101；3海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院 海南省熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用重點實驗室，?？?71101

降香是豆科(Leguminosae)植物降香黃檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)的樹干和根的干燥心材[1]。降香黃檀又名黃花梨，主要分布于海南島西部及西南部平原或丘陵地區(qū)[2]。降香性溫味辛，歸肝、脾經(jīng)，具有活血化瘀、止血止痛的功效，主要與丹參配伍治療冠心病、心絞痛等心腦血管疾病，臨床上較常見的如復(fù)方丹參注射液和冠心丹參片等[3]。降香中有效化學(xué)成分是二氫黃酮、異黃酮、二氫異黃酮、異黃烷、紫檀素、查爾酮等黃酮類化合物和主要由橙花叔醇等倍半萜類化物組成的揮發(fā)油[4]。藥理作用研究表明，降香中黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抑菌等活性，揮發(fā)油類成分具有抗血栓、促進(jìn)血管新生、改善心肌功能等作用。此外，降香還具有乙酰膽堿酯酶抑制活性、神經(jīng)保護(hù)等生物活性[3,5-9]。

α-葡萄糖苷酶是引起高血糖的關(guān)鍵酶，其抑制劑能起到降血糖作用[10]?，F(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物不僅具有抗炎、抗菌等生物活性，也是潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，備受研究人員的關(guān)注[11,12]。降香含有大量的黃酮和倍半萜類化合物，而降香化學(xué)成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究比較薄弱。為了進(jìn)一步挖掘降香中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化學(xué)成分，豐富降香的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用各種色譜技術(shù)對降香乙醇提取物的乙酸乙酯部分進(jìn)行分離純化，并采用pNPG法測定化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV-500型超導(dǎo)核磁儀(德國Bruker公司)；Autospec 300質(zhì)譜儀(英國VG公司)；UV-2550紫外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Nicolet 380紅外光譜儀(美國Thermo公司)；MOS-500圓二色光譜儀(法國Biologic公司)；MCP 5100旋光儀(奧地利Anton Paar公司)；安捷倫1260分析型高效液相色譜儀、安捷倫1260半制備型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；柱層析硅膠G(200～300目、60～80目)和薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(德國Merck公司)；氘代試劑(青島騰龍微波科技有限公司)；常用有機(jī)試劑為國產(chǎn)AR級試劑(天津市康科德科技有限公司)；色譜純甲醇(天津市科密歐有限公司)；酶標(biāo)儀(美國寶特公司)；α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(美國Sigma Chemical公司)；二甲基亞砜(天津富宇精細(xì)化工有限公司)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(西隴科學(xué)股份有限公司)。

1.2 材料

降香樣品于2018年9月購買自海南省?？谑校?jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王軍副研究員鑒定其基原植物為降香黃檀DalbergiaodoriferaT.Chen，憑證標(biāo)本(No.201816)存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.3 提取與分離

降香(21.0 kg)用95%乙醇室溫浸提(3×100 L，每次7天)，減壓濃縮后得到乙醇萃取物(1 952.0 g)，將萃取物分散于水中成懸濁液，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。乙酸乙酯萃取物(1 006.8 g)采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離(石油醚-乙酸乙酯20∶1→0∶1)，經(jīng)薄層層析分析后，合并得到10個流分(Fr.1～Fr.10)。Fr.3(5.6 g)經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯300∶1→3∶1)分離得到6個流分(Fr.3-1～Fr.3-6)。Fr.3-5(251.4 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)分離得到8個流分(Fr.3-5-1～Fr.3-5-8)。Fr.3-5-1(101.4 mg)經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮16∶1→3∶1)得到化合物8(2.0 mg)、9(8.4 mg)和10(17.4 mg)。Fr.6(127.0 g)經(jīng)減壓柱色譜(石油醚-丙酮8∶1→0∶1)分離，得到15個流分(Fr.6-1～Fr.6-15)。Fr.6-9(3.3 g)經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)，分離得到7個流分(Fr.6-9-1～Fr.6-9-7)，將Fr.6-9-2(793.6 mg)經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯10∶1→0∶1)分離得到化合物1(9.9 mg)和2(8.1 mg)。將Fr.6-9-6(359.7 mg)經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇300∶1→1∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)得到化合物3(5.5 mg)。Fr.6-10(3.7 g)經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)，得到流分Fr.6-10-1～Fr.6-10-10，將Fr.6-10-7(776.3 mg)經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇200∶1→1∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)分離得到化合物4(2.2 mg)和5(1.6 mg)。將Fr.6-10-8(14.5 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(C18柱，甲醇-水，60∶40)，分離得到化合物7(3.6 mg，tR= 41 min)。Fr.6-10-9(131.7 mg)經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇200∶1→1∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)得到化合物6(35.8 mg)。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

采用pNPG[13]法對化合物1～10進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選，將10 μL用DMSO溶解的待測化合物(10.0 mmol/L)與100 μL磷酸緩沖液(pH 6.8)溶解的α-葡萄糖苷酶溶液(2 U/mL)混合后加入96孔板中，實驗重復(fù)3組，37 ℃下溫育15 min后每孔加入40 μL PNPG(2.5 mmol/L)，繼續(xù)溫育15 min后用酶標(biāo)儀(405 nm)檢測吸光度。陰性和空白對照為DMSO，陽性對照為阿卡波糖，根據(jù)以下公式計算抑制率。根據(jù)初篩時抑制率將化合物1濃度配制為500、400、300、200、100 μmol/L，其他化合物濃度配制為200、100、50、25、12.5 μmol/L，分別測試抑制率，取3次測定結(jié)果的平均值，用GraphPad Prism軟件計算IC50值。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1的關(guān)鍵2D NMR相關(guān)信號Fig.1 Key 2D NMR correlations of compound 1

