Cu對(duì)云龍石斑魚(yú)幼魚(yú)的生理生態(tài)毒性

靳智欣, 徐永江, 劉新富, 梁 友, 周鶴庭, 崔愛(ài)君, 劉 欣

Cu對(duì)云龍石斑魚(yú)幼魚(yú)的生理生態(tài)毒性

靳智欣1, 2, 徐永江2, 劉新富2, 梁 友2, 周鶴庭2, 崔愛(ài)君2, 劉 欣2

(1. 浙江海洋大學(xué) 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 浙江 舟山 316022; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室深藍(lán)漁業(yè)工程聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

為研究Cu對(duì)云龍石斑魚(yú)(♀×♂)幼魚(yú)的生態(tài)毒性及生理生化指標(biāo)的影響, 作者分析了Cu2+對(duì)幼魚(yú)的安全質(zhì)量濃度(CS)、組織損傷、酶活力、金屬硫蛋白-2()基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組以及0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2 mg/L 等6個(gè)Cu2+實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行為期5 d的毒理實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示: Cu2+對(duì)云龍石斑魚(yú)幼魚(yú)的CS為0.0162 mg/L; Cu暴露誘發(fā)實(shí)驗(yàn)魚(yú)的肝臟組織血竇擴(kuò)張; 鰓組織出現(xiàn)動(dòng)脈瘤以及頂部棒狀等現(xiàn)象; 與對(duì)照組相比, 隨Cu2+濃度升高, 肝臟組織總超氧化物歧化酶(SOD)活力顯著下降; 谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力先上升后下降; 隨Cu處理濃度升高, 肝臟、鰓組織基因表達(dá)水平均逐漸上升; 而腦組織中表達(dá)水平先上升后下降, 但低濃度組較對(duì)照組差異不顯著。結(jié)果表明, 高濃度的Cu會(huì)造成云龍石斑魚(yú)幼魚(yú)的組織損傷、免疫酶活力降低等一系列不利影響, 結(jié)果為云龍石斑魚(yú)養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中利用銅制劑防控病害的適宜劑量選擇提供依據(jù)。

云龍石斑魚(yú)(♀×♂); 銅; 安全質(zhì)量濃度; 生理應(yīng)答;組織損傷

Cu是魚(yú)類(lèi)的必需微量元素之一, 能廣泛參與到魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育的生理生化過(guò)程中。Cu還是殺滅刺激隱核蟲(chóng)()的有效重金屬, 常用作水產(chǎn)養(yǎng)殖寄生蟲(chóng)病防治的有效藥物。研究表明, 水體中過(guò)量的Cu, 會(huì)通過(guò)魚(yú)類(lèi)呼吸及攝食等活動(dòng)進(jìn)入其體內(nèi), 造成組織損傷甚至死亡[1-2]。硫酸銅可殺滅刺激隱核蟲(chóng)、淀粉卵渦鞭蟲(chóng)()等寄生蟲(chóng), 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中通常作為漁藥使用[3-5]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 由于不注意用藥環(huán)境或使用高濃度的硫酸銅治療魚(yú)病, 易造成硫酸銅中毒, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重危害。因此, 適宜的使用劑量是在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中安全使用硫酸銅等銅制劑的關(guān)鍵。

