蒙古黃芪開(kāi)花習(xí)性及有性雜交技術(shù)初探

田洪嶺，郭淑紅，張麗君，吳昌娟，裴帥帥

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所，太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因研究中心，太原 030031)

蒙古黃芪(Astragalusmembranaceusvar. mongholicus Bge.)為豆科(Labiatae)黃芪屬多年生草本植物[1]，在我國(guó)已有兩千多年的藥用歷史，始見(jiàn)于漢墓馬王堆出土的帛書(shū)“五十二病方”[2]。我國(guó)黃芪屬資源有8亞屬278種2亞種35變種2變形，主要分布于山西、內(nèi)蒙古、甘肅、青海等省的半干旱、海拔800～1 300 m之間的向陽(yáng)山坡或灌叢邊緣，喜涼爽干燥氣候[3]。

黃芪為蟲(chóng)媒花，自花不孕或自交不親和的異花授粉植物[4-5]。由于不易自交得到純的品系，黃芪名稱、產(chǎn)地以及功效都發(fā)生了巨大的變化[6]。栽培方面，黃芪種質(zhì)混雜混亂情況嚴(yán)重，山西、內(nèi)蒙古、甘肅等不同黃芪產(chǎn)區(qū)常調(diào)種使用，蒙古黃芪種子與膜莢黃芪種子摻雜，加劇了種子混雜程度[7-8]；在黃芪種質(zhì)資源選育方面，從1994—2015年間，選育出的蒙古黃芪品種有隴芪1號(hào)至隴芪4號(hào)[9-11]、黃芪新品系JX 08-5-1[12]；膜莢黃芪品種有山東的文黃11[13]和泰黃芪1號(hào)[14]；以及甘肅黃芪新品系94-02[15]。山西省尚無(wú)黃芪品種選育報(bào)道，育種工作的嚴(yán)重滯后，制約了山西省黃芪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，黃芪雜交方法及雜交技術(shù)的研究可以促進(jìn)山西省黃芪品種選育進(jìn)程[8]。山西省黃芪以蒙古黃芪為主，在5—7月開(kāi)花、結(jié)莢、鼓粒至成熟，本研究通過(guò)在蒙古黃芪盛花期觀察花器，并參照大豆[16-17]、苦蕎等[18]作物的雜交方法配制雜交組合試驗(yàn)，探索蒙古黃芪的雜交方法，為加快蒙古黃芪育種進(jìn)程，建立高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、純正的蒙古黃芪種質(zhì)資源庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蒙古黃芪材料(見(jiàn)表1、圖1)，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所中藥材課題組提供。

2019年5月，采用種子直播方式將HQHY-3和HQWT-6種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所藥用植物試驗(yàn)田(以下簡(jiǎn)稱經(jīng)作所試驗(yàn)田)。經(jīng)作所試驗(yàn)田位于汾陽(yáng)市東南方，37°14′40″N，111°47′2″E，是太原盆地的一部分，為新墾樹(shù)林地，土質(zhì)為黃壤土，肥力中上等，排灌方便。平均海拔750 m，全年平均氣溫9.7 ℃，年降水量小于462 mm，全年平均日照時(shí)數(shù)為2 601.3 h，無(wú)霜期175 d左右。種植方式為穴條播，穴距為0.5 m，每穴4株，每穴條間留有空地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1蒙古黃芪花器觀察

在花期，利用顯微鏡(SMZ-171-TL，廈門(mén)麥克奧迪科技有限公司)觀察柱頭和花粉的成熟情況與花蕾外部形態(tài)之間的關(guān)系。

1.2.2雜交方法

參照大豆[16-17]、苦蕎[18]等作物的雜交方法進(jìn)行雜交。編號(hào)HQHY-3和HQWT-6 兩個(gè)親本，各選擇健康、無(wú)病蟲(chóng)害植株10株，枝條上部已經(jīng)萌動(dòng)即將開(kāi)花的向陽(yáng)枝條。5月上旬進(jìn)入盛花期，每天09：00時(shí)左右開(kāi)始授粉，持續(xù)到6月上旬結(jié)束。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料特征特性

HQHY-3花色為純白色，鮮根直立，是典型的山西恒山鞭桿芪特性，黃芪甲苷含量714.29 mg/kg，葉間距大；HQWT-6花朵尖端紅色，根型較直立，有少許須根，黃芪甲苷含量544.05 mg/kg，葉間距小，株高較HQHY-3高10～15 cm。

2.2 蒙古黃芪開(kāi)花習(xí)性

蒙古黃芪一年生植株基本不開(kāi)花，編號(hào)HQHY-3和HQWT-6的兩個(gè)親本均為兩年生植株，以主莖腋生總狀花序?yàn)橹?花序間排列較疏松，每株花序的數(shù)量差異較大，十幾個(gè)到幾十個(gè)不等，與植株的大小相關(guān)?；ㄐ虻陌l(fā)育順序是先主枝后側(cè)枝,單朵花開(kāi)放順序由基部向上依次開(kāi)放，每個(gè)花序有花10～29朵(見(jiàn)圖1)?？偦ü１热~稍長(zhǎng)或近等長(zhǎng)，至果期顯著伸長(zhǎng)。 果熟期為棕色，長(zhǎng)19～26 mm，寬9～11 mm，內(nèi)有1～7粒種子。

4月底5月初，HQHY-3首先出現(xiàn)花蕾，4 d后HQWT-6 開(kāi)始出現(xiàn)花蕾，一直持續(xù)到6月下旬。從5月初開(kāi)始，花蕾花朵連續(xù)開(kāi)放進(jìn)入盛花期，5月中下旬開(kāi)始，植株開(kāi)花結(jié)果期并存，且繼續(xù)有花序形成。HQHY-3于5月12日開(kāi)始結(jié)莢，HQWT-6結(jié)莢比HQHY-3晚4 d。

2.3 蒙古黃芪花器構(gòu)造

蒙古黃芪花由外向內(nèi)分為苞片、花萼、花冠、雄蕊和雌蕊(見(jiàn)圖2)?；üＥc苞片近等長(zhǎng)，有黑色毛；苞片條形，花萼鐘狀，長(zhǎng)約5 mm。小花為典型的蝶形花，兩側(cè)對(duì)稱，花瓣5枚?；ǘ渥钔饷媲易畲蟮臑槠彀?，里面最小的2片為龍骨瓣，夾在中間2片像翅膀?yàn)橐戆?。花序最初的形態(tài)呈穗狀(見(jiàn)圖3 C ，未開(kāi)花)，花冠整個(gè)包于花萼中，花萼基部貼附兩個(gè)小苞片，花柄極短，苞片長(zhǎng)于花蕾；隨著花蕾進(jìn)一步的發(fā)育，花冠逐漸露出，至開(kāi)放前呈淡黃色(見(jiàn)圖3 )?；ü谏扉L(zhǎng)至花萼的2倍時(shí)，繁殖器官成熟，受精過(guò)程開(kāi)始。隨著花蕾展開(kāi)，暴露出的花藥隨即開(kāi)裂。在顯微鏡下觀察得知未展開(kāi)的花蕾，花藥不開(kāi)裂。

表2 單莢結(jié)實(shí)數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of seed setting rate per pod

2.4 花的雌蕊、雄蕊成熟期

蒙古黃芪的花藥一般在花未開(kāi)放以前就已散粉，將花蕾按照花冠與花萼的長(zhǎng)度，分為冠>萼、冠=萼和冠<萼三種(見(jiàn)圖3)。在顯微鏡下觀察，得知冠大于萼時(shí)，花蕾柱頭和花粉都已成熟?；ò晖耆㈤_(kāi)的花朵(圖3 A)，花粉布滿柱頭，盛開(kāi)的小花長(zhǎng)17.2～19.2 mm，花萼占整個(gè)花長(zhǎng)的35%～38%，花瓣沒(méi)有開(kāi)放的花朵，花粉沒(méi)有散掉(圖3 B左)；冠等于萼時(shí)(圖3 B右)，花蕾長(zhǎng)8～9 mm，子房長(zhǎng)3～3.5 mm時(shí)，胚囊卵球形，位于合點(diǎn)端，花蕾柱頭和花粉都已成熟，但此時(shí)花朵都尚未開(kāi)放，花粉內(nèi)外壁明顯，表明有三孔溝，花粉粒近圓球形，花粉粒為穴狀紋飾；冠小于萼時(shí)(圖3 C)，花蕾柱頭和花粉皆未成熟。因此選擇冠大于或等于萼的類(lèi)型作為父本，雜交時(shí)當(dāng)時(shí)去雄，當(dāng)時(shí)授粉。

圖3 蒙古黃芪花蕾狀態(tài)Fig.3 Flower bud status of Astragalus membranaceus var. mongholicus

2.5 雜交步驟

2021年5月初，HQHY-3和HQWT-6 兩個(gè)親本先后進(jìn)入盛花期，5月上旬至6月下旬，適宜的花蕾較多。每天09：00時(shí)左右開(kāi)始授粉。首先確定父本材料，采集冠>萼即將開(kāi)放的新鮮花朵