軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤穿刺標(biāo)本免疫組化H3F3B、IMP3、Clusterin 聯(lián)合H3F3B 基因突變檢測的意義

徐園園，毛榮軍，曾 敏，陳增偉，韓福蘭，吳燕杏，謝 樂，黃穎欣

（佛山市中醫(yī)院病理科，廣東 佛山 528000）

軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤（chondroblastoma-like osteosarcoma）與軟骨母細胞瘤（chondroblastoma）組織形態(tài)學(xué)具有相似性，兩者間的組織學(xué)鑒別要點在于軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤有腫瘤性骨樣組織區(qū)域，細胞異型性更明顯[1-3]。隨著骨腫瘤診治技術(shù)及水平的進步，骨腫瘤術(shù)前多行穿刺組織病理學(xué)活檢，穿刺組織的局限性以及骨腫瘤不同區(qū)域的異質(zhì)性均給骨腫瘤的病理學(xué)診斷帶來不小挑戰(zhàn)，當(dāng)穿刺標(biāo)本只有軟骨母細胞瘤樣區(qū)域且臨床及影像學(xué)特點均不明顯時，容易誤診為軟骨母細胞瘤[2-6]。目前尚未發(fā)現(xiàn)軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤有特異且高度敏感的免疫標(biāo)記物或明確的基因改變，如何鑒別兩者仍有待研究?；诖?，本研究擬通過免疫組織化學(xué)方法聯(lián)合檢測H3F3B、IMP3 及Clusterin 的表達情況，對其中H3F3B 陽性的軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤行H3F3B基因突變檢測，探討其在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤和軟骨母細胞瘤穿刺標(biāo)本診斷及鑒別診斷中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集佛山市中醫(yī)院病理科2008 年1 月-2020 年12 月確診的軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤22 例、軟骨母細胞瘤25 例，所有標(biāo)本均為術(shù)前穿刺標(biāo)本及其對應(yīng)的手術(shù)切除標(biāo)本，所有病理組織學(xué)切片均由兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)閱，與影像學(xué)及臨床三結(jié)合均診斷意見一致。

1.2 方法 所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，需要脫鈣處理的部分用溫和脫鈣液脫鈣，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，4～5 μm 連續(xù)切片，HE 染色，選取典型病變區(qū)域，采用SP 兩步法分別進行H3F3B（兔抗人組蛋白H3K36M 單克隆抗體，克隆號RM193，1∶100稀釋）、IMP3（胰島素樣生長因子II mRNA 結(jié)合蛋白3，即用型）及Clusterin（載脂蛋白J，兔單克隆抗體，克隆號EP181，即用型）免疫組織化學(xué)染色，所有抗體及試劑盒均購自上海杰浩生物技術(shù)有限公司。對免疫組化H3F3B 陽性的軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤標(biāo)本行H3F3B 基因突變檢測。基因突變檢測交由上海生工生物工程公司進行Sanger 測序。

1.3 結(jié)果判斷 陽性部位：H3F3B：胞核；IMP3：胞質(zhì)；Clusterin：胞質(zhì)。陽性判定標(biāo)準：＞90%中等以上強度著色為（+++），11%～90%中等以上強度著色為（++），1%～10%弱至中等強度著色為（+），＜1%著色為（-）。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點 22 例軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤患者中男15 例，女7 例，年齡14～29 歲，平均年齡21.32歲；影像學(xué)19 例均有骨質(zhì)破壞，其中6 例有軟組織腫塊并考慮惡性腫瘤，骨肉瘤與軟骨肉瘤鑒別；另外3 例傾向軟骨母細胞瘤。25 例軟骨母細胞瘤患者中男18 例，女7 例，年齡12～21 歲，平均年齡16.24歲；影像學(xué)可見膨脹性改變，未見軟組織腫塊，考慮軟骨母細胞瘤，所有病變均位于骨或骨關(guān)節(jié)。

2.2 免疫組化結(jié)果 手術(shù)切除標(biāo)本中，軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤選取軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（圖1）及腫瘤性骨樣組織區(qū)域（圖2）。免疫組化顯示，IMP3 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤中的軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（圖3）及腫瘤性骨樣組織區(qū)域（圖4）均呈彌漫陽性，在軟骨母細胞瘤均呈陰性；H3F3B 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤中僅1 例的軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（圖5）呈彌漫陽性，而在腫瘤性骨樣組織區(qū)域呈陰性；其余21 例軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（圖6）及腫瘤性骨樣組織區(qū)域（圖7）均呈陰性或散在弱陽性。H3F3B 在25 例軟骨母細胞瘤均呈彌漫陽性（圖8）。Clusterin 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤兩種區(qū)域及軟骨母細胞瘤中均灶狀陽性或陰性，見表1。所有病例的多核巨細胞均不表達H3F3B、IMP3 及Clusterin。

表1 IMP3、H3F3B 及Clusterin 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤及軟骨母細胞瘤中的表達（n）

圖1 軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（HE×200）

圖2 軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的腫瘤性骨樣組織區(qū)域（HE×200）

圖3 IMP3 在軟骨母細胞瘤樣區(qū)域彌漫陽性（IHC×200）

圖4 IMP3 在腫瘤性骨樣組織區(qū)域彌漫陽性（IHC×200）

圖5 H3F3B 在軟骨母細胞瘤樣區(qū)域彌漫陽性（IHC×200）

圖6 H3F3B 在軟骨母細胞瘤樣區(qū)域散在弱陽性（IHC×200）

圖7 H3F3B 在腫瘤性骨樣組織區(qū)域散在弱陽性（IHC×200）

圖8 H3F3B 在軟骨母細胞瘤彌漫陽性（IHC×200）

2.3 基因突變檢測結(jié)果 5 例軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤免疫組化H3F3B 有強弱不等的陽性，行H3F3B 基因突變檢測，均為陰性。