云龍石斑魚(yú)(♀×♂), 是以鞍帶石斑魚(yú)()為父本, 以云紋石斑魚(yú)()為母本的具有優(yōu)良雜交性狀的石斑魚(yú)新品種。鞍帶石斑魚(yú)其體型大, 但數(shù)量稀少, 在中國(guó)主要產(chǎn)于南海海域和海南島海域, 具有抗病性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[6]。云紋石斑魚(yú)在中國(guó)主要產(chǎn)于東海海域、南海海域等, 具有耐受低溫、油脂含量高、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美等特點(diǎn), 但其生長(zhǎng)速度緩慢且對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境要求高, 一般養(yǎng)殖3～5年才能達(dá)到商品魚(yú)規(guī)格[7]。因此培育出的云龍石斑魚(yú), 具有生長(zhǎng)快、畸形率低和耐溫性廣的特點(diǎn)[8]。近年來(lái), 云龍石斑魚(yú)成為全國(guó)特別是北方石斑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)者的養(yǎng)殖新寵。然而, 在幼魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中, 易感染刺激隱核蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)而造成大量死亡。一般養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中, 養(yǎng)殖業(yè)者多使用硫酸銅治療刺激隱核蟲(chóng), 但目前尚未有規(guī)范的使用劑量, 易造成無(wú)效果或用量過(guò)大的情況, 從而帶來(lái)不必要的損失。因此, 本研究主要針對(duì)云龍石斑魚(yú)幼魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中易發(fā)的刺激隱核蟲(chóng)病害, 研究了硫酸銅在刺激隱核蟲(chóng)防治過(guò)程中的安全使用濃度, 以及不同濃度Cu2+條件下的組織損傷、酶活力以及毒理相關(guān)功能基因的變化, 為云龍石斑魚(yú)養(yǎng)殖期間利用Cu防控寄生蟲(chóng)疾病提供科學(xué)的參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)來(lái)源于煙臺(tái)海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司。選取體質(zhì)健壯、反應(yīng)靈敏的幼魚(yú), 規(guī)格為全長(zhǎng)(5.5±0.49) cm、體質(zhì)量(2.06±0.61) g。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)用方形水槽(容積為0.15 m3)暫養(yǎng)2 d。所有暫養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)用魚(yú)停食24 h后再放入各實(shí)驗(yàn)組, 避免消化活動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)期間不投餌, 直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)用的硫酸銅(CuSO4·5H2O≥99.0%)試劑為分析純。試劑在實(shí)驗(yàn)前配成質(zhì)量濃度為3 000 mg/L的母液作為儲(chǔ)備液, 再用過(guò)濾海水按比例稀釋, 現(xiàn)用現(xiàn)配。養(yǎng)殖期間自然海水的水溫為23～27 ℃、鹽度29±1、pH 7.8～8.2, 溶氧>5 mg/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照《水生生物毒性實(shí)驗(yàn)方法》[9], 同時(shí)參考其他海水魚(yú)類(lèi)Cu2+毒理實(shí)驗(yàn), 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 在Cu2+最小100%致死濃度和不引起死亡的最大濃度之間, 設(shè)置對(duì)照組和6個(gè)實(shí)驗(yàn)組, Cu2+的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2 mg/L。每個(gè)濃度組設(shè)置2個(gè)平行組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)放入30尾云龍石斑魚(yú), 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的1、2、3、6、12、24、48、72和96 h, 觀察記錄實(shí)驗(yàn)魚(yú)的行為、中毒癥狀和死亡情況。以多次刺激無(wú)反應(yīng)視為完全死亡, 將其及時(shí)從水中撈出, 并計(jì)算成活率。采用概率單位法(GB 17378.7-2007), 計(jì)算24、48、96 h 半致死質(zhì)量濃度(LC50)和95%置信區(qū)間。安全質(zhì)量濃度(CS)按下式計(jì)算[10]:

S= 96hLC50×0.1。

1.4 樣品的采集與保存

毒理實(shí)驗(yàn)96 h后, 不同濃度組各取3尾魚(yú)中鰓、肝臟組織, 以Davidson 固定液固定, 用于組織切片的制作; 各實(shí)驗(yàn)組分別取6尾魚(yú)的肝臟組織并混合, 放入液氮中保存, 用于酶活力的測(cè)定; 各取3尾魚(yú)的腦、鰓、肝臟組織放入液氮中保存, 用于基因表達(dá)分析。

1.5 光鏡制樣及拍照

組織樣品經(jīng)酒精梯度脫水, 石蠟包埋(55 ℃)后切片, 以蘇木精和伊紅復(fù)染, 中性樹(shù)脂封片, 在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察(NIKON ECLIPSE 80i, NIKON DS-Ri1, 日本)。

1.6 酶活力測(cè)定

利用酶標(biāo)儀(Bio-rad iMark, 日本)和WST-1法測(cè)試盒(A001-3, 南京建成生物工程研究所)測(cè)定肝臟超氧化物歧化酶(SOD)酶活力; 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1810, 上海)和比色法測(cè)試盒(C010-1-1, 南京建成生物工程研究所)測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)酶活力。蛋白濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法。所有操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。

1.7 基因定量表達(dá)分析

采用Trizol 試劑法(Pro Reagent, 湖南)提取腦、肝臟、鰓組織總RNA。以總RNA為模板, 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 日本)合成cDNA。

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找鞍帶石斑魚(yú)、金屬硫蛋白-2()基因的序列, 設(shè)計(jì)定量PCR引物并進(jìn)行PCR驗(yàn)證后使用, 參考引物序列詳見(jiàn)表1。使用Applied Biosystems ABI 7500 型定量PCR儀進(jìn)行基因的定量擴(kuò)增分析。PCR反應(yīng)體系為20 μL, 其中包含10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL; 10 μL的TB Green Premix; 0.4 μL的ROX Reference Dye II; 2 μL的cDNA 模版; 6 μL的ddH2O。PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s共40個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用6個(gè)稀釋濃度組(每組3個(gè)平行, 且設(shè)置空白對(duì)照)進(jìn)行; 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)2和擴(kuò)增效率。目的基因表達(dá)量采用2–ΔΔCt法計(jì)算。

表1 定量PCR引物序列

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 采用SPSS 19.0軟件單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比較分析方法檢驗(yàn)不同Cu2+濃度組條件下酶和基因表達(dá)的差異, 設(shè)定差異顯著性水平= 0.05, 當(dāng)<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 Cu暴露對(duì)云龍石斑魚(yú)行為學(xué)的影響

本研究表明, 云龍石斑魚(yú)在0.4 mg/L以上Cu2+濃度組出現(xiàn)行為異常情況。高濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在暴露 2～4 h后開(kāi)始出現(xiàn)行為異常, 主要表現(xiàn)為在水面游動(dòng), 身體失去平衡, 開(kāi)始側(cè)翻游動(dòng)。6～8 h后急速游動(dòng)、到處亂竄或者水面打轉(zhuǎn), 隨后身體抽搐, 沉入水底, 數(shù)分鐘后, 又向上急游并旋轉(zhuǎn)游動(dòng), 周而復(fù)始數(shù)次后, 直至呼吸緩慢, 乏力。12～24 h出現(xiàn)大量死亡, 死亡的云龍石斑魚(yú)鰓及體表分泌出大量黏液。低濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)出現(xiàn)中毒癥狀的時(shí)間較高濃度組晚, 但中毒的行為表現(xiàn)模式相似。

2.2 Cu2+對(duì)云龍石斑魚(yú)的生態(tài)毒性

利用概率單位法計(jì)算得知, Cu2+對(duì)云龍石斑魚(yú)24、48和96 h的LC50值分別為0.590、0.293、0.162 mg/L, CS為0.0162 mg/L。實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡率統(tǒng)計(jì)詳見(jiàn)表2; LC50以及CS統(tǒng)計(jì)詳見(jiàn)表3。

表2 Cu2+對(duì)云龍石斑魚(yú)的生態(tài)毒性結(jié)果

2.3 Cu暴露對(duì)云龍石斑魚(yú)的組織損傷

2.3.1 鰓的組織損傷

本研究發(fā)現(xiàn), Cu暴露造成了鰓組織的結(jié)構(gòu)損傷。由圖1a可知, 對(duì)照組鰓上皮細(xì)胞單層有序排列,次級(jí)鰓絲結(jié)構(gòu)清晰。隨Cu2+濃度升高, 鰓組織表面黏液增多, 鰓絲附有藍(lán)色絮狀物。低濃度處理組鰓上皮細(xì)胞水腫, 次級(jí)鰓絲黏液細(xì)胞腫脹, 出現(xiàn)動(dòng)脈瘤并伴有上皮與毛細(xì)血管分離的現(xiàn)象(圖1b); 高濃度處理組次級(jí)鰓絲上皮細(xì)胞破裂脫落, 頂部棒狀(圖1c)。

