基于UPLC指紋圖譜及2種化學(xué)成分含量測定的月季花質(zhì)量分析

何民友，段志文，楊 潔，李振雨，官永河，魏 梅，孫冬梅，陳向東

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，佛山 528244

月季花為薔薇科植物月季RosachinensisqiaJacq.的干燥花，又名月月紅、勝雪、瘦客、斗雪紅、四季花、月貴花、艷雪花等，素有花中皇后之稱[1,2]。月季花始載于《本草綱目》，其味甘、性溫，歸肝經(jīng)，具活血調(diào)經(jīng)、疏肝解郁之功效，可用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、閉經(jīng)；瘀血腫痛、燙傷、跌打損傷、癰腫及瘰疬等[3,4]。全國均有種植，主產(chǎn)于云南、湖北、四川和甘肅，全年可采收[5]。月季花化學(xué)成分豐富多樣，包含黃酮類、鞣質(zhì)、酚酸類、揮發(fā)油、色素類和糖苷類化合物[6-8]。

近年來，有關(guān)月季花的研究取得一定進展，Wu等[9]基于UPLC-Q-Tof-MS技術(shù)，對玫瑰花和月季花非揮發(fā)性化學(xué)組分的差異進行研究，結(jié)果顯示玫瑰花共檢出43種化合物，月季花共檢出25種化合物，但其中檢出的月季花成分主要為酚苷、單寧、磷脂，檢出的黃酮類成分僅有山奈酚葡萄糖苷。據(jù)文獻研究報道，黃酮類為月季花的主要活性成分，Shangguan等[10]以不同采收時間的月季花為研究對象，測定不同采收期月季花總黃酮含量，并以其清除DPPH、羥基自由基的能力來評價抗氧化活性，探究其總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性，但未對不同產(chǎn)地的月季花總黃酮進行研究。目前對月季花的研究較多，但關(guān)于月季花質(zhì)量標準的研究鮮有報道。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷和異槲皮苷具有抗氧化應(yīng)激和細胞凋亡、抗急性肝損傷、抗炎、抗抑郁、血管保護等作用[11-13]，與月季花中疏肝解郁的功效相吻合，說明金絲桃苷和異槲皮苷為月季花的主要活性成分之一?！吨袊幍洹?020年版月季花含量測定項下僅采用等度洗脫方式對金絲桃苷和異槲皮苷的總量進行限定，此色譜條件下僅體現(xiàn)金絲桃苷和異槲皮苷的信息，但不能全面反映月季花的質(zhì)量，其他特征性成分如黃酮類、酚酸類成分的信息無法較全面地反映。指紋圖譜能較為全面地反映中藥所含化學(xué)成分，現(xiàn)已成為中藥質(zhì)量全面控制的一種重要手段[14]?；诖耍緦嶒灲⒃录净ǖ腢PLC指紋圖譜方法，并在指紋圖譜的條件下同時測定其黃酮類成分金絲桃苷和異槲皮苷的總量，以達到僅通過指紋圖譜的手段定性和定量控制月季花的目的，并結(jié)合聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地月季花進行評價，為月季花質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。此外，該方法同樣適用于同科屬植物玫瑰花的質(zhì)量標準，并能應(yīng)用于月季花與玫瑰花的鑒別研究。

1 材料和方法

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；XP 26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；Agilent SB C18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)色譜柱；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；KQ 500 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q-Direct型超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)。

1.2 試藥

月季花藥材來源于全國4個產(chǎn)地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為月季RosachinensisqiaJacq.的干燥花，玫瑰花藥材來源于全國3個產(chǎn)地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為玫瑰RosarugosaThunb.的干燥花，具體信息見表1。沒食子酸對照品(含量為90.80%，批號110831-201906)、鞣花酸對照品(含量為88.80%，批號111959-201903)、金絲桃苷對照品(含量為95.10%，批號111521-201708)、異槲皮苷對照品(含量為97.20%，批號111809-201804)、槲皮苷對照品(含量為97.20%，批號111538-201606)、黃芩苷對照品(含量為93.30%，批號110725-201318)、槲皮素對照品(含量為99.1%，批號100081-201610)均購自中國食品藥品檢定研究院；萹蓄苷對照品(含量為99.18%，批號18062206)購自成都普菲德生物科技有限公司；紫云英苷對照品(含量≥98%，批號wkq17032404)購自四川省維克奇生物科技有限公司；阿福豆苷對照品(含量≥98%，批號ST11030105MG)購自上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司。磷酸、乙腈為色譜級、水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Agilent SB C18(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)為色譜柱；以乙腈為流動相A，0.2%磷酸為流動相B進行梯度洗脫，0～1 min，3% A；1～2 min，3%→10% A；2～8 min，10%→11% A；8～11 min，11%→15% A；11～14 min，15% A；14～16 min，15%→19% A；16～19 min，19% A；19～25 min，19%→40% A。流速為0.40 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為254 nm；進樣體積為2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 指紋圖譜對照品溶液的制備

取沒食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、黃芩苷、槲皮素、萹蓄苷、紫云英苷、阿福豆苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL分別含沒食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、黃芩苷、槲皮素、萹蓄苷、紫云英苷、阿福豆苷30.908、51.451、21.398、20.004、10.128、5.337、10.207、10.156、5.390、5.037 μg的混合對照品溶液。

表1 樣品來源信息

2.2.2 含量測定對照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷和異槲皮苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含金絲桃苷210.551 μg、異槲皮苷211.021 μg的混合對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

取月季花藥材粉末(過四號篩)適量，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗

取同一供試品溶液(S1)，按“2.1”項色譜條件下重復(fù)進樣6次，以金絲桃苷為參照峰，計算30個共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于5%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(S1)，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進樣分析。以金絲桃苷為參照峰，計算30個共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于5%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗

取月季花藥材粉末(S1)6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。以金絲桃苷為參照峰，計算30個共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于5%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 UPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

將15批月季花藥材樣品(S1～S15)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件依次進樣測定，得到月季花指紋圖譜。將15批月季花藥材指紋圖譜的cdf文件導(dǎo)出并采用“中藥材色譜指紋圖譜相似度評價軟件”(2012版)進行指紋圖譜分析，共確定30個共有峰，結(jié)果見圖1，并產(chǎn)生對照指紋圖譜(見圖2)。15批月季花藥材色譜圖與對照指紋圖譜進行相似度評價，S1～S15相似度均大于0.95，結(jié)果見表2。

2.4.5 UPLC指紋圖譜共有峰的指認與歸屬

取月季花藥材粉末(S1)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下進樣分析，通過保留時間和UV紫外圖譜對比分析，指認10個色譜峰，其中1號峰為沒食子酸，13號峰為鞣花酸，14號峰為金絲桃苷，15號峰為異槲皮苷，18號峰為萹蓄苷，19號峰為紫云英苷，20號峰為槲皮苷，24號峰為阿福豆苷，25號峰為黃芩苷，26號峰為槲皮素，各對照品及月季花藥材樣品的UPLC色譜圖見圖3。

圖1 15批月季花藥材UPLC指紋圖譜疊加圖Fig.1 Superposition plot of UPLC fingerprints of 15 batches of RCF

圖2 15批月季花藥材UPLC指紋對照圖譜Fig.2 UPLC fingerprints of 15 batches of RCF

表2 月季花樣品指紋圖譜相似度評價

圖3 混合對照品(A)、月季花藥材樣品(B)的UPLC圖譜Fig.1 UPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and sample of RCF (B)注：1：沒食子酸；13：鞣花酸；14：金絲桃苷；15：異槲皮苷；18：萹蓄苷；19：紫云英苷；20：槲皮苷；24：阿福豆苷；25：黃芩苷；26：槲皮素。Note:1:Gallic acid;13:Ellagic acid;14:Hyperoside;15:Isoquercitrin;18:Avicularin;19:Astragalin;20:Quercitrin;24:Afzelin;25:Baicalin;26:Quercetin.

2.4.6 月季花樣品聚類分析

采用SPSS 20.0軟件對15批月季花樣品進行系統(tǒng)聚類(見圖4)。結(jié)果表明，當聚類距離為10，聚類分析將月季花樣品分為5類，Ⅰ類包括S3、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14；即山東省樣品與1批河北安國市樣品聚為一類；Ⅱ類包括S4、S5、S6，即河南省周口市樣品聚為一類；Ⅲ類包括S1；Ⅳ類包括S2；Ⅴ類包括S15。從聚類分析結(jié)果可知，不同產(chǎn)地月季花具有一定差異，同一產(chǎn)地月季花質(zhì)量大體相近。

圖4 聚類分析結(jié)果Fig.4 Result of cluster analysis

2.4.7 月季花樣品主成分分析

將15批月季花藥材樣品各共有峰的峰面積進行PCA分析，模型提取的2個主成分累積方差貢獻率R2X達到0.754(顯著大于0.5)，表明該模型擬合程度和穩(wěn)定性較好，能反映各產(chǎn)地月季花指紋圖譜的主要信息(見圖5)。經(jīng)PCA-X模型分析分別生成得分圖和載荷圖(見圖6、7)。PCA分析可進一步體現(xiàn)月季花化學(xué)成分差異的整體特征，密切聚在一起的批次表明其化學(xué)成分相近。從得分散點圖可知，PCA-X模型中所有數(shù)據(jù)點均在95%置信區(qū)間內(nèi)，聚類良好，區(qū)分明顯，說明不同產(chǎn)地的月季花樣品在化學(xué)成分及含量上存在一定差異，同一產(chǎn)地的樣品相似度高，具有趨勢性。PCA-X載荷散點圖中的每一個點代表1個共有峰，載荷所代表的點垂直投影到X軸，離原點的距離越遠則權(quán)重值越大，對樣品質(zhì)量的影響就越大。由PCA-X載荷散點圖可知，影響力較大的色譜峰為1號(沒食子酸)、2號、3號、12號、13號(鞣花酸)。

圖5 前2個主成分對方差的貢獻度Fig.5 Contribution for variation by first two principal components

圖6 PCA-X得分散點圖Fig.6 PCA-X score plot

圖7 PCA-X 載荷散點圖Fig.7 PCA-X loading plot

圖8 對照品(A)、月季花藥材樣品(B)的UPLC色譜圖Fig.8 UPLC chromatograms of mixed reference substances(A) and sample of RCF(B)注：1：金絲桃苷；2：異槲皮苷。Note:1:Hyperoside;2:Isoquercitrin.

2.5 2個黃酮醇苷類化學(xué)成分含量測定

2.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

取月季花藥材(S1)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定月季花藥材中金絲桃苷和異槲皮苷的含量，色譜圖見圖8。

2.5.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取金絲桃苷和異槲皮苷對照品貯備液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，同對照品貯備液分別按照“2.1”項下色譜條件一次進樣2 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，得回歸方程分別為金絲桃苷Y=12 054.258X+1 191.667，r=1.000，表明在4.211～84.224 μg/mL范圍內(nèi)金絲桃苷濃度與峰面積線性關(guān)系良好；異槲皮苷線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為Y=13 173.139X+1 149.773，r=1.000，表明在4.220～84.408 μg/mL范圍內(nèi)異槲皮苷濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗

精密吸取金絲桃苷和異槲皮苷混合對照品溶液2 μL，按照“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，計算得到金絲桃苷峰面積的RSD為0.15%，異槲皮苷峰面積的RSD為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗

取月季花藥材粉末(S1)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進樣測定，記錄峰面積，計算得到金絲桃苷峰面積的RSD為1.01%，異槲皮苷峰面積的RSD為0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗

取月季花藥材粉末(S1)約1.0 g，精密稱定，平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣，記錄峰面積，計算得到金絲桃含量的RSD值為1.35%；異槲皮苷含量的RSD值為0.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗

取月季花藥材粉末(S1)約0.5 g，精密稱定，平行9份，分為3組，分別按照1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入金絲桃苷和異槲皮苷對照品，照“2.3”項下方法，制備供試品溶液。每份精密吸取2 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，并計算金絲桃苷和異槲皮苷的加樣回收率。結(jié)果顯示，金絲桃苷的平均回收率為98.02%，RSD為2.11%；異槲皮苷的平均回收率為96.48%，RSD為1.56%。表明回收率良好。

2.5.7 樣品測定

按“2.3”項下方法制備15批月季花供試品溶液(平行3份)，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品中金絲桃苷和異槲皮苷的含量，結(jié)果見表3。從15批月季花樣品測定數(shù)據(jù)可知，金絲桃苷含量的SD值為0.17，說明該成分在不同產(chǎn)地不同批次間差異不大；15批月季花樣品中異槲皮苷含量的SD值為1.79，說明該成分在不同產(chǎn)地間差異較大。

表3 月季花藥材中金絲桃苷和異槲皮苷含量測定結(jié)果(n=3)

2.6 與玫瑰花藥材指紋圖譜對比研究

2.6.1 玫瑰花藥材共有峰的確定

取15批玫瑰花藥材樣品(R1～R15)，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得到玫瑰花指紋圖譜。將15批玫瑰花藥材指紋圖譜的cdf文件導(dǎo)出并采用“中藥材色譜指紋圖譜相似度評價軟件”(2012版)進行指紋圖譜分析，共確定22個共有峰，結(jié)果見圖9，并產(chǎn)生對照指紋圖譜(見圖10)。15批玫瑰花藥材與對照指紋圖譜進行相似度評價，R1～R15相似度均大于0.95。

