玉米素合成通路相關(guān)基因的克隆及表達(dá)

張?jiān)侅?，?蕓，鄭祖平，張紅梅，劉小紅，曹 丹，李仕偉

(1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637000；2.廳市共建甘薯及特色豆科作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637000；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西 忻州 034000)

玉米是世界上第三大禾谷類作物，僅次于水稻和小麥，也是最重要的經(jīng)濟(jì)和飼料作物之一[1]。隨著全球氣候變暖，極端高溫天氣的頻繁出現(xiàn)，在局部地區(qū)高溫脅迫對(duì)玉米的生產(chǎn)已造成了極大危害[2-4]。在玉米的整個(gè)生育周期中，高溫都會(huì)對(duì)其發(fā)育產(chǎn)生影響，但對(duì)高溫最敏感的時(shí)期為開花階段，主要是高溫對(duì)花粉活力的影響，高溫會(huì)導(dǎo)致花粉活力下降或敗育，直接影響玉米授粉結(jié)實(shí)，造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降。因此，選育花粉能耐高溫脅迫的玉米品種就顯得極其重要。經(jīng)過玉米育種家的不懈努力，已選育出少部分花粉能耐高溫的玉米品種，如生產(chǎn)上常用的玉米品種中地88，其花粉能在42 ℃高溫環(huán)境保存較長(zhǎng)時(shí)間的活性。

不同玉米材料的花粉耐高溫脅迫的能力不同，與其基因型及其表達(dá)差異有關(guān)。因此，有必要在分子水平上了解不同溫度條件下花粉基因的差異表達(dá)，這有助于揭示玉米耐高溫脅迫的分子機(jī)理。玉米耐高溫為多基因控制的數(shù)量性狀[5-6]，到底哪些基因與該性狀有關(guān)，哪些為主效基因，哪些為微效基因，這方面的研究鮮有報(bào)道。玉米素屬細(xì)胞分裂素，在控制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程中起著重要作用，同時(shí)也與植物耐高溫脅迫相關(guān)。因此，研究不同耐高溫玉米材料玉米素生物合成相關(guān)基因在高溫脅迫條件下的差異表達(dá)具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是克隆分析差異表達(dá)基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)的重要手段，其突出優(yōu)點(diǎn)是一次可分析整個(gè)基因組基因的差異表達(dá)，這在許多動(dòng)植物中都有報(bào)道[7-10]。基于此，本研究選用耐高溫脅迫的玉米品種中地88和不耐高溫的先玉335為試驗(yàn)材料，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析玉米素生物合成通路中的基因結(jié)構(gòu)及差異表達(dá)情況，旨在初步認(rèn)識(shí)玉米花粉耐高溫脅迫的機(jī)制，為進(jìn)一步克隆利用玉米耐高溫脅迫基因奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取耐高溫脅迫的中地88和不耐高溫脅迫的先玉335兩個(gè)玉米品種為試驗(yàn)材料。將這兩個(gè)材料種植于常溫和溫室大棚兩個(gè)生態(tài)環(huán)境。

1.2 方 法

1.2.1玉米素合成相關(guān)基因的克隆

在玉米開花期，正午時(shí)分，大棚溫度達(dá)到42 ℃時(shí)，取大棚中兩個(gè)玉米材料的花粉，同時(shí)以常溫狀態(tài)下這兩個(gè)材料花粉為對(duì)照，液氮速凍后，提取總RNA，再經(jīng)mRNA純化、反轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄本測(cè)序分析，以獲得玉米素合成相關(guān)的差異表達(dá)基因。

1.2.2玉米素合成相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)發(fā)現(xiàn)的玉米素合成相關(guān)基因，參考文獻(xiàn)[11]、文獻(xiàn)[12]，網(wǎng)絡(luò)在線分析其基因序列，包括內(nèi)含子數(shù)目、cDNA全長(zhǎng)、編碼蛋白數(shù)目、常見理化性質(zhì)、磷酸化修飾位點(diǎn)、常見功能位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等。

1.2.3基因差異表達(dá)及代謝通路分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果，分析玉米素合成相關(guān)基因在不同材料不同生態(tài)環(huán)境下的表達(dá)情況，以3次重復(fù)的平均讀段數(shù)(read count)計(jì)算基因表達(dá)量。同時(shí)，分析這些基因在玉米素生物合成代謝通路中所處的位置及其生物學(xué)作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆基因序列