表3 Cu2+對(duì)云龍石斑魚(yú)的半致死質(zhì)量濃度與安全質(zhì)量濃度

2.3.2 肝臟的組織損傷

Cu暴露同樣造成了肝臟組織的結(jié)構(gòu)損傷。與對(duì)照組(圖1d)相比, 低濃度處理組胞漿內(nèi)大量空泡; 高濃度處理組肝細(xì)胞出現(xiàn)大量脂褐素顆粒, 且肝細(xì)胞腫大, 并伴有部分肝細(xì)胞壞死, 血竇擴(kuò)張, 肝索結(jié)構(gòu)紊亂(圖1e、1f)。

2.4 Cu暴露對(duì)云龍石斑魚(yú)肝臟氧化酶活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn), Cu暴露顯著抑制了肝臟SOD酶活力(圖2a), 但肝臟GOT酶活力隨Cu2+濃度升高, 呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)(圖2b)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 0.1 mg/L組較對(duì)照組SOD酶活力顯著降低(<0.05), 0.4 mg/L組較0.2 mg/L組SOD酶活力顯著降低(< 0.05), 1.2 mg/L組SOD酶活力顯著低于所有實(shí)驗(yàn)組(<0.05), 但0.2與0.1 mg/L質(zhì)量濃度組、0.8與0.4 mg/L質(zhì)量濃度組SOD酶活力相比差異不顯著(>0.05); 0.1 mg/L組GOT酶活力高于對(duì)照組(>0.05), 但Cu2+質(zhì)量濃度高于0.2 mg/L時(shí)GOT酶活力受到顯著抑制(<0.05)。

2.5 Cu暴露對(duì)云龍石斑魚(yú)組織MT-2的影響

2.5.1 對(duì)肝臟的影響

Cu脅迫下肝臟組織mRNA表達(dá)水平顯著上升(圖3a)。0.1 mg/L組較對(duì)照組、0.2 mg/L組較0.1 mg/L組、0.8 mg/L組較0.4 mg/L組mRNA表達(dá)水平均顯著升高(<0.05), 在1.2 mg/L組mRNA表達(dá)量達(dá)峰值, 顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05),但0.2 mg/L組與0.4 mg/L組mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(>0.05)。

圖1 云龍石斑魚(yú)經(jīng)96 h的Cu暴露后鰓、肝臟的顯微結(jié)構(gòu)(標(biāo)尺100 μm)

a～c. 鰓, d～f. 肝臟. a、d. 對(duì)照組; b、e. 0.2 mg/L Cu2+處理; c、f. 1.2 mg/L Cu2+處理

a-c. gills, d-f. liver. a, d. control; b, e. 0.2 mg/L Cu2+treatment; c, f. 1.2 mg/L Cu2+treatment

圖2 Cu2+對(duì)云龍石斑魚(yú)肝臟SOD酶(a)和GOT酶(b)活力影響

不同小寫(xiě)字母表示不同處理組之間差異顯著(<0.05), 圖3同

Different lowercasesuperscripts indicate significant difference (<0.05) in the different treatment, the same as Fig.3

2.5.2 對(duì)鰓2的影響

本研究表明, Cu脅迫下鰓組織mRNA表達(dá)水平升高, 與肝臟中表達(dá)趨勢(shì)相似(圖3b)。其中0.1～0.4 mg/L質(zhì)量濃度下mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異(>0.05), 但在0.8、1.2 mg/L Cu2+質(zhì)量濃度下顯著升高(<0.05)。

2.5.3 對(duì)腦的影響

Cu脅迫條件下, 腦組織mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升再下降趨勢(shì)。其中0.1、0.2 mg/L質(zhì)量濃度下mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(>0.05), Cu2+質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時(shí)mRNA表達(dá)水平顯著升高(<0.05), 0.8、1.2 mg/L濃度組mRNA表達(dá)水平顯著下降, 且顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05) (圖3c)。

圖3 Cu2+對(duì)云龍石斑魚(yú)MT-2 mRNA 表達(dá)的影響

(a). 肝臟; (b). 鰓; (c). 腦

(a). liver; (b). gills; (c). brain

3 討論

3.1 Cu暴露對(duì)云龍石斑魚(yú)的急性毒性效應(yīng)

有關(guān)Cu對(duì)魚(yú)類(lèi)毒性效應(yīng)的研究已有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn), Cu暴露條件下云龍石斑魚(yú)體表和鰓黏液增多、鰓絲附有藍(lán)色絮狀物。行為變化為翻轉(zhuǎn)測(cè)游、水面上層打轉(zhuǎn)、鰓蓋張開(kāi)頻率加快, 最終窒息死亡。這與沙丁魚(yú)()[11]、莫桑比克羅非魚(yú)()[12]、刀鱭()幼魚(yú)[13]中毒現(xiàn)象一致。