3 討論

軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤是普通型骨肉瘤的一種亞型，其發(fā)生部位、年齡、影像學(xué)特征符合骨肉瘤的特點，組織形態(tài)學(xué)具有軟骨母細胞瘤的部分特征，但其部分區(qū)域可觀察到腫瘤性骨樣組織，并有髓內(nèi)浸潤、骨皮質(zhì)侵蝕及軟組織腫塊的特點，可與軟骨母細胞瘤鑒別。部分病例臨床及影像學(xué)特點均不典型，即使在大標(biāo)本中有時也很難找到典型的腫瘤性骨樣組織區(qū)域，術(shù)前穿刺組織病理學(xué)活檢常常只能觀察到軟骨母細胞瘤樣區(qū)域，容易誤診為軟骨母細胞瘤[7-9]。

軟骨母細胞瘤的治療方法以病灶切除為主；軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤是惡性腫瘤，治療方法以手術(shù)切除及術(shù)前術(shù)后化療為主。骨肉瘤以往單純手術(shù)切除的5 年生存率在10%～20%，而臨床可切除的骨肉瘤聯(lián)合術(shù)前術(shù)后化療的5 年生存率＞50%，化療可以明顯改善患者的預(yù)后，接受了術(shù)前化療且有良好效應(yīng)的患者有可能實行保肢手術(shù)。骨肉瘤誤診或者漏診，可導(dǎo)致患者失去接受系統(tǒng)治療的機會，生存率大大降低。

既往的研究發(fā)現(xiàn)，IMP3 在胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、涎腺粘液表皮樣癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、骨肉瘤、黑色素瘤、間皮瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織中有表達[10-13]，與腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可通過上調(diào)IGF-II 蛋白的表達水平導(dǎo)致腫瘤細胞增生，通過調(diào)節(jié)多種細胞黏附因子使腫瘤細胞黏附，形成樹突狀偽足，產(chǎn)生侵襲作用[14-16]。本組實驗中，IMP3 在22 例軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤兩種區(qū)域均彌漫陽性，在25 例軟骨母細胞瘤均陰性，IMP3 彌漫陽性支持軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的診斷。

人組蛋白H3.3 的變體包括H3F3A（定位于1q42.12）及H3F3B（定位于17q25.1）兩個編碼基因，表達于細胞周期任何階段，在活性基因啟動子區(qū)、增強子區(qū)和內(nèi)部調(diào)節(jié)區(qū)等取代H3.1/H3.2[17]，通過表觀調(diào)節(jié)影響基因的表達，主要參與細胞增殖、分化、減數(shù)分裂等多個生物學(xué)過程[18]。既往文獻報道H3F3B是軟骨母細胞瘤敏感且特異的診斷標(biāo)記物[19]，在軟骨肉瘤中陰性表達[20]；約90%的軟骨母細胞瘤具有H3F3B 基因突變，尚未發(fā)現(xiàn)骨肉瘤具有特殊的基因改變。本研究22 例軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤中，18 例的H3F3B 均陰性，3 例散在弱陽性，僅1 例的軟骨母細胞瘤樣區(qū)域彌漫強陽性，但在腫瘤性骨樣組織區(qū)域陰性，提示腫瘤不同區(qū)域存在異質(zhì)性，容易誤診；而這些有陽性區(qū)域的病例未檢測出H3F3B 基因突變，提示免疫組化與基因檢測缺乏一致性。22 例中有3 例的影像學(xué)傾向軟骨母細胞瘤的診斷，穿刺標(biāo)本中有5 例僅見軟骨母細胞瘤樣區(qū)域，給診斷帶來更大難度。

Clusterin 是一種存在于多種細胞組分中具有多種存在形式、功能復(fù)雜多樣的蛋白，參與細胞內(nèi)外重要的生命活動，與神經(jīng)退行性疾病、免疫疾病、衰老、腫瘤等在內(nèi)的許多疾病相關(guān)[21]。本研究顯示，Clusterin 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤及軟骨母細胞瘤中均呈灶狀陽性或陰性，診斷應(yīng)用價值不大。

綜上所述，軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤及軟骨母細胞瘤組織形態(tài)學(xué)上有相似性，穿刺標(biāo)本中不易區(qū)分，對不典型的病例，單憑形態(tài)學(xué)診斷容易誤診，聯(lián)合檢測免疫組化IMP3 及H3F3B 對明確診斷有較大指導(dǎo)意義。在結(jié)合臨床、影像及病理形態(tài)學(xué)特點的基礎(chǔ)上，H3F3B 陰性、IMP3 彌漫陽性支持軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的診斷，H3F3B 彌漫陽性、IMP3 陰性支持軟骨母細胞瘤的診斷，H3F3B 陽性、IMP3 彌漫陽性更傾向于軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的診斷，即使在未檢見腫瘤性骨樣組織的穿刺標(biāo)本，H3F3B 陰性、IMP3 彌漫陽性時仍高度傾向軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的診斷，需結(jié)合臨床及影像學(xué)，避免誤診漏診。另外，病理診斷中需充分取材，尋找有無腫瘤性成骨，并結(jié)合臨床及影像學(xué)鑒別軟骨母細胞瘤與軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤。