玻尿酸合成酶的鯊魚源單域抗體篩選

束樹超, 徐明策, 哈承旭, 周宇杭, 鄧鵬輝, 查麗莎, 陳錦霖, 陳建明, 畢允晨

玻尿酸合成酶的鯊魚源單域抗體篩選

束樹超1, 2, 3, 徐明策1, 2, 3, 哈承旭4, 周宇杭5, 鄧鵬輝1, 2, 3, 查麗莎5, 陳錦霖6, 陳建明6, 畢允晨1, 2, 3

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所, 中國科學(xué)院暨山東省實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室, 山東 青島 266237; 4. 青島海洋科技館, 山東 青島 266003; 5. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 安徽 合肥 230036; 6. 閩江學(xué)院海洋研究院, 福建 福州 350108)

在鯊魚等軟骨魚類體內(nèi)存在天然的缺失輕鏈、僅包含重鏈的抗體, 源于這種重鏈抗體可變區(qū)的片段稱為單域抗體(single domain antibody)。目前單域抗體研究中的抗原主要來源于水溶性蛋白或病原體, 篩選膜蛋白鯊魚源單域抗體的領(lǐng)域接近空白。本研究以重組表達(dá)的小球藻病毒玻尿酸合成酶(一種膜蛋白)為抗原, 經(jīng)過免疫、建庫、淘選、驗證等步驟獲得了抗原特異性條紋斑竹鯊()單域抗體序列。隨后利用大腸桿菌表達(dá)了該單域抗體, 通過等溫滴定量熱技術(shù)(ITC)測定了其與抗原的親和力, 證實了以膜蛋白作為抗原制備鯊魚源單域抗體的可行性。

單域抗體; 納米抗體; 玻尿酸合成酶

傳統(tǒng)抗體是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的具有Y形結(jié)構(gòu)、能夠識別和結(jié)合抗原的蛋白質(zhì)。每條重鏈包含一個可變區(qū)(VH)和三個恒定區(qū)(CH1、CH2、CH3), 每條輕鏈包含一個可變區(qū)(VL)和一個恒定區(qū)(CL)[1](圖1)。其中, VH和VL結(jié)構(gòu)域共同發(fā)揮識別和結(jié)合抗原的作用。1993年, 科學(xué)家在羊駝等駱駝科物種體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了天然的缺失輕鏈, 僅由重鏈形成的抗體[2], 后來在鯊魚等軟骨魚綱動物中也發(fā)現(xiàn)了類似的輕鏈缺失型重鏈抗體(heavy chain only antibody)[3]。由于缺失輕鏈, 這種抗體中具有抗原識別與結(jié)合作用的只有重鏈可變區(qū)(如圖1, 在羊駝中稱為VHH, 在鯊魚中稱為VNAR)。在體外, 這種重鏈可變區(qū)能夠單獨重組表達(dá), 并發(fā)揮識別和結(jié)合抗原的作用[4], 稱為單域抗體, 也稱為納米抗體。

單域抗體具有由較長Loop柔性區(qū)域組成的抗原結(jié)合區(qū)[5], 能夠緊密結(jié)合到傳統(tǒng)抗體不易識別的抗原表位, 其分子質(zhì)量僅有13 kDa 左右, 大約為傳統(tǒng)抗體的十分之一, 且易于在大腸桿菌中大規(guī)模表達(dá)[6], 能夠顯著降低制備成本。同時, 相較于傳統(tǒng)抗體及其衍生物(如Fabs、scFvs), 單域抗體具有更好的溶解度和穩(wěn)定性[7]?；谝陨咸攸c, 單域抗體被廣泛應(yīng)用于疾病診療、生化檢測和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究等領(lǐng)域。在疾病診療方面, 用于治療血栓性血小板減少性紫癜癥的單域抗體藥物Cablivi?(caplacizumab-yhdp)已經(jīng)分別于2018年、2019年和2020年獲得了歐洲藥品管理局、美國食品和藥品管理局以及加拿大衛(wèi)生部的上市批準(zhǔn)[8-9]。用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10]、下呼吸道感染[11]、乳腺癌[12]和炎癥性腸病[13]等多種疾病的單域抗體藥物也相繼進(jìn)入了臨床試驗階段。另外, 由于其尺寸小, 易于代謝, 在醫(yī)學(xué)造影劑領(lǐng)域也發(fā)揮了重要作用[14]。在生化檢測方面, 特異性識別綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的單域抗體產(chǎn)品已經(jīng)上市, 能夠應(yīng)用于GFP融合蛋白的親和純化[15]。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方面, 單域抗體能夠穩(wěn)定并鎖定目的抗原蛋白的特定構(gòu)象, 有助于解決蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中關(guān)鍵的獲得單一構(gòu)象樣品的問題。同時, 在蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究中, 單域抗體本身可以作為潛在的晶體堆積界面, 提高抗原蛋白-單域抗體復(fù)合物的結(jié)晶幾率[16]。