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到在不同溫度條件下玉米素合成通路中5個(gè)基因的cDNA序列，包括細(xì)胞分裂素氧化酶5基因(Zmco5)、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶4基因(Zmit4)、細(xì)胞分裂素氧化酶4 b基因(Zmco4b)、細(xì)胞分裂素氧化酶12基因(Zmco12)和順式玉米素葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶1基因(Zmczg1)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這5個(gè)基因分別位于玉米第8、7、8、2、2染色體；cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為1 749 bp、1 095 bp、1 605 bp、1 587 bp和1 398 bp；全長(zhǎng)基因含有的外顯子數(shù)目分別為3、1、5、5個(gè)和1個(gè)，即Zmco5、Zmco4b、Zmco12為斷裂基因，分別含有2、4、4個(gè)內(nèi)含子，而Zmit4和Zmczg1沒有內(nèi)含子，其編碼區(qū)是連續(xù)的。

2.2 基因的編碼蛋白

開放閱讀框分析結(jié)果顯示，Zmco5、Zmit4、Zmco4b、Zmco12和Zmczg1基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)目分別為582、364、534、528、465個(gè)(圖1～圖5)，各自均含有20種常見氨基酸，其中帶負(fù)電荷的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)數(shù)目分別為64、47、54、54、55個(gè)，帶正電荷(精氨酸和賴氨酸)的氨基酸數(shù)目分別為55、52、48、49、48個(gè)。

圖1 Zmco5基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco5 gene

圖2 Zmit4基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.2 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmit4 gene

圖3 Zmco4b基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.3 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco4b gene

圖4 Zmco12基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.4 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco12 gene

圖5 Zmczg1基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.5 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmczg1 gene

表1 玉米素合成相關(guān)基因編碼蛋白的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.3 蛋白的理化性質(zhì)

基因編碼蛋白的常見理化性質(zhì)分析結(jié)果如表1所示。這5個(gè)蛋白中，分子量最高的是Zmco 5蛋白，最小的是Zmit 4蛋白，總的來說，其蛋白分子量大小與其含有氨基酸的數(shù)目呈正相關(guān)。從等電點(diǎn)分析結(jié)果可見，除Zmit 4蛋白為顯堿性外，其余4個(gè)均顯弱酸性。通過計(jì)算其不穩(wěn)定指數(shù)發(fā)現(xiàn)，Zmco 5和Zmco 4 b蛋白在細(xì)胞中能穩(wěn)定存在，而其余3個(gè)屬不穩(wěn)定蛋白。此外，從脂肪族指數(shù)和總平均親水系數(shù)兩個(gè)參數(shù)值可看出，這5個(gè)蛋白都屬親水性蛋白。

2.4 蛋白的磷酸化修飾

編碼蛋白磷酸化修飾在線分析結(jié)果如表2所示，在這5個(gè)基因的編碼蛋白中，蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸殘基是常見的磷酸化修飾位點(diǎn)，這3種氨基酸修飾位點(diǎn)合計(jì)平均每個(gè)編碼蛋白有38個(gè)，其中Zmco5基因編碼蛋白的修飾位點(diǎn)最多，達(dá)到58個(gè)，其次為Zmco12基因編碼蛋白，為44個(gè)，最少的是Zmit4編碼的蛋白，僅有25個(gè)。

表2 玉米素合成相關(guān)基因編碼蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)Table 2 Phosphorylation modification sites of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.5 蛋白的功能位點(diǎn)

玉米素合成相關(guān)基因編碼蛋白的功能位點(diǎn)分析結(jié)果見表3，這5個(gè)蛋白一共包含9種不同功能位點(diǎn)，其中N-豆蔻酰基化位點(diǎn)為5個(gè)蛋白同時(shí)含有，其余位點(diǎn)為部分蛋白含有，ATP/GTP-結(jié)合位點(diǎn)基序A(P-環(huán))、酰胺化位點(diǎn)與依賴cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)相對(duì)稀少，在這5種蛋白中只有其中一種蛋白含有。

表3 玉米素合成相關(guān)基因編碼蛋白的功能位點(diǎn)Table 3 Functional sites of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見表4，在這5種蛋白中，包括的二級(jí)結(jié)構(gòu)種類共有4種。除無規(guī)則卷曲區(qū)外，螺旋區(qū)最為常見，其中Zmco5和Zmczg1基因編碼蛋白都含有18個(gè)該種位點(diǎn)，Zmit4和Zmco4b基因編碼蛋白有17個(gè)，最少的Zmco12基因編碼蛋白也有16個(gè)。有一個(gè)特殊現(xiàn)象是，Zmco5基因編碼蛋白還含有1個(gè)位于第268位的精氨酸殘基為假定的域邊界位點(diǎn)。三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬的結(jié)果如圖6所示。這5種蛋白都有較為復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)，圖中紅色末端為N末端，藍(lán)色末端為C末端。相對(duì)來說，分子量越大，其高級(jí)結(jié)構(gòu)也越復(fù)雜。

