流感樣病例中流感病毒陽(yáng)性檢出率的影響因素分析

韓捷思

（天津市薊州區(qū)疾病預(yù)防控制中心業(yè)務(wù)辦公室，天津 301900）

流感（influenza）是全球范圍內(nèi)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的呼吸道傳染病之一，由流感病毒侵襲所致，該病傳染性強(qiáng)，易形成暴發(fā)式擴(kuò)散，為國(guó)內(nèi)外公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了較大隱患[1]。在此背景下，流感監(jiān)測(cè)已成為我國(guó)重點(diǎn)開(kāi)展的傳染病監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，其檢測(cè)準(zhǔn)確性將直接影響到后續(xù)防疫方案的制定。因此，保證流感樣病例中流感病毒的陽(yáng)性檢出效果，是改善其疫情防控效果的重要前提[2，3]。但有報(bào)道顯示[4-6]，流感病毒的陽(yáng)性檢出率易受到多方面因素的影響，對(duì)此，本研究收集2018 年1 月-2020 年12 月采集的1815 份流感樣病例咽拭子樣本，對(duì)流感樣病例中流感病毒陽(yáng)性檢出率的相關(guān)影響因素進(jìn)行分析，旨在為該病的實(shí)驗(yàn)室診斷準(zhǔn)確性提升提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于全國(guó)流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中收集天津市薊州區(qū)疾病預(yù)防控制中心2018 年1 月-2020年12 月采集的1815 份流感樣病例咽拭子樣本，其中男948 例，女867 例；年齡1～89 歲，平均年齡（17.52±4.13）歲，所有樣本均采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）法完成核酸檢測(cè)，其檢測(cè)過(guò)程均在同一實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①受檢者均符合《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)方案（2010 年版）》[7]中流感樣病例定義（體溫≥38 ℃，且伴咳嗽、咽痛癥狀）；②病例檢測(cè)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)典型癥狀者；②未按標(biāo)準(zhǔn)采集者；③信息資料不全或有誤者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 于受檢者發(fā)病3 d 內(nèi)采集其流感樣病例標(biāo)本，采用專(zhuān)用病毒咽拭子棉簽，于咽后壁及兩側(cè)扁桃體部位進(jìn)行拭抹，避免觸及舌部，隨后迅速將棉簽置入外螺旋蓋采樣管中，采樣管內(nèi)提前注入保存液（5%牛血清維持液）3～5 ml，后續(xù)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，保存溫度＜4 ℃；超過(guò)48 h 不能送檢則置于-70 ℃環(huán)境下保存，所有樣本需在1 周內(nèi)完成送檢。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室接收樣本后，于3 d 內(nèi)完成檢測(cè)，采用Qiagen 核酸提取試劑盒（Rneasy mini kit，貨號(hào)：74104）進(jìn)行病毒RNA 提取，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)其病毒進(jìn)行基因分型檢測(cè)，儀器為ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司），酶試劑為One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Takara，Japan，貨號(hào)：RR064A）。分型結(jié)果包括甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria、Yamagata 型，該探針與引物均由天津市疾預(yù)控中心提供。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃條件下逆轉(zhuǎn)錄10 min，95 ℃條件下預(yù)熱10 min，95 ℃條件下變性15 s，60 ℃條件下擴(kuò)增45 s，于45 ℃檢測(cè)熒光值，共循環(huán)42 個(gè)，對(duì)其實(shí)時(shí)熒光進(jìn)行測(cè)定，以此繪制S 型擴(kuò)增曲線(xiàn)，當(dāng)CT 值小于40，結(jié)果判定陽(yáng)性。以上任一亞型病毒陽(yáng)性，既判定為流感病毒陽(yáng)性。

1.4 觀(guān)察指標(biāo) 分析流感樣病例咽拭子樣本的陽(yáng)性檢出結(jié)果、流感病毒陽(yáng)性檢出率的單因素及多因素危險(xiǎn)因素（性別、年齡、采樣時(shí)間、發(fā)病、采樣與送檢的時(shí)間間隔）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)，流感病毒陽(yáng)性檢出率的相關(guān)因素采用多因素Logistic 逐步回歸分析，P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流感樣病例咽拭子樣本的檢測(cè)結(jié)果 1815 份流感樣病例咽拭子樣本的檢測(cè)結(jié)果中，流感病毒陰性1578 份，流感病毒陽(yáng)性237 份，總陽(yáng)性率為13.06%，其中季節(jié)性H3型病毒90 份（5.70%）、新甲型H1流感病毒88 份（5.58%）、Yamagata 乙型流感病毒35 份（2.22%）、Victoria 病毒23 份（1.46%）、未分型1 份（0.06%）。