圖1 傳統(tǒng)抗體、羊駝源重鏈抗體、鯊魚源重鏈抗體以及單域抗體的模式圖

注: VL為輕鏈可變區(qū), VH為重鏈可變區(qū), CL為輕鏈恒定區(qū), CH為重鏈可變區(qū), VHH為駝源單域抗體, VNAR為鯊魚源單域抗體

盡管羊駝源和鯊魚源單域抗體具有相似的理化性質(zhì), 但是受制于養(yǎng)殖條件等, 鯊魚源單域抗體的研究及應(yīng)用還非常少。目前鯊魚源單域抗體的研究主要集中在鉸口鯊、斑紋須鯊等[17-19], 如周文錦等人完成了白鰱肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶單域抗體免疫庫(鉸口鯊源)構(gòu)建及淘選[19], UBAH等人在鉸口鯊源免疫文庫中篩選了腫瘤壞死因子α(TNF-α)特異性的單域抗體[20]。這些鯊魚物種體型較大, 對養(yǎng)殖設(shè)施要求高且不易于實驗操作。另外, 在鯊魚源單域抗體抗原選擇方面, 主要以水溶性蛋白或病原物為抗原進(jìn)行鯊魚免疫并篩選制備單域抗體[21-22], 很少使用膜蛋白作為抗原, 而膜蛋白數(shù)量眾多, 并且在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用, 同時也是藥物開發(fā)的重要靶標(biāo)。因此, 膜蛋白抗原的鯊魚源單域抗體制備是領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點和難點。

玻尿酸, 又稱透明質(zhì)酸, 是定位于細(xì)胞外基質(zhì)的多糖, 在胚胎發(fā)育、傷口修復(fù)、細(xì)胞增殖和分化, 以及惡性腫瘤遷移等方面具有重要作用[23-25]。玻尿酸合成酶是一種具有多個跨膜區(qū)域的膜蛋白, 能夠利用胞內(nèi)的尿苷二磷酸-乙酰葡糖胺(UDP-NAG)和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GA)為底物合成玻尿酸并將其跨膜轉(zhuǎn)運到胞外發(fā)揮功能[26]。盡管玻尿酸合成酶的功能十分重要, 但其行使功能的分子機(jī)理研究在其被發(fā)現(xiàn)后的幾十年里一直沒有得到突破。本研究選用體型較小、更易于開展免疫等實驗操作步驟的條紋斑竹鯊, 以玻尿酸合成酶為抗原, 將其整合至脂質(zhì)體后進(jìn)行免疫, 篩選并體外重組表達(dá)、純化了鯊魚源單域抗體, 對其進(jìn)行了親和力測定并進(jìn)行了抗體結(jié)合對抗原活性影響實驗, 為進(jìn)一步的玻尿酸合成酶分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本研究主要包括玻尿酸合成酶的制備與前處理、單域抗體的篩選與體外重組表達(dá)純化、單域抗體親和力測定, 以及單域抗體結(jié)合對抗原活性影響的測定等步驟。