LC50通常作為衡量某種藥物對(duì)特定物種毒性大小的重要參數(shù), 以96 h LC50作為標(biāo)準(zhǔn)[14]。CHIDIEBERE[15]報(bào)道Cu2+對(duì)鯰魚(yú)()96 h的LC50為59.36 mg/L, 而王秋實(shí)等[16]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對(duì)梭鱸()幼魚(yú)96 h LC50為1.88 mg/L。本研究結(jié)果顯示, Cu2+對(duì)云龍石斑幼魚(yú)96 h的LC50值為0.162 mg/L, 結(jié)果與其他魚(yú)類(lèi)不同, 這是由種的差異性造成, 表明云龍石斑魚(yú)對(duì)Cu2+較為敏感。TAVARES-DIAS[17]也曾報(bào)道一些魚(yú)種對(duì)Cu極為敏感, 而其他魚(yú)種則有高度耐受性。孟紫強(qiáng)等[18]評(píng)定LC50在0.1～1.0 mg/L為高毒, 本研究結(jié)果表明云龍石斑幼魚(yú)96 h LC50在高毒范圍區(qū)間, 提示在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中藥用硫酸銅時(shí)應(yīng)準(zhǔn)確把控用量。此外, 有研究發(fā)現(xiàn), 鹽度[19]、溫度[20]等理化因子的改變對(duì)重金屬的毒性也可能產(chǎn)生影響, 本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境因子較穩(wěn)定, 下一步可以通過(guò)更為精密的實(shí)驗(yàn)研究其他理化因子對(duì)Cu2+毒性的影響。

3.2 Cu暴露對(duì)云龍石斑魚(yú)的組織損傷

鰓主要參與魚(yú)類(lèi)的呼吸和滲透調(diào)節(jié)過(guò)程, 是重金屬首先接觸的靶器官。重金屬離子主要通過(guò)阻塞鰓絲與水體的接觸, 以此抑制魚(yú)的呼吸[21]。本研究發(fā)現(xiàn), 高濃度Cu處理組鰓上皮細(xì)胞增生, 次級(jí)鰓絲頂部棒狀, 這與BASIRUN等[12]研究Cu對(duì)莫桑比克羅非魚(yú)以及AFAGHI等[22]研究Cu對(duì)鯉魚(yú)()的結(jié)果一致。GRIFFITT等[23]認(rèn)為Cu刺激斑馬魚(yú)()鰓組織次級(jí)鰓絲基部的增生增加了氣體傳送的距離, 甚至很小的增生都會(huì)影響氧氣穿過(guò)鰓進(jìn)入到體內(nèi)的效率, 本研究中Cu暴露導(dǎo)致云龍石斑魚(yú)鰓蓋張開(kāi), 呈現(xiàn)缺氧狀態(tài), 病理切片觀察發(fā)現(xiàn)次級(jí)鰓絲基部出現(xiàn)動(dòng)脈瘤, 表明Cu脅迫對(duì)云龍石斑魚(yú)鰓運(yùn)輸氣體的功能造成影響。肝臟是魚(yú)類(lèi)分解毒物的重要器官, 有研究表明, 血竇擴(kuò)張是Cu誘導(dǎo)肝臟損傷的重要指示信號(hào)[24], 并且脂褐素顆粒的大量產(chǎn)生是一種在致病因素影響下動(dòng)物對(duì)自身肝臟的適應(yīng)與修復(fù)機(jī)制[25]。本研究結(jié)果顯示, 急性Cu暴露96 h后, 肝臟顯示出不同程度的損傷, 主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫大、血竇擴(kuò)張、血細(xì)胞沉積以及脂褐素顆粒產(chǎn)生, 這與徐永江等[2]對(duì)半滑舌鰨()、王海濤等[26]對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚(yú)()以及ALKOBABY等[27]對(duì)尼羅羅非魚(yú)()肝臟組織損傷的報(bào)道結(jié)果類(lèi)似, 說(shuō)明Cu誘導(dǎo)不同品種魚(yú)類(lèi)肝臟損傷的癥狀大體一致。