2.7 基因表達(dá)及代謝通路分析

玉米素合成相關(guān)的5個(gè)基因在花粉中的表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示，表中數(shù)值為基因表達(dá)的三次重復(fù)的平均read count值。以常溫為對(duì)照，對(duì)于耐高溫脅迫的中地88來說，除Zmco5基因表達(dá)上調(diào)外，其余4個(gè)基因均顯示為表達(dá)下調(diào)。與此不同的是，對(duì)于不耐高溫脅迫的先玉335來說，Zmco5和Zmczg1均表達(dá)上調(diào)，其余3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。如以先玉335為對(duì)照，Zmco12和Zmczg1兩個(gè)基因在高溫環(huán)境下中地88表現(xiàn)為極顯著表達(dá)下調(diào)，但在常溫環(huán)境下，表達(dá)下調(diào)不顯著。該結(jié)果也說明，這5個(gè)玉米素合成相關(guān)基因其表達(dá)同時(shí)受到溫度和材料的影響。這幾個(gè)基因在KEGG通路中，具有不同的功能。其對(duì)應(yīng)的代謝通路為Zmco5、Zmco4b和Zmco12均為k 00279；Zmit4為K 10760；Zmczg1為K 13495。這幾個(gè)代謝通路節(jié)點(diǎn)都在細(xì)胞內(nèi)玉米素合成代謝途徑中起著重要的作用。

注：A為Zmco5；B為Zmit4；C為Zmco4b；D為Zmco12；E為Zmczg1。圖6 預(yù)測(cè)的玉米素合成相關(guān)基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Predicted tertiary structure of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

表4 玉米素合成相關(guān)基因編碼蛋白預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 4 Predicted secondary structure of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

表5 玉米素合成相關(guān)基因的表達(dá)統(tǒng)計(jì)Table 5 Expression analysis of genes related to zeatin synthesis

3 討論與結(jié)論

玉米素是控制玉米生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素，其表達(dá)與植株生長(zhǎng)及抗逆密切相關(guān)[13-14]。玉米素在細(xì)胞內(nèi)的生物合成非常復(fù)雜，從其代謝通路可知涉及到很多基因的表達(dá)產(chǎn)物[15-16]。就玉米而言，到底是哪些基因的表達(dá)參與玉米素的合成，這些基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)量與植株表型有何關(guān)系，相關(guān)研究鮮有報(bào)道。而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以從整個(gè)基因組出發(fā)，研究某一器官或組織的所有基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況[17-19]，分析不同材料、不同生長(zhǎng)部位在不同環(huán)境下的基因表達(dá)差異，以揭示其相關(guān)關(guān)系[20-21]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在玉米這一作物中也有著廣泛應(yīng)用[22-24]。

許多研究表明，玉米花粉是對(duì)高溫極其敏感的部位，高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致花粉活力下降，甚至完全敗育，進(jìn)一步影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[25]。因此，培育花粉能耐高溫脅迫的玉米品種十分必要，而從分子水平認(rèn)識(shí)花粉中基因表達(dá)、玉米材料及環(huán)境條件三者之間的相互關(guān)系，有助于理解花粉耐高溫脅迫的分子機(jī)理，而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析是解決這一問題的有效手段。

因此，本研究借助二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)中地88和先玉335兩個(gè)玉米品種的花粉基因在不同溫度條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)與玉米素合成相關(guān)的基因存在差異表達(dá)。這5個(gè)基因共分布于3條染色體，有3個(gè)為斷裂基因，2個(gè)為連續(xù)編碼基因。進(jìn)一步分析了這5個(gè)基因的理化性質(zhì)、磷酸化修飾、功能位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)。從基因的表達(dá)量來看，對(duì)于耐高溫脅迫的中地88材料，這5個(gè)基因表達(dá)差異達(dá)到2倍以上，若以常溫條件為對(duì)照，Zmco5基因表達(dá)上調(diào)，其余表達(dá)下調(diào)。但對(duì)花粉不耐高溫的先玉335來說，有不一樣的表現(xiàn)，Zmco5和Zmczg1為表達(dá)上調(diào)，其余3個(gè)為表達(dá)下調(diào)。這5個(gè)基因均處于玉米素生物合成通路中，對(duì)每一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)識(shí)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)分析，此工作尚在進(jìn)行之中。本研究結(jié)果為理解玉米耐高溫脅迫的分子機(jī)理提供了一些參考依據(jù)，為開展耐高溫玉米品種選育奠定理論基礎(chǔ)。