1.1 玻尿酸合成酶的表達(dá)純化

玻尿酸合成酶的表達(dá)純化步驟參考以往文獻(xiàn)[27], 略有修改。簡要來說, 將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌C43 (DE3)菌株接種至自誘導(dǎo)培養(yǎng)基, 37 ℃培養(yǎng)至OD600= 0.6～0.8時加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG), 30 ℃培養(yǎng)12～16 h; 高速離心(8 000 r/min, 10 min)收集細(xì)菌菌體并重懸[緩沖液為25 mmol/L嗎啉乙磺酸鈉鹽(MES)pH 6.5, 0.1 mol/L氯化鈉, 5 mmol/L β-巰基乙醇, 10%甘油, 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)]; 高壓破碎細(xì)菌后超速離心收集沉降的膜組分(42 000 r/min, 1 h), 將該膜組分與膜蛋白提取緩沖液于4 ℃混勻1 h[20 mmol/L磷酸緩沖液pH 7.5, 0.1 mol/L氯化鈉, 5 mmol/L β-巰基乙醇, 10%甘油, 1 mmol/L PMSF, 1%十二烷基-β-D-麥芽糖苷(n-dodecyl-β-d-maltopyranoside, DDM, anatrace), 0.05%膽固醇半琥珀酸酯(cholesteryl hemisuccinate tris salt, CHS, anatrace), 40 mmol/L 咪唑], 超速離心收集上層清液(42 000 r/min, 30 min); 將上清與Ni-NTA填料(in-vi--trogen)于4 ℃孵育1 h, 然后用洗滌緩沖液[25 mmol/L MES pH 6.5, 0.3 mol/L氯化鈉, 5 mmol/L β-巰基乙醇, 10%甘油, 60 mmol/L咪唑, 0.05%十二烷基麥芽糖乙戊二醇(lauryl maltose neopentyl glycol, LMNG, anatrace), 0.01% CHS]除去雜蛋白, 再用洗脫緩沖液(25 mmol/L MES pH 6.5, 0.3 mol/L氯化鈉, 5 mmol/L β-巰基乙醇, 10%甘油, 300 mmol/L咪唑, 0.05% LMNG, 0.01% CHS)洗脫得到目的蛋白。目的蛋白濃縮后, 使用緩沖液為25 mmol/L MES pH 6.5, 0.2 mol/L氯化鈉, 5 mmol/L β-巰基乙醇, 10%甘油的Superdex S200凝膠過濾柱(GE Healthcare)進(jìn)一步純化; 最終利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡實驗檢測目的蛋白純化結(jié)果。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗顯色方法為考馬斯亮藍(lán)染色, 免疫印跡實驗所用一抗為組氨酸標(biāo)簽特異性鼠源單抗(CST, 2366S), 所用二抗為HRP偶聯(lián)的鼠IgG特異性抗體(CST, 7076P2)。

1.2 玻尿酸合成酶活性檢測實驗

玻尿酸合成酶的活性檢測實驗參考以往文獻(xiàn)[26]。簡要來說, 取10 μL反應(yīng)緩沖液(40 mmol/L磷酸鈉緩沖液pH 7.2, 40 mmol/L氯化鎂, 10 mmol/L二硫蘇糖醇, 200 mmol/L氯化鈉, 10 mmol/L UDP-NAG, 10 mmol/L UDP-GA和0.2 μCi UDP-[3H]-NAG)與10 μL玻尿酸合成酶(1 mg/mL)混合, 于30 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h, 加入40 mmol/L EDTA終止反應(yīng)。通過紙層析法(展開液為65% 1 mol/L 醋酸銨pH 5.5, 35%乙醇)分離合成的玻尿酸多糖與未反應(yīng)的底物, 利用液閃儀(PerkinElmer Tri-Carb 4910 TR)對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。單域抗體結(jié)合對玻尿酸合成酶的活性影響實驗步驟同上, 區(qū)別在于將10 μL 玻尿酸合成酶更換為10 μL單域抗體與玻尿酸合成酶混合物(單域抗體和玻尿酸合成酶按照摩爾濃度比3∶1于4 ℃孵育3 h, 其中玻尿酸合成酶的終濃度為1 mg/mL)。