2.2 流感病毒陽(yáng)性檢出率的單因素分析

2.2.1 性別 不同性別流感樣病例的陽(yáng)性檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.151，P=0.697），見(jiàn)表1。

表1 不同性別流感樣病例的檢測(cè)結(jié)果比較[n（%）]

2.2.2 年齡 不同年齡段流感樣病例的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陽(yáng)性檢出率由高到低依次為15～35 歲、35 歲及以上、14 歲及以下，見(jiàn)表2。

表2 不同年齡流感樣病例的檢測(cè)結(jié)果比較[n（%）]

2.2.3 采樣時(shí)間 不同采樣時(shí)間樣本的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其陽(yáng)性檢出率由高到低依次為第一季度、第四季度、第二季度、第三季度，見(jiàn)表3。

表3 不同采樣時(shí)間樣本的檢測(cè)結(jié)果比較[n（%）]

2.2.4 發(fā)病、采樣與送檢的時(shí)間間隔 發(fā)病、采樣與送檢的時(shí)間間隔越短，病毒陽(yáng)性檢出率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 發(fā)病、采樣和送檢時(shí)間間隔與流感病毒陽(yáng)性檢出率的關(guān)系[n（%）]

2.3 流感病毒陽(yáng)性檢出率的多因素分析 以流感病毒陽(yáng)性檢出結(jié)果為應(yīng)變量（陽(yáng)性=1，陰性=0），結(jié)合上述單因素分析結(jié)果進(jìn)行多因素Logistic 逐步回歸分析，結(jié)果顯示，年齡、采樣時(shí)間、采樣至送檢時(shí)間為流感陽(yáng)性檢出的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 流感病毒陽(yáng)性檢出率相關(guān)因素的多元Logistic 逐步回歸分析

3 討論

流感通常發(fā)病突然，且傳染性強(qiáng)、傳播速度快、流行面積大，易導(dǎo)致局部疫情的產(chǎn)生，現(xiàn)已被我國(guó)列為丙類(lèi)法定傳染病，及時(shí)檢測(cè)、隔離與治療是控制該病傳播趨勢(shì)的重要方案[8，9]。目前，流感病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)多以實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法為主，可完整記錄PCR 過(guò)程中的每個(gè)循環(huán)數(shù)據(jù)，其檢測(cè)靈敏度及特異度均較高，且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，現(xiàn)已成為流感樣病例標(biāo)本的首選篩檢方法[10-12]。為了進(jìn)一步提高流感樣病例中流感病毒的陽(yáng)性檢出率，本研究基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)果對(duì)其陽(yáng)性率影響因素進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示1815 份流感樣病例咽拭子樣本的陽(yáng)性檢出率為13.06%，其中以新甲型H1流感病毒及季節(jié)性H3型病毒最為常見(jiàn)，分析原因?yàn)樾录仔虷1病毒及季節(jié)性H3型病毒均為近兩年優(yōu)勢(shì)毒株，因而陽(yáng)性檢出率相對(duì)較高這與天津地區(qū)流感疾病的流行特點(diǎn)一致。此外，經(jīng)單因素及多因素分析，年齡、采樣時(shí)間、采樣至送檢時(shí)間均是影響流感陽(yáng)性檢出的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具體分析如下：

3.1 年齡 本研究中不同年齡段流感樣病例的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其陽(yáng)性檢出率由高到低依次為15～35 歲年齡段、35 歲及以上年齡段、14 歲及以下年齡段，經(jīng)多因素Logistic 回歸分析顯示，年齡是流感陽(yáng)性檢出的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。分析認(rèn)為，年齡對(duì)流感病毒的表達(dá)存在一定影響，在兒童群體中，引起流感樣癥狀的致病因素相對(duì)較多。同時(shí)，由于年齡較小，其樣本采集也相對(duì)較為困難，咽拭子標(biāo)本不合格是導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率降低的重要原因[13，14]。此外，從本研究數(shù)據(jù)來(lái)看，35 歲及以上年齡段的陽(yáng)性檢出情況多集中在新甲型H1病毒，這是由于該病毒與我國(guó)甲型H1亞型流感病毒疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。故，我國(guó)人群既往免疫疫苗對(duì)新甲型H1N1流感可能無(wú)法提供有效保護(hù)，成人亦伴有一定的感染風(fēng)險(xiǎn)，與既往研究一致[15，16]。

