納布啡調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏

任 聰 劉海萍

1 佳木斯大學(xué)，黑龍江省佳木斯市 154000； 2 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科

瑞芬太尼是一種臨床常用麻醉藥，具有起效快、鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)及易蘇醒等特點，但臨床研究顯示長時間或大劑量使用容易誘發(fā)痛覺過敏[1-2]。因此防治瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏已成為目前的研究熱點。而納布啡是一種新型的受體激動劑及μ型阿片拮抗劑，常用于各類病理性疼痛的治療和超前輔助麻醉[3-4]。由于瑞芬太尼是一種μ型阿片受體激動劑，因此納布啡對瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏具有一定抑制作用[5]，但其分子層面的機(jī)制目前尚不明確。Wnt/β-catenin信號通路已被證實在痛覺過敏的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]，也是治療痛覺過敏的潛在治療靶點，但其是否是納布啡抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏機(jī)制尚未證實。本研究擬采用納布啡預(yù)處理切口痛大鼠模型，探討其對瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏的作用機(jī)制是否與Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 32只SPF級成年雄性SD大鼠，體重(200±30)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，許可證號：SYXK(黑)-2019-0001。注射用鹽酸瑞芬太尼和鹽酸納布啡(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)；N-甲基-D-天冬氨酸受體1(N-methyl D-aspartate receptor subunit1，NR1)、NR2A、NR2B、Wnt3a和β-catenin兔抗大鼠多克隆一抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 切口痛模型制備：大鼠經(jīng)七氟醚(3.5%誘導(dǎo)，3%保持)吸入麻醉后，右后足底碘伏消毒后參照Brennan[7]的方法制備切口痛模型：從近端0.5cm處向趾端行長約1cm的切口，切開皮膚和筋膜后，挑起足底肌肉并縱向切割，保持其起止附著點的完整。紗布按壓止血后，用5-0尼龍絲線縫合皮膚，切口覆蓋金霉素軟膏抗感染。

1.2.2 動物分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為對照組(S組)、切口痛模型組(I組)、瑞芬太尼+切口痛模型組(R+I組)和納布啡+瑞芬太尼+切口痛模型組(N+R+I組)，每組8只。其中R+I組和N+R+I組在造模前靜脈輸注瑞芬太尼1.0μg/ (kg·min)，S組和I組輸注同體積生理鹽水。輸注5min后對I組、R+I組及N+R+I組建立切口痛模型；而S組只進(jìn)行七氟醚麻醉和右后足底碘伏消毒及覆蓋金霉素，但不行切口手術(shù)。N+R+I組在瑞芬太尼輸注前3min 靜脈注射納布啡0.6mg/kg，其他組注射同體積的生理鹽水。

1.2.3 痛覺行為學(xué)的檢測：分別于造模前24h(T0)和造模后2h、6h、24h、48h(T1～4)進(jìn)行痛覺行為學(xué)測定。采用PL-200熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司)測定熱刺激縮爪反應(yīng)潛伏期(Paw withdrawal latency，PWL)，間隔10min測量3次取平均值。使用von Frey電子測痛儀(ALMEMO 2390-5，AHLBORN)檢測機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值(Paw withdrawal threshold，PWT)，間隔10min測量3次取平均值。

1.2.4 ELISA檢測炎性因子水平: 最后1次行為學(xué)檢測后，在麻醉狀態(tài)下頸椎脫臼處死大鼠，迅速取左側(cè)L4～6脊髓背角組織，保存于-80℃批量檢測。取脊髓組織制成勻漿液，按ELISA試劑盒說明檢測組織中TNF-α和IL-1β的水平，同時BCA法檢測組織中蛋白濃度，以計算每克蛋白中所含因子含量。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平：取組織標(biāo)本加入一定比例的蛋白裂解液，研磨成勻漿后4℃離心10min 取上清液，并采用BCA法檢測蛋白濃度。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，加入兔抗大鼠一抗(NR1、NR2A、NR2B、Wnt3a、β-catenin及β-actin)，4℃孵育過夜，然后加入羊抗兔二抗，室溫孵育1h，化學(xué)發(fā)光顯影后采用Image J 計算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值(以β-actin為內(nèi)參)，即目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各時間點痛覺行為學(xué)指標(biāo)比較 各組大鼠T0時PWL和PWT值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與S組比較，I組、R+I組和N+R+I組T1～T4時PWL和PWT值均明顯降低(P<0.05)；與I組比較，R+I組T1～T4 時PWL和PWT值均明顯降低(P<0.05)；與R+I組比較，N+R+I組T2～T4時PWL值和PWT值均明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠不同時間點PWL值及PWT值比較

2.2 納布啡對脊髓組織炎性因子的影響 與S組比較，I組、R+I組和N+R+I組TNF-α和IL-1β水平均明顯升高(P<0.05)；與I組比較，R+I組TNF-α和IL-1β水平均明顯升高(P<0.05)；與R+I比較，N+R+I組TNF-α和IL-1β水平均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠脊髓組織TNF-α和IL-1β水平比較

2.3 納布啡對脊髓組織NMDA受體蛋白表達(dá)的影響 與S組比較，I組、R+I組和N+R+I組NR1和NR2B蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與I組比較，R+I組NR1和NR2B蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與R+I比較，N+R+I組NR1和NR2B蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠NMDA受體蛋白表達(dá)水平比較

2.4 納布啡對Wnt/β-catenin通路的影響 與S組比較，I組、R+I組和N+R+I組Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與I組比較，R+I組Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與R+I比較，N+R+I組Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

瑞芬太尼是選擇性μ型阿片受體激動劑，有呼吸抑制作用弱、鎮(zhèn)痛效應(yīng)強(qiáng)、血流動力學(xué)平穩(wěn)及半衰期短等優(yōu)點，在臨床麻醉中已得到廣泛應(yīng)用，但誘發(fā)痛覺過敏率較高[8]。痛覺過敏不僅導(dǎo)致全麻蘇醒期躁動，也能降低術(shù)后阿片類藥物的鎮(zhèn)痛效果甚至影響預(yù)后，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效防治措施[9]，因此有效預(yù)防、治療瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏反應(yīng)已成為目前研究的熱點。納布啡是一種新型混合型阿片受體激動—拮抗鎮(zhèn)痛藥，不僅可用于術(shù)前鎮(zhèn)痛，也已廣泛用于各種病理性疼痛的治療[10-11]。邢娜等[12]研究發(fā)現(xiàn)靜脈預(yù)注射納布啡可有效緩解內(nèi)鏡下食管靜脈曲張?zhí)自委熁颊叩男g(shù)后疼痛，且不良反應(yīng)發(fā)生率顯著降低。此外，多項臨床及基礎(chǔ)研究也顯示納布啡可有效預(yù)防瑞芬太尼誘發(fā)的術(shù)后痛覺過敏，并可輔助增強(qiáng)鎮(zhèn)靜效果，避免麻醉恢復(fù)期出現(xiàn)躁動，減少不良反應(yīng)，提高患者疼痛耐受性[13-14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，瑞芬太尼誘導(dǎo)的切口痛模型大鼠術(shù)后PWL和PWT值均顯著降低，提示大鼠痛覺閾值降低即誘發(fā)了痛覺過敏；而納布啡預(yù)處理大鼠術(shù)后6～48h的PWL和PWT值均明顯高于未行納布啡處理大鼠，提示納布啡對瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏有一定抑制作用，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[15]。

已有證據(jù)顯示神經(jīng)炎癥和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體的激活也是痛覺過敏發(fā)生的必經(jīng)機(jī)制之一。有證據(jù)顯示長期大劑量使用瑞芬太尼后突然撤離，會對μ受體效應(yīng)形成抑制，并釋放大量興奮性氨基酸、誘導(dǎo)NMDA受體活化，對炎性因子的分泌起到促進(jìn)作用，增加神經(jīng)細(xì)胞的敏感性，導(dǎo)致患者術(shù)后出現(xiàn)痛覺過敏[5,16]。同時有證據(jù)顯示抑制NMDA受體活性、降低炎癥因子水平，也是改善痛覺過敏的主要手段[17-18]。本研究結(jié)果顯示，納布啡預(yù)處理痛覺過敏大鼠的脊髓組織TNF-α、IL-1β水平及NR1、NR2B蛋白含量明顯低于痛覺過敏大鼠，提示納布啡可能通過抑制NMDA受體活化，降低促炎性細(xì)胞因子水平，從而抑制痛覺過敏的發(fā)生。

Wnt/β-catenin信號通路是經(jīng)典Wnt信號通路，它參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，同時也參與維持成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路是介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和維持的關(guān)鍵靶點[20-21]。瑞芬太尼引起的痛覺過敏機(jī)制與神經(jīng)病理性疼痛類似，有證據(jù)顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路的激活對瑞芬太尼痛覺過敏具有促進(jìn)作用，抑制Wnt/β-catenin信號通路可以有效預(yù)防痛覺過敏[6,22]。本研究結(jié)果顯示，納布啡預(yù)處理的切口痛模型大鼠Wnt3和β-catenin水平明顯低于未進(jìn)行納布啡處理的大鼠，提示納布啡可能抑制了Wnt3/β-catenin信號通路的激活，從而抑制痛覺過敏的發(fā)生。以往研究發(fā)現(xiàn)Wnt通路的激活可以刺激IL-1β和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)NMDA受體NR2B亞基的活性，調(diào)節(jié)β-catenin旁路中的鈣離子依賴信號；而Wnt抑制劑能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞β-catenin的表達(dá)，減少脊髓背角細(xì)胞NR2R亞基的磷酸化[17,23]。因此推測納布啡抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏，可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，降低NMDA受體NR2B亞基的活性及炎癥反應(yīng)進(jìn)行的。

綜上所述，納布啡可以預(yù)防痛覺過敏的發(fā)生，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號通路的抑制，以及進(jìn)一步的神經(jīng)炎癥、NMDA受體激活抑制有關(guān)。