1.3 玻尿酸合成酶重組脂質(zhì)體實驗

制備去垢劑溶解的大腸桿菌全脂質(zhì)(total lipid, Avanti)溶液, 濃度為16 mg/mL, 將其與玻尿酸合成酶混合, 混合后玻尿酸合成酶濃度為1 mg/mL, 大腸桿菌全脂質(zhì)濃度為4 mg/mL, 混合物4 ℃孵育3 h后, 按照每毫升添加0.5 g的比例添加適量聚苯乙烯二乙烯基苯微球體(Biobeads, Bio-Rad), 4 ℃過夜混勻, 去除去垢劑分子。

1.4 鯊魚免疫

將50 μg玻尿酸合成酶抗原皮下注射條紋斑竹鯊, 隨后, 每間隔14 d皮下注射抗原一次, 以加強(qiáng)免疫反應(yīng), 共完成6次免疫過程。

1.5 抗體庫構(gòu)建

從條紋斑竹鯊脾臟組織, 分離取得淋巴細(xì)胞, 采用TRIzol法提取淋巴細(xì)胞總RNA, 根據(jù)條紋斑竹鯊VNAR區(qū)域保守序列設(shè)計引物, PCR、酶切后連入pMES4質(zhì)粒。采用電轉(zhuǎn)法將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2738菌株, 構(gòu)建得到單域抗體文庫。

1.6 單域抗體淘選

用包被液(0.05 mol/L pH 9.6碳酸鈉緩沖液)將玻尿酸合成酶稀釋為10 μg/mL后轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板, 4 ℃孵育過夜, 去除未結(jié)合的玻尿酸合成酶, 并用3%BSA封閉酶標(biāo)板待用。取單域抗體文庫接種于50 mL LB培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)至指數(shù)期后, 加入100 μL輔助噬菌體(M13KO7, 109pfu/mL), 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。離心(8 000 r/min, 3 min)后用2YT培養(yǎng)基(已提前加入100 μg/mL氨芐青霉素, 50 μg/mL卡那霉素)重懸細(xì)菌沉淀, 30 ℃過夜培養(yǎng), 離心(8 000 r/min, 5 min)收集上清, 加入10 mL聚乙二醇/氯化鈉沉淀噬菌體, 離心(5 000 r/min, 30 min)后用磷酸鈉緩沖液溶解噬菌體沉淀。取前述待用酶標(biāo)板, 加入上述噬菌體溶液, 孵育后洗去背景。用Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L pH 2.2)洗脫結(jié)合玻尿酸合成酶的噬菌體, 添加100 mL ER2738菌液(OD600=0.6), 靜置30 min后培養(yǎng)2～3 h, 完成第一輪淘選。用包被液將玻尿酸合成酶分別稀釋至5 μg/mL和2.5 μg/mL, 重復(fù)上述步驟, 完成第2、3輪淘選。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定實驗

將經(jīng)過3輪淘選后獲得的單域抗體文庫接種至具有氨芐青霉素抗性的固體培養(yǎng)基, 過夜培養(yǎng)后挑取100～200個單菌落分別轉(zhuǎn)接至500 μL 2YT培養(yǎng)基(已加入100 μg/mL 氨芐青霉素), 37 ℃ 200 r/min 培養(yǎng)4～5 h。加入1 μL 輔助噬菌體(109pfu/mL), 靜置15 min后, 離心棄去上清。沉淀部分用500 μL 2YT培養(yǎng)基(已提前加入100 μg/mL 氨芐青霉素, 50 μg/mL卡那霉素)重懸并30 ℃過夜培養(yǎng)。離心(8 000 r/min, 5 min)后的上清轉(zhuǎn)移至包被2.5 μg/mL 抗原的96孔酶標(biāo)板, 37 ℃孵育30 min 后洗去背景, 加入1∶10 000稀釋后的HRP偶聯(lián)的抗噬菌體抗體(義翹神舟, 11973-MM05T-H), 37 ℃孵育30 min, 洗去背景, 使用TMB顯色試劑盒檢測。步驟1.4～1.7為鯊魚源單域抗體篩選的主要流程(圖2)。