圖9 15批玫瑰花藥材UPLC指紋圖譜疊加圖Fig.9 Superposition plot of UPLC fingerprints of 15 batches of RRF

圖10 15批玫瑰花藥材UPLC對照指紋圖譜Fig.10 UPLC reference fingerprint of 15 batches of RRF

2.6.2 月季花與玫瑰花的UPLC指紋圖譜比較

分別將15批月季花藥材指紋圖譜和15批玫瑰花藥材指紋圖譜采用“中藥材色譜指紋圖譜相似度評價軟件”(2012版)分析，得到指紋圖譜，并對月季花指紋圖譜和玫瑰花指紋圖譜進行對比(見圖11)；由對比圖可知，月季花和玫瑰花在指紋圖譜上差異明顯，其中峰1、4、6～10、16～18、21、23、35～37共15個色譜峰為共有成分，另外峰25～峰34為月季花的專屬成分，而峰12～峰15、峰24為玫瑰花的專屬成分，表明該色譜條件可用于月季花和玫瑰花的鑒別分析。

3 討論與結(jié)論

3.1 供試品制備方法與色譜條件確定

本實驗對提取溶劑、提取方式、提取時間及料液比進行考察，以色譜法信息量最大化，提取效率最佳，方法穩(wěn)定作為指標，最終確定以50%甲醇作為提取溶劑，超聲處理30 min，料液比選擇1.0 g∶50 mL作為樣品的制備方法。在色譜條件方面，考察了不同色譜柱、流動相體系、柱溫、流速及檢測波長。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，選擇色譜柱為Agilent SB C18，流動相為乙腈-0.2%磷酸，色譜柱溫度為35 ℃，流速為0.4 mL/min，色譜峰的峰型與分離度較好；將供試品溶液于190～400 nm下進行紫外可見光處全波長掃描，結(jié)果顯示254 nm下指紋圖譜的各共有峰響應(yīng)值高且峰型佳，且金絲桃苷和異槲皮苷在254 nm處有最大吸收，故選擇254 nm為檢測波長。

圖11 月季花藥材(A)和玫瑰花藥材(B)UPLC指紋圖譜比較Fig.11 Comparison of UPLC chromatograms between RCF(A) and RRF(B)

3.2 指紋圖譜及含量測定結(jié)果分析

本研究采用“中藥材色譜指紋圖譜相似度評價軟件”(2012版)對15批月季花藥材的指紋圖譜進行相似度分析，共檢出30個共有峰，且15批樣品的指紋圖譜相似度均大于0.95，表明不同批次的月季花化學(xué)成分具有一致性。通過對照品比對共指認10個特征峰，其中8個為黃酮類成分。運用聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地的月季花指紋圖譜進行分析，當聚類距離為10，不同批次的月季花可分為5類，表明不同產(chǎn)地的月季花具有一定差異性。通過PCA分析表明不同產(chǎn)地的月季花質(zhì)量有一定差異。通過對金絲桃苷和異槲皮苷進行含量測定，15批月季花金絲桃苷和異槲皮苷總含量為3.88 ～ 8.67 mg/g，15批藥材總含量均高于藥典規(guī)定值0.38%，表明15批月季花均為合格藥材，其中河南省周口市的金絲桃苷和異槲皮苷總含量最高。

所建立的指紋圖譜方法能應(yīng)用于玫瑰花的質(zhì)量評價，對15批玫瑰花藥材的指紋圖譜采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”(2012版)進行指紋圖譜分析，共確定22個共有峰，15批玫瑰花藥材指紋圖譜的相似度均大于0.95。月季花和玫瑰花同為薔薇科植物，二者在性狀、顯微和理化特征方面能區(qū)分開來[15-17]，但通過指紋圖譜鑒別未見報道，本研究通過建立的UPLC指紋圖譜可用于月季花與玫瑰花的鑒別，從指紋圖譜對比可知，二者具有15個共有成分，其中月季花具有10個專屬成分，玫瑰花具有5個專成分。

本研究在建立月季花UPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上，指認多個黃酮類成分，并采用化學(xué)模式識別法對其評價；建立金絲桃苷和異槲皮苷含量測定方法，為月季花的質(zhì)量控制提供依據(jù)。該方法簡便、準確，可為月季花的后續(xù)研究提供參考。