黃連內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究

楊 慧，李 鋼，淮瑞平，楊丹妮，雷利杰，歐陽艷，熊莉麗

西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031

黃連(CoptischinensisFranch.)屬于毛茛科、黃連屬，在《本草綱目》中記載：黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒之效[1]。黃連屬植物約有18種，我國產(chǎn)6種，分別是黃連、三角葉黃連、云南黃連、峨眉黃連、五葉黃連、五裂黃連，一個變種：短萼黃連，以上前三種習(xí)稱為“味連”“雅連”和“云連”。四川是黃連的主要產(chǎn)地之一，《名醫(yī)別錄》記載：“黃連生巫陽及蜀郡大山，二月八月采”[2]。早在明代以前，四川峨眉地區(qū)就開始人工栽培黃連，目前四川峨眉地區(qū)就有GAP味連種植基地。傳統(tǒng)中藥黃連水煎液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等體外抑菌效果顯著[3]。黃連及其有效成分的抗菌機理是復(fù)雜多樣的，包括破壞細菌細胞膜、抑制胞內(nèi)大分子物質(zhì)的合成、阻斷細菌分裂和發(fā)育、干擾Z環(huán)的形成以抑制細胞分裂蛋白FtsZ[4]。

內(nèi)生菌是指棲息在植物器官中的細菌或真菌，能夠在植物內(nèi)部組織中定居，且不會對宿主造成明顯的傷害。植物內(nèi)生菌是重要的生物活性產(chǎn)物的新來源[5]。有學(xué)者從松果屬植物Conocarpuserecta中分離到內(nèi)生真菌Cytosporasp.，在其發(fā)酵液中篩選出新型抗菌化合物cytosporone D，對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌抑菌效果顯著[6]。日益嚴峻的抗生素耐藥性已經(jīng)對人類健康構(gòu)成重大威脅[7]，發(fā)掘藥用植物內(nèi)生真菌資源是尋找新型抗菌藥物的新途徑之一[8]。

四川作為黃連主產(chǎn)地之一，目前對川黃連內(nèi)生真菌多樣性的相關(guān)研究仍為空白，同時對于黃連內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性和機制也未見有研究。目前已有的黃連內(nèi)生菌研究集中于分離菌株代謝產(chǎn)物中的單體化合物[9,10]以及篩選產(chǎn)小檗堿的黃連內(nèi)生真菌[11,12]。藥用植物內(nèi)生菌多樣性及內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的進一步研究等方面均具有深入研究的意義和價值，因此本研究依托于川黃連的產(chǎn)地優(yōu)勢，探究四川地區(qū)黃連內(nèi)生真菌的多樣性，進一步研究其代謝產(chǎn)物抑菌機制，為黃連內(nèi)生真菌資源的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

基因擴增儀A200(杭州朗基科學(xué))；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工)；Inspect掃描電子顯微鏡(美國FEI)；E-1045離子濺射裝置(日立高新技術(shù)那珂事務(wù)所)。

1.2 植物材料

黃連采自四川省樂山市峨眉山市，經(jīng)鑒定為一株五年生味連(CoptischinensisFranch.)。

1.3 供試菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923(Staphylococcusaureus)；大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)來自四川省人民醫(yī)院/四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院檢驗科。

1.4 黃連內(nèi)生真菌分離純化

將采集到的新鮮黃連洗凈后對完整枝段及須根部分進行表面消毒后切成0.5 cm×0.5 cm的組織塊，接種到加入青鏈霉素的PDA平板上，正置28 ℃培養(yǎng)[13]。設(shè)置對照實驗組驗證表面消毒程序有效及操作環(huán)境潔凈。培養(yǎng)5～7天后，采用菌絲尖端接種法進行純化，保存于4 ℃冰箱。記錄分離黃連組織塊數(shù)目，按如下公式計算植株內(nèi)生真菌定殖率。

內(nèi)生真菌定殖率=

(分離菌株數(shù)目/分離組織塊數(shù)目)×100%

1.5 內(nèi)生真菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定包括菌落形態(tài)特征描述及菌絲、孢子形態(tài)的觀察。采用載玻片濕室培養(yǎng)法觀察，經(jīng)乳酸酚棉藍染色液染色固定后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)。參考真菌分類學(xué)相關(guān)書籍[14]，對分離到的真菌進行初步分類。

分子生物學(xué)鑒定即采用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)測序的方法，利用測序數(shù)據(jù)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定其親緣關(guān)系[15]。提取真菌DNA，選擇引物ITS5/ITS4(北京擎科生物科技有限公司合成)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[16]。PCR條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，57.3 ℃退火5 s，72 ℃延伸4 s，28個循環(huán)；72 ℃終延伸1 min。序列數(shù)據(jù)經(jīng)處理后與NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對，采用鄰接法構(gòu)建進化樹，自展值5 000，對內(nèi)生真菌的種屬關(guān)系進行分類，如若進化樹待測序列的自展支持值>90%，則基本認定為此種。

1.6 內(nèi)生真菌抗菌性篩選

活化金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌，采用平板稀釋法測定菌落數(shù)目，稀釋菌液濃度為1×106CFU/mL。內(nèi)生真菌抗菌性篩選采用打孔法[17]：在LB培養(yǎng)基上均勻涂布菌液，用7 mm打孔器在平板中央打去瓊脂塊，再將黃連內(nèi)生真菌平板上最外緣打取菌塊接種至涂布好菌液的LB固體平板上，每組設(shè)置3個平行，37 ℃培養(yǎng)，游標卡尺十字交叉法測量抑菌圈大小。

1.7 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性

“1.6”初篩到的抑菌菌株Cop S01、Cop L01、Cop FR01進一步擴大發(fā)酵收集代謝產(chǎn)物?；罨蠼臃N于40 mL PDB培養(yǎng)基后，28 ℃搖床180 r/min，7天后進一步擴大培養(yǎng)體積至1 200 mL，菌絲菌液分離，二氯甲烷萃取菌液，收集有機相旋蒸后稱量產(chǎn)物質(zhì)量，甲醇溶解后備用。抑菌活性檢測采用紙片擴散法[18]，S.aureus作為受試菌株，菌液濃度為1×106CFU/mL，均勻涂布于LB平板，將Cop S01、Cop L01、Cop FR01發(fā)酵產(chǎn)物用甲醇充分溶解后制成30%的溶液，將無菌紙片放入無菌平皿內(nèi)，在每張紙片上緩緩滴加20 μL發(fā)酵產(chǎn)物，使其全部吸收，每組設(shè)置3個平行。將含有發(fā)酵產(chǎn)物及空白對照的紙片用無菌鑷子分別置于LB平板上，將平板正置于4 ℃冰箱過夜，后轉(zhuǎn)入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h后觀察實驗結(jié)果。

1.8 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物抑菌機制初探

Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC、MBC值的測定：10 mL LB培養(yǎng)基中加入100 μL濃度為1×106CFU/mLS.aureus菌液，稀釋產(chǎn)物濃度梯度為0、2、4、6、8、10、11、12 mg/mL，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)。觀察各個梯度濃度下菌液的渾濁度，肉眼不可見渾濁的最低濃度即為MIC。取100 μL平板涂布后培養(yǎng)觀察記錄，每組設(shè)置3個平行。若該濃度下平板無菌落生長，則該濃度為MBC值。

S.aureus生長曲線及給藥前后胞外大分子物質(zhì)含量測定：將濃度為1×106CFU/mL菌液取100 μL加入10 mL LB培養(yǎng)基中，實驗組加入10 mg/mL Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，每2 h取樣，測量對照組、實驗組OD600 nm，繪制生長曲線。測定加入發(fā)酵產(chǎn)物對S.aureus細胞膜完整性的影響：核酸與蛋白質(zhì)在OD260 nm和OD280 nm下有最大吸收值，因此在0～18 h內(nèi)檢測在該波長下的紫外吸光值可以估測胞外核酸和蛋白含量變化[19]。

掃描電子顯微鏡檢測Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物對S.aureus形態(tài)的影響。收集生長至對數(shù)期的S.aureus細胞用3%戊二醛懸浮固定細菌，用無菌水漂洗2次，用梯度濃度乙醇脫水處理樣品。最后加入100%酒精重懸后，離子濺射噴鍍后電鏡下觀察[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

實驗從黃連中分離到94株內(nèi)生真菌，經(jīng)純化去重后得到14株黃連內(nèi)生真菌，以分離植株拉丁名和分離部位進行編號如下表1。根狀莖部位內(nèi)生真菌定殖率是27.8%，莖部位內(nèi)生真菌定殖率是56.7%，葉部位內(nèi)生真菌定殖率是52.5%，須根部位內(nèi)生真菌定殖率是39.6%。

表1 黃連內(nèi)生真菌分離純化結(jié)果

純化后的黃連內(nèi)生真菌經(jīng)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定如圖1所示。提取真菌基因組DNA后擴增ITS序列，將擴增成功的PCR產(chǎn)物送樣測序(北京擎科生物科技有限公司)。繪制黃連內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。共鑒定菌株14株，來自5目、7科、11屬、11個種，同時將測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，得到相應(yīng)序列號。菌種鑒定結(jié)果如表2。

圖1 黃連內(nèi)生真菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài)圖Fig.1 Morphology and microscopic morphology of endophytes in C.chinensis注：A～N對應(yīng)菌種編號Cop R01～07、Cop S01～04、Cop L01、Cop FR01～02。A1～N1為菌種菌落，A2～N2為菌絲、孢子形態(tài)。Note:A-N correspond to Cop R01-07,Cop S01-04,Cop L01,Cop FR01-02.A1-N1 are fungal colonies,A2-N2 are mycelium and spore morphology.

圖2 基于ITS rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequences

表2 黃連內(nèi)生真菌ITS鑒定結(jié)果

2.2 內(nèi)生真菌抗菌性結(jié)果

黃連內(nèi)生真菌抗菌性結(jié)果如下表3所示。實驗結(jié)果表明所有黃連內(nèi)生真菌對S.aureus均具有抑菌作用，且Cop S01、Cop L01、Cop FR01對S.aureus有非常顯著的抑菌活性，它們的抑菌環(huán)大小超過了35 mm，他們分別屬于Cercosporasp.、Colletotrichumsp.、Colletotrichumsp.。

2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌結(jié)果

富集Cop S01、Cop L01、Cop FR01發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量分別為738.7、472.8、446.4 mg。紙片擴散法測得黃連內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)果如下圖3所示。Cop S01、Cop L01、Cop FR01均對S.aureus有顯著抑菌作用，其中Cop L01抑菌效果極其顯著，抑菌圈超過20 mm。

表3 純化得到的14株黃連內(nèi)生真菌抗菌性結(jié)果

圖3 Cop S01、Cop L01、Cop FR01代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖Fig.3 Antibacterial effect of Cop S01,Cop L01 and Cop FR01 metabolites on S.aureus注：與空白對照組比較，**P < 0.01；****P < 0.000 1。Note:Compared with control,**P < 0.01;****P < 0.000 1.

2.4 Cop L01代謝產(chǎn)物抑菌機制初探

測定Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC、MBC值。培養(yǎng)18～24 h后，10 mg/mL濃度菌液澄清無渾濁，判定該濃度下Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物能夠極大程度地抑制S.aureus的生長，因此Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC值為10 mg/mL。如圖4所示，隨著給藥濃度不斷加大，平板上菌落數(shù)不斷減少，10 mg/mL濃度下平板上菌落數(shù)減少至可數(shù)，11 mg/mL和12 mg/mL濃度下平板上無菌落數(shù)，因此Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MBC值為11 mg/mL。

圖4 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC和MBC值測定Fig.4 Cop L01 fermentation product MIC and MBC value determination注：a～h分別對應(yīng)濃度0、2、4、6、8、10、11、12 mg/mL。Note:a-h correspond to concentrations of 0,2,4,6,8,10,11,12 mg/mL.

如圖5所示，Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物在MIC濃度下明顯抑制金黃色葡萄球菌生長，表現(xiàn)為加入發(fā)酵產(chǎn)物后即發(fā)揮抑菌作用。如圖6所示，隨著培養(yǎng)時間延長，OD260 nm和OD280 nm數(shù)值均較對照組有明顯升高，胞外蛋白及核酸含量均有上升。說明培養(yǎng)時間越長，金黃色葡萄球菌細胞壁細胞膜完整性受到影響，細胞內(nèi)容物逐漸外泄，引起胞外大分子含量上升。

圖5 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物與S.aureus生長曲線Fig.5 Cop L01 fermentation product and S.aureus growth curve

掃描電子顯微鏡結(jié)果如圖7示，對照組細菌形態(tài)完整，呈現(xiàn)葡萄串狀，表面光滑；加入MIC濃度Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物培養(yǎng)16～18 h后，金黃色葡萄球菌表面出現(xiàn)明顯粗糙，細胞間出現(xiàn)黏連，細胞凹陷破裂，細菌數(shù)量明顯減少，菌體形態(tài)較正常S.aureus有顯著變化。

圖6 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物對S.aureus核酸、蛋白泄漏的影響Fig.6 Effects of Cop L01 fermentation products on S.aureus nucleic acid and protein leakage注：a為核酸泄漏情況；b為蛋白質(zhì)泄漏情況。Note:a is nucleic acid leakage;b is protein leakage.

圖7 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC濃度培養(yǎng)對S.aureus細胞形態(tài)的影響Fig.7 The effect of MIC of Cop L01 fermentation product on S.aureus morphology注：a：正常生長S.aureus細胞形態(tài)；b：加入發(fā)酵產(chǎn)物培養(yǎng)后S.aureus細胞形態(tài),標尺4 μm。Note:a:Normal growth S.aureus cell morphology;b:S.aureus cell morphology after fermentation product.scale bar 4 μm.

3 結(jié)論

本研究從川黃連植株根狀莖、莖、葉和須根中分離得到14株內(nèi)生真菌，包括Paraboeremiasp.、Ilyonectriasp.、Clonostachyssp.、Volutellasp.、Fusariumavenaceum、Cylidrocladiellasp.、Cercosporasp.、Dendryphionnanum、Phomatosporabiseriata、Colletotrichumsp.、Didymellaceaesp.。除去文獻中已經(jīng)報道的Ilyonectria屬和Fusarium屬[9-12]，其余12株內(nèi)生真菌未見報道，因此本研究極大地豐富了四川地區(qū)黃連內(nèi)生真菌物種多樣性，為后期研究打下良好基礎(chǔ)。

黃連作為傳統(tǒng)中藥，對抗菌抗炎具有良好作用，但在內(nèi)生菌領(lǐng)域內(nèi)卻鮮有研究，本研究篩選出抑制S.aureus生長的黃連內(nèi)生真菌菌株Cop L01，屬于Colletotrichumsp.。對比國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，此類菌是常見的植物內(nèi)生菌，包括青蒿[21,22]、石斛[23]、紅豆杉[24]等植物中均有分離到。同時對于該種菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性研究已有不少成果，青蒿內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉均有抑菌效果[21]；黃荊內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.甲醇提取物對多重耐藥金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抗菌活性，MIC值為31 μg/mL[25]。綜上所述，本研究得到的菌株Cop L01值得更深入研究，有必要對Cop L01代謝產(chǎn)物成分的組成、相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)等做進一步研究，文獻中也報道出具有產(chǎn)小檗堿的黃連內(nèi)生真菌，可進一步探尋黃連內(nèi)生真菌是否能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，亦或是有新型活性物質(zhì)的出現(xiàn)。內(nèi)生真菌是天然活性物質(zhì)來源的一大寶庫，研究者應(yīng)全面深入地開發(fā)利用這一資源。