圖2 鯊魚源單域抗體篩選流程

1.8 單域抗體的表達(dá)純化

篩選得到的單域抗體序列用NdeⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點連入pCold Ⅱ質(zhì)粒, 并轉(zhuǎn)入大腸桿菌SHuffle?T7菌株中。使用2YT培養(yǎng)基, 37 ℃培養(yǎng)至指數(shù)期, 加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá), 25 ℃培養(yǎng)過夜。收集細(xì)菌菌體并重懸(緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl pH 7.8, 50 mmol/L 氯化鈉), 破碎細(xì)胞后高速離心(14 000 r/min, 30 min, 4 ℃), 取上清與Ni-NTA填料(Invitrogen)于4 ℃孵育1 h。分別用W1緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH7.8, 1 mol/L 氯化鈉, 20 mmol/L咪唑)、W2緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.8, 50 mmol/L氯化鈉, 40 mmol/L咪唑)洗脫雜蛋白, 然后用ELU緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.8, 50 mmol/L 氯化鈉, 300 mmol/L 咪唑)洗脫單域抗體, 并用緩沖液為25 mmol/L MES pH 6.5, 0.2 mol/L 氯化鈉, 10%甘油的Superdex S75 凝膠過濾柱(GE Healthcare)進(jìn)一步純化; 最終利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡實驗檢測目的蛋白純化結(jié)果。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗顯色方法為考馬斯亮藍(lán)染色, 免疫印跡實驗所用一抗為組氨酸標(biāo)簽特異性鼠源單抗(CST, 2366S), 所用二抗為HRP偶聯(lián)的鼠IgG特異性抗體(CST, 7076P2)。

1.9 等溫滴定量熱實驗

純化得到的玻尿酸合成酶和單域抗體分別置換到同批配制的ITC緩沖液中(25 mmol/L MES pH 6.5, 0.2 mol/L氯化鈉, 10%甘油, 2 mmol/L TCEP), 分別濃縮至終濃度為50 μmol/L(玻尿酸合成酶)和5.6 mmol/L (單域抗體)。在等溫滴定量熱(MicroCal PEAQ-ITC, Malvern Panalytical)設(shè)備中向含有玻尿酸合成酶的樣品池中滴加單域抗體, 共滴加19次, 第一次為0.4 μL, 其余每次均為2 μL。用MicroCal PEAQ-ITC 分析軟件處理實驗結(jié)果(實驗設(shè)置對照組, 對照組為向緩沖液中滴加單域抗體)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玻尿酸合成酶的制備與前處理

為提高單域抗體的特異性, 要求進(jìn)行鯊魚免疫的玻尿酸合成酶純度較高、狀態(tài)良好(有活性、無降解等)。分子排阻層析的純化圖譜顯示玻尿酸合成酶在11.5 mL處洗脫, 無雜峰, 說明純化的樣品狀態(tài)較均一(圖3a), 聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡實驗均呈現(xiàn)單一條帶, 說明樣品無聚集, 無降解, 純度高(圖3b、圖3c)。純化后的樣品在4 ℃靜置過夜后, 再次進(jìn)行分子排阻層析和聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗, 仍然僅有單一洗脫峰和單一條帶(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)), 進(jìn)一步說明樣品狀態(tài)良好。

圖3 玻尿酸合成酶的純化

注: 泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn), 泳道1為玻尿酸合成酶

紙層析法結(jié)合同位素檢測已被成功應(yīng)用于玻尿酸合成酶的活性檢測。玻尿酸合成酶能夠利用尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸和尿苷二磷酸-乙酰葡糖胺兩種底物合成玻尿酸。將玻尿酸合成酶與同位素標(biāo)記的尿苷二磷酸-乙酰葡糖胺, 以及其他底物混合孵育反應(yīng), 利用紙層析分離方法, 除去未反應(yīng)的小分子底物, 最終通過同位素分析方法檢測高分子量玻尿酸產(chǎn)物, 進(jìn)而檢測玻尿酸合成酶的活性。純化得到的玻尿酸合成酶樣品無論在去垢劑環(huán)境中還是重組至脂質(zhì)體中均具有活性, 而只有一種底物的對照實驗組沒有檢測到高分子量玻尿酸產(chǎn)物。玻尿酸酶是一種能夠特異性降解高分子量玻尿酸的酶分子, 當(dāng)加入兩種底物并用玻尿酸酶處理時, 同位素信號強(qiáng)度明顯降低, 證明生成的高分子產(chǎn)物為玻尿酸, 本研究中表達(dá)純化的玻尿酸合成酶具有活性。玻尿酸合成酶的活性較穩(wěn)定, 在去垢劑環(huán)境中, 4 ℃靜置一周后仍然具有活性(數(shù)據(jù)未展示)。