3.3 Cu暴露對(duì)云龍石斑魚(yú)肝臟抗氧化酶活性的影響

SOD、GOT是脊椎動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶的重要組分, 先前研究表明其可作反映魚(yú)類(lèi)肝臟受損傷程度的指示指標(biāo)[28-29]。本研究中, 云龍石斑魚(yú)SOD和GOT酶活性對(duì)Cu的刺激均較敏感, 但Cu暴露對(duì)兩種酶活性的影響呈現(xiàn)不同趨勢(shì)。低濃度Cu處理組較對(duì)照組GOT酶活性升高, 這與RAMASWAMY等[30]對(duì)莫桑比克羅非魚(yú)肝臟組織的研究結(jié)果類(lèi)似。STEBBING[31]認(rèn)為, 毒物在低濃度下出現(xiàn)這種現(xiàn)象, 是其在無(wú)毒情況下的應(yīng)激反應(yīng), 他把這一現(xiàn)象稱為“毒物興奮效應(yīng)”。但后續(xù)隨著Cu2+濃度升高, GOT酶活力降低。作者認(rèn)為低濃度Cu脅迫下, 云龍石斑魚(yú)肝臟GOT酶活力上升是用于補(bǔ)償環(huán)境脅迫帶來(lái)的影響, 但高濃度處理組脅迫下, 可能已經(jīng)超出了其本身抗氧化系統(tǒng)的防御能力, 從而造成較為嚴(yán)重的損傷。殷健等[32]報(bào)道斑馬魚(yú)鰓組織在暴露于重金屬Cu后, SOD活性和MDA含量明顯升高, 而且基因表達(dá)上調(diào)。SANCHEZ等[33]也報(bào)道Cu能夠誘導(dǎo)三棘魚(yú)()中肝臟組織的SOD和CAT活性提高。但本研究發(fā)現(xiàn), 隨Cu2+濃度的升高, 肝臟組織SOD顯著降低, 這與WANG[34]對(duì)斜帶石斑魚(yú)()肝臟中SOD酶活力應(yīng)答Cu脅迫的研究結(jié)果一致。表明云龍石斑魚(yú)肝臟SOD活力對(duì)Cu脅迫較為敏感, SOD系統(tǒng)受到Cu的嚴(yán)重脅迫抑制, 提示應(yīng)用Cu制劑處理云龍石斑魚(yú)時(shí)應(yīng)注意使用劑量, 同時(shí)也提示其可作為水環(huán)境Cu2+安全監(jiān)測(cè)生理指示指標(biāo)的可能性。