化合物3白色無定形粉末；ESI-MS：m/z299 [M + H]+。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：8.26(1H，d，J= 8.9 Hz，H-5)，8.05(1H，s，H-2)，7.09(1H，d，J= 8.5 Hz，H-6′)，7.07(1H，dd，J= 8.9，2.4 Hz，H-6)，6.92(1H，d，J= 2.4 Hz，H-8)，6.65(1H，d，J= 2.5，H-3′)，6.54(1H，dd，J= 8.5，2.5 Hz，H-5′)，3.95(1H，s，7-OCH3)，3.82(1H，s，4′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：154.7(C-2)，125.0(C-3)，178.9(C-4)，128.0(C-5)，115.8(C-6)，164.9(C-7)，104.5(C-8)，158.0(C-9)，117.2(C-10)，113.0(C-1′)，158.0(C-2′)，99.9(C-3′)，162.1(C-4′)，107.8(C-5′)，130.3(C-6′)，55.3(7-OCH3)，55.9(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道一致，故鑒定為4,7-二甲氧基-2′-羥基異黃酮。

化合物4白色無定形粉末；ESI-MS：m/z283 [M + H]+。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：8.21(1H，d，J= 8.9 Hz，H-5)，7.92(1H，s，H-2)，7.50(2H，d，J= 8.5 Hz，H-2′，6′)，6.99(1H，dd，J= 8.9，2.3 Hz，H-6)，6.97(2H，d，J= 8.5 Hz，H-3′，5′)，6.85(1H，d，J= 2.3 Hz，H-8)，3.91(1H，s，7-OCH3)，3.84(1H，s，4′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：152.1(C-2)，124.8(C-3)，175.9(C-4)，127.6(C-5)，114.5(C-6)，163.8(C-7)，100.1(C-8)，157.9(C-9)，118.4(C-10)，124.2(C-1′)，130.1(C-2′,6′)，113.9(C-3′，5′)，159.5(C-4′)，56.6(7-OCH3)，55.8(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道一致，故鑒定為7,4′-二甲氧基異黃酮。

化合物5白色無定形粉末；ESI-MS：m/z286 [M + H]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.17(1H，s，H-2)，8.11(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5)，7.14(1H，d，J= 8.1 Hz，H-6′)，7.08(1H，dd，J= 8.6，2.0 Hz，H-6)，7.06(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.50(1H，d，J= 2.4 Hz，H-3′)，6.48(1H，dd，J= 8.1，2.4 Hz，H-5′)，3.93(1H，s，7-OCH3)，3.77(1H，s，2′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：156.8(C-2)，124.1(C-3)，178.8(C-4)，128.2(C-5)，116.4(C-6)，116.2(C-7)，103.2(C-8)，162.7(C-9)，113.0(C-10)，118.8(C-1′)，158.0(C-2′)，106.6(C-3′)，159.8(C-4′)，101.2(C-5′)，133.0(C-6′)，56.6(7-OCH3)，55.7(2′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道一致，故鑒定為3-(4-羥基-2-甲氧基苯基)-7-甲氧基-4H-色烯-4-酮。

化合物10白色無定形粉末；ESI-MS：m/z297 [M + H]+。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.92(1H，d，J= 8.6 Hz，H-1)，7.84(1H，m，H-7)，7.14(1H，d，J= 2.2 Hz，H-4)，7.02(1H，dd，J= 8.6，2.2 Hz，H-2)，6.96(1H，br s，H-10)，6.95(1H，m，H-8)，3.89(6H，s，3-OCH3，9-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：121.7(C-1)，113.1(C-2)，162.7(C-3)，101.6(C-4)，155.2(C-4a)，159.4(C-6)，103.6(C-6a)，116.8(C-6b)，122.6(C-7)，113.3(C-8)，160.2(C-9)，97.0(C-10)，156.6(C-10a)，158.6(C-11a)，106.3(C-11b)，56.0(3-OCH3)，55.9(9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報道一致，故鑒定為3,9-二甲基-6H-苯并呋喃[3,2-c]色烯-6-酮。

圖2 降香中化合物1～10的結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structures of compounds 1-10 from Dalbergiae Odoriferae Lignum

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性

采用pNPG法測試了化合物1～10的α-葡萄糖苷酶抑制活性。結(jié)果顯示，化合物1、6、8、9具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50值分別為366.77 ± 1.46、113.11 ± 0.87、56.21 ± 1.01和92.63 ± 0.91 μmol/L，優(yōu)于陽性對照阿卡波糖(IC50= 582.00 ± 2.60 μmol/L)，化合物2～5、7和10在200 μmol/L濃度下的抑制率低于50%。構(gòu)效關(guān)系分析表明，化合物1中α,β-不飽和酮增強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制活性，活性優(yōu)于化合物2，而化合物10中α,β-不飽和酮降低α-葡萄糖苷酶抑制活性，明顯弱于化合物8和9的活性。

3 結(jié)論

從降香中分離得到10個化合物，包括2個倍半萜類化合物(1、2)和8個黃酮類化合物(3～10)。其中，化合物1為桉烷型倍半萜，具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，為降香中首次報道具有該活性的化合物類型；化合物8和9為紫檀素類化合物，其α-葡萄糖苷酶抑制活性較為顯著。據(jù)文獻(xiàn)報道，化合物8對枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用[26]，化合物8和9也表現(xiàn)出抑制人肝癌細(xì)胞增殖的作用[27]，因此在后續(xù)工作中，應(yīng)對此類化合物的作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究。本文為降香的藥理研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為降香的開發(fā)應(yīng)用提供參考。