分子排阻層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡實驗結(jié)果以及活性測定結(jié)果互相驗證, 表明本研究中表達(dá)純化得到的玻尿酸合成酶適于進(jìn)一步開展鯊魚免疫反應(yīng)以獲得單域抗體。

2.2 單域抗體的篩選與體外重組表達(dá)純化

單域抗體的篩選及體外表達(dá)純化包括: 將制備的玻尿酸合成酶注射到鯊魚體內(nèi), 促使其產(chǎn)生免疫反應(yīng); 分離脾臟淋巴細(xì)胞, 提取總RNA, 構(gòu)建單域抗體庫; 利用三輪淘選, 淘選出親和力較高的單域抗體; 挑取100～200個單菌落用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢驗抗原抗體的結(jié)合(圖2), 獲得單域抗體的氨基酸序列信息。

在單域抗體體外重組表達(dá)中, 首先選用了相關(guān)研究中使用較多的pMES4質(zhì)粒, 將其轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3)菌種中。pMES4質(zhì)粒中, 單域抗體上游包含有pelB信號肽片段, 能夠引導(dǎo)單域抗體表達(dá)至氧化環(huán)境的細(xì)胞間質(zhì)中, 遺憾的是, 在此條件下單域抗體沒有得到表達(dá)。隨后, 選用pCold Ⅱ質(zhì)粒, 將其轉(zhuǎn)化至SHuffle?T7菌株, 單域抗體在胞質(zhì)內(nèi)獲得表達(dá), 且產(chǎn)量較高, 每升培養(yǎng)基能夠獲得約5 mg 單域抗體。同時, 后續(xù)的純化過程中, 分子排阻層析和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明純化得到的單域抗體純度很高, 狀態(tài)單一(圖4)。

圖4 單域抗體的純化

注: 泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn), 泳道1為單域抗體

2.3 單域抗體親和力檢測

等溫滴定量熱實驗通過測定抗體滴定抗原過程中的熱量變化檢測抗原與抗體的親和力。等溫滴定量熱實驗結(jié)果顯示(圖5), 抗原抗體化學(xué)計量數(shù)約為1, 說明單域抗體僅識別并結(jié)合1個抗原表位; 平衡解離常數(shù)(Kd)約為171 μmol/L, 比已報道的通過免疫篩選獲得的單域抗體親和力低, 這可能是由于選用的大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)體系, 其中的還原環(huán)境造成了表達(dá)的單域抗體與篩選時(氧化環(huán)境)得到的單域抗體在二硫鍵形成方面存在略微差異(詳見討論部分)。

2.4 單域抗體對玻尿酸合成酶活性的影響

將單域抗體與玻尿合成酶按照摩爾濃度比3∶1的比例混合, 檢測單域抗體的添加對玻尿酸合成酶活性的影響。圖6顯示添加單域抗體能夠提高玻尿酸合成酶的活性。

3 討論

在鯊魚源單域抗體的研究中, 主要是以水溶性蛋白作為研究對象[21-22], 較少以膜蛋白作為抗原。一方面是由于膜蛋白表達(dá)純化較難[28], 另一方面是因為單域抗體通常不能夠識別線性抗原[29], 所以需要保證膜蛋白抗原在免疫過程中保持天然構(gòu)象, 而鯊魚血液中存在幾百毫摩爾濃度的尿素[30], 對于膜蛋白抗原保持正確折疊造成一定影響。本研究采用了將膜蛋白重組至脂質(zhì)體中的方式, 一定程度上保證了抗原的天然構(gòu)象, 為膜蛋白鯊魚源單域抗體的制備提供了借鑒。本研究中選用玻尿酸合成酶作為抗原也是經(jīng)過考量的。玻尿酸合成酶的純化中使用了可與其高親和力結(jié)合的去垢劑分子, 在最后的分子排阻層析純化步驟中, 不需要添加去垢劑分子, 仍然可以得到具有活性的樣品[31]。在一般膜蛋白體系中, 分子排阻層析溶液中的去垢劑分子極有可能在后續(xù)的樣品濃縮過程中形成空的去垢劑膠束(micelle), 并進(jìn)而在ITC實驗中由于滴定后體積的變化, 造成去垢劑分子在膠束狀態(tài)和自由狀態(tài)平衡的移動, 引起熱量變化。因此, 玻尿酸合成酶這種特殊的膜蛋白體系能夠極大地減少ITC實驗的誤差。同時, 已經(jīng)建立的玻尿酸合成酶活性檢測方法能夠快速檢測單域抗體結(jié)合后抗原活性變化情況, 為抗原抗體相互作用研究提供了新方案。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其所發(fā)揮的功能, 在蛋白質(zhì)行使功能的不同狀態(tài), 其構(gòu)象往往會發(fā)生變化, 而單域抗體能夠結(jié)合抗原蛋白并穩(wěn)定特定構(gòu)象。例如, G蛋白偶聯(lián)受體有一系列功能狀態(tài), 單域抗體Nb80能夠?qū)⑷甩?腎上腺素受體的構(gòu)象穩(wěn)定在激活狀態(tài)[32]。本研究中, 單域抗體能夠提高玻尿酸合成酶的酶活力, 這可能是因為單域抗體的結(jié)合穩(wěn)定了玻尿酸合成酶的特定構(gòu)象, 這種構(gòu)象能夠促進(jìn)玻尿酸合成酶合成玻尿酸, 這也是單域抗體結(jié)合玻尿酸合成酶的間接證據(jù)。

圖5 基于等溫滴定量熱實驗的親和力測定

注: DP即power differential

圖6 玻尿酸合成酶活性實驗

注: 各組反應(yīng)條件分別為, 1: 單域抗體與玻尿酸合成酶混合樣品; 2: 僅玻尿酸合成酶樣品; 3: 在樣品2的基礎(chǔ)上添加玻尿酸酶; 4: 單一底物樣品

單域抗體作為已知天然存在的能夠結(jié)合抗原的最小蛋白抗體[33], 受到越來越多的關(guān)注。目前, 對羊駝源單域抗體的研究較多, 而對鯊魚源單域抗體研究較少[34]。這主要是受到養(yǎng)殖條件的限制, 并無證據(jù)表明鯊魚源單域抗體較羊駝源單域抗體有劣勢, 對鯊魚源單域抗體的研究能夠拓寬單域抗體的應(yīng)用范圍。但需要指出的是, 絕大部分羊駝源單域抗體只在框架區(qū)的結(jié)構(gòu)核心位置存在一對保守的半胱氨酸, 并形成二硫鍵[35]。鯊魚源單域抗體也存在這對保守的半胱氨酸, 除此之外, 多數(shù)鯊魚源單域抗體還存在其他非保守的半胱氨酸。根據(jù)非保守二硫鍵的數(shù)目和位置, 鯊魚源單域抗體被分為不同的類型[36]。本研究篩選出的單域抗體為Ⅱ型單域抗體, 在抗原結(jié)合位置的互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining regions, CDR)存在兩個半胱氨酸, 根據(jù)已知Ⅱ型單域抗體的結(jié)構(gòu)推測這兩個半胱氨酸也能夠形成二硫鍵, 并發(fā)揮穩(wěn)定抗原結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)的作用[37-38]。這對半胱氨酸位于蛋白表面位置, 極易受到表達(dá)純化和應(yīng)用條件的影響, 形成分子間二硫鍵, 由于處于抗原結(jié)合位置, 一旦形成分子間二硫鍵, 將極可能造成其與抗原結(jié)合能力的喪失。本研究中采用了大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá), 由于胞內(nèi)為還原環(huán)境, 因此, 位于蛋白表面的半胱氨酸將不會形成分子內(nèi)和分子間二硫鍵, 可能也由此造成了較低的抗原親和力(已報道的通過免疫篩選方式獲得的單域抗體與抗原的平衡解離常數(shù)一般為納摩量級[39-40])。因此, 通過表達(dá)條件優(yōu)化, 例如優(yōu)化大腸桿菌胞間質(zhì)表達(dá)條件或者選用真核表達(dá)系統(tǒng), 使鯊魚源單域抗體既能夠有效表達(dá)純化, 又能夠確保其具有較高的抗原結(jié)合能力, 將是影響鯊魚源單域抗體廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問題。同時, 以胞內(nèi)分子為靶標(biāo)的胞內(nèi)抗體技術(shù)發(fā)展迅速, 單域抗體由于其尺寸小, 在入胞效率方面遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)抗體, 具有成為胞內(nèi)抗體的獨特優(yōu)勢[41], 但胞內(nèi)環(huán)境具有高還原性, 鯊魚源單域抗體還需要經(jīng)過適當(dāng)改造, 將易受環(huán)境影響的二硫鍵替換為其他的共價鍵或非共價鍵形式, 以實現(xiàn)其在高還原環(huán)境中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和高抗原親和力。

4 結(jié)論

本研究篩選并制備獲得了小球藻病毒玻尿酸合成酶的鯊魚源單域抗體, 該抗體能夠一定程度上提高抗原的活性, 盡管由于抗體表達(dá)條件的影響, 抗體的二硫鍵可能沒有完全正確折疊并進(jìn)而造成了抗原抗體親和力較低的現(xiàn)象, 但是本研究證實了以膜蛋白為抗原制備鯊魚源單域抗體的可能性, 增加了鯊魚源單域抗體的抗原選擇范圍, 進(jìn)而拓展了鯊魚源單域抗體的應(yīng)用領(lǐng)域。

致謝: 感謝山東膠州灣海洋生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站在同位素測試中提供的設(shè)備支持。感謝趙宏鑫、王淏在項目進(jìn)展過程中的討論。

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Screening of shark-derived single domain antibodies for hyaluronan synthase

SHU Shu-chao1, 2, 3, XU Ming-ce1, 2, 3, HA Cheng-xu4, ZHOU Yu-hang5, DENG Peng-hui1, 2, 3, ZHA Li-sha5, CHEN Jin-lin6, CHEN Jian-ming6, BI Yun-chen1, 2, 3

(1. CAS and Shandong Province Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 4. Ocean Science and Technology Museum of Qingdao, Qingdao 266003, China; 5. Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 6. Institute of Oceanography Minjiang University, Fuzhou 350108, China)

The single domain antibody (sdAb) is derived from the variable fragment of the heavy-chain-only antibody, which has been found naturally in cartilaginous fishes, such as sharks. The sdAb research mainly arise from the soluble proteins and pathogens as the antigens to date. In this study, after the steps of immunogen preparation, immunization, repertoire cloning, library construction, selection and verificatione obtained the shark-derived sdAb, which specifically recognizeshyaluronan synthase (a membrane protein). The sdAb was then expressed inand purified for the binding affinity determination performed by Isothermal Titration Calorimetry technology (ITC). Overall, this study proves the practicability of generating shark-derived single-domain antibodies against membrane protein antigen.

single domain antibody; nanobody; hyaluronan synthase

Jan. 18, 2021

Q816

A

1000-3096(2022)08-0111-10

10.11759/hykx20210118001

2021-01-18;

2021-03-01

國家自然科學(xué)基金(41876168); 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室引進(jìn)人才支持計劃(YJ2019NO03); 中科院合肥大科學(xué)中心高端用戶培育基金(2020HSC-UE018)

[National Natural Science Foundation of China, NSFC, No. 41876168; Scientific Research Foundation of Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), No. YJ2019NO03; Advanced Customer Cultivation Project of Hefei Science Center, Chinese Academy of Sciences, No. 2020HSC-UE018]

束樹超(1994—), 男, 山東濟(jì)寧人, 學(xué)士, 主要從事海洋蛋白質(zhì)研究, 電話: 19801252213, E-mail: shushuchao18@mails.ucas.ac.cn; 畢允晨(1982—), 男, 研究員,通信作者, E-mail: yunchenbi@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)