3.4 Cu暴露對(duì)云龍石斑魚(yú)組織MT-2的影響

是金屬硫蛋白家族成員之一, 與Zn、Cu、Fe、Cd等二價(jià)離子可逆性結(jié)合以維持機(jī)體內(nèi)金屬離子平衡, 對(duì)重金屬解毒有重要作用[35]。GONZALEZ 等[36]報(bào)道基因在肝臟中比在腦、鰓和肌肉中表達(dá)量高。WANG等[34]研究表明, 斜帶石斑魚(yú)肝臟是積蓄Cu的主要靶器官, 劉瑜等[37]報(bào)道Cu主要沉積在黃鱔()的肝臟和腸道部位, 高濃度Cu會(huì)導(dǎo)致肝臟Cu超標(biāo), 說(shuō)明肝是Cu積累的最主要靶器官。GAO等[38]表明鱖魚(yú)()mRNA在所有組織都表達(dá), 且在鰓、肝臟、心臟、體腎和腸道中高表達(dá), 在腦和頭腎中低表達(dá)。本研究中, 隨Cu2+濃度升高,mRNA在肝臟, 鰓組織表達(dá)水平顯著升高, 與GONZALEZ[36]描述一致。但在腦組織中mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 且在低濃度時(shí)上升趨勢(shì)不顯著, 這與左鵬舉[39]對(duì)鯉魚(yú)mRNA表達(dá)水平研究結(jié)果相似, 說(shuō)明高濃度Cu處理組腦組織誘導(dǎo)表達(dá)已與重金屬飽和結(jié)合, 機(jī)體產(chǎn)生了不可逆的毒性。CRAIG等[40]研究表明, 斑馬魚(yú)在Cu暴露組(8 μg/L)中mRNA表達(dá)水平比上調(diào)更快, 表明基因作為Cu2+對(duì)魚(yú)類(lèi)生理毒性的評(píng)價(jià)參數(shù)的重要性, 也可作為魚(yú)類(lèi)對(duì)Cu2+敏感應(yīng)答的指示參數(shù)。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中, 硫酸銅對(duì)云龍石斑魚(yú)幼魚(yú)的96 h LC50在高毒范圍區(qū)間, Cu暴露不僅造成云龍石斑魚(yú)幼魚(yú)的肝臟、鰓組織損傷, 同時(shí)使其體內(nèi)抗氧化酶活性及基因表達(dá)產(chǎn)生不同的變化。表明云龍石斑魚(yú)對(duì)硫酸銅制劑的處理較為敏感。本研究結(jié)果顯示, Cu2+對(duì)云龍石斑魚(yú)的安全質(zhì)量濃度為0.016 2 mg/L (換算成硫酸銅質(zhì)量濃度為0.040 5 mg/L), 因此在養(yǎng)殖過(guò)程中, 建議使用0.040 5 mg/L及以下質(zhì)量濃度的硫酸銅進(jìn)行藥浴或寄生蟲(chóng)病害防控。

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Physiological and ecological toxicity of copper on juvenile Yunlong grouper (♀ ×♂)

JIN Zhi-xin1, 2, XU Yong-jiang2, LIU Xin-fu2, LIANG You2, ZHOU He-ting2, CUI Ai-jun2, LIU Xin2

(1. National Engineering Research Center For Marine Aquaculture, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) for Deep Blue Fishery Engineering, Qingdao 266071, China)

In orderto investigate the effects of copper exposure on ecotoxicity as well as on physiological and biochemical indexes in Yunlong grouper (♀ ×♂) juveniles, a safe concentration for copper (Cu2+) stress and the effects of Cu2+on tissue structure damage, enzyme activity, and metallothionein-2() gene expression in Yunlong grouper were analyzed. In the present study, the fishes were exposed to different Cu2+concentrations of 0 (control), 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, and 2 mg/L for 5 days. The results of this experiment showed that the safe concentration of copper for juvenile Yunlong grouper was 0.0162 mg/L. Exposure of the fishes to Cu2+induced dilatation of sinusoids in their liver, and the arrangement of hepatocytes around the central vein of liver tissue presented different degrees of disorder. The exposure also induced clubbed tips, edema of epithelial cells, and aneurysms in gills. With an increase in Cu2+concentration, the total superoxide dismutase (SOD) activity decreased in the liver, and the glutamic-oxaloacetic transaminase (GOT) activity showed an initial increase followed by a decreasing trend in the liver as compared with the control group. The expression level ofmRNA increased in the liver and gills as a result of the copper exposure stress. However, in the brain, the expression level ofmRNA increased initially and then decreased. In summary, exposure to a high concentration of copper caused a series of physiological changes such as structural damage in the gills and liver as well as immunity-related enzyme activity inhibition in the liver of Yunlong grouper. These findings would provide technical guidance for copper product selection in disease control in Yunlong grouper aquaculture.

Yunlong grouper; copper; safe concentration; physiological stress; structure damage

Jun. 6, 2022

S94

A

1000-3096(2022)08-0039-09

10.11759/hykx20220412002

2022-04-12;

2022-06-06

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019YFD0900901, 2020YFD0900605); 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)課題 (20202TD47); 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(CARS-47)

[National Key Research and Development Program, Nos. 2019YFD0900901, 2020YFD0900605; Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS, No. 2020TD47; China Agriculture Research System of MOF and MARA, No. CARS-47]

靳智欣(1998—), 女, 黑龍江鶴崗人, 碩士研究生, 主要從事魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制研究, E-mail: jinzhixin98@163.com; 徐永江(1981—),通信作者, E-mail: xuyj@ysfri.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)