3.2 采樣時(shí)間 本研究結(jié)果顯示，不同采樣時(shí)間樣本的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其陽(yáng)性檢出率由高到低依次為第一季度、第四季度、第二季度、第三季度，經(jīng)多因素Logistic 回歸分析，采樣時(shí)間為流感陽(yáng)性檢出的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），顯示這與流感的流行病學(xué)特征存在直接關(guān)聯(lián)，我國(guó)處于溫帶地區(qū)，流感大多發(fā)生于冬春季節(jié)，因而該階段的陽(yáng)性檢出率最高。劉靜等[17]報(bào)道顯示，2017 年天津地區(qū)哨點(diǎn)醫(yī)院流感高發(fā)季節(jié)為1～3 月份、11～12 月份，這與本研究結(jié)果相對(duì)應(yīng)。分析原因?yàn)槎杭竟?jié)溫度低、雨水少，空氣干燥，低溫、低濕可增加病毒的傳播效率，導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率的增高[18]。同時(shí)，流感病毒對(duì)溫度較為敏感，其環(huán)境溫度越高，病毒存活時(shí)間越短[19]。此外，夏秋季節(jié)光照強(qiáng)度相對(duì)較高，其陽(yáng)光中的紫外線(xiàn)對(duì)病毒具有較強(qiáng)的殺滅作用，可降低該病毒的陽(yáng)性檢出率[20]。門(mén)玉梅等[21]研究顯示，呼吸道病毒檢出率在不同季節(jié)分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中冬季呼吸道病毒檢出率最高，而后依次為春季、夏季與秋季，其病毒總檢出率與月平均氣溫及月降水量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。且據(jù)劉天等[22]研究顯示，流行季節(jié)是影響流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性率的主要因素。本研究與該研究結(jié)果相符，表明氣候與環(huán)境因素對(duì)病毒的流行具有重要的影響作用，其陽(yáng)性檢出率可隨著季節(jié)性高峰的到來(lái)而升高。

3.3 采樣至送檢時(shí)間 本研究中不同送檢時(shí)間樣本的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其間隔時(shí)間越短，陽(yáng)性檢出率越高，經(jīng)多因素Logistic回歸分析，采樣至送檢時(shí)間是流感陽(yáng)性檢出的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。在PCR 檢測(cè)中，其病毒分離的陽(yáng)性率取決于病毒存活強(qiáng)度，但隨著樣本放置時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞存活概率也逐漸下降，對(duì)其陽(yáng)性檢出率造成了較大影響[23]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)通常需進(jìn)行多次擴(kuò)增循環(huán)，以收集足夠數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)，進(jìn)而明確其CT 值，做到DNA 準(zhǔn)確定量。但實(shí)際工作中，由于檢測(cè)樣本數(shù)量較少或人員不足等原因，通常需集中一定數(shù)量的樣本后再行檢測(cè)，由此可引起采樣至送檢時(shí)間間隔的延長(zhǎng)，導(dǎo)致部分病毒失活，影響其檢測(cè)準(zhǔn)確性[24，25]。此外，拭子類(lèi)標(biāo)本大多具有采樣量少、易干等特點(diǎn)，若送檢間隔較長(zhǎng)，易導(dǎo)致細(xì)菌死亡，且樣本放置時(shí)間的延長(zhǎng)可引起一定的污染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)其檢驗(yàn)準(zhǔn)確性造成了較大影響[26，27]。表明病例標(biāo)本越早采集，其檢測(cè)陽(yáng)性率越高，及既往研究結(jié)果一致[28]。此外，據(jù)《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)方案(2010 年版)》要求，最佳送檢時(shí)間均保證在48 h 內(nèi)，其送檢越及時(shí)，陽(yáng)性檢出率越高。

綜上所述，流感樣病例的年齡、采樣時(shí)間、采樣至送檢時(shí)間可影響其流感陽(yáng)性檢出率，需充分考量其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響作用，以提高檢測(cè)陽(yáng)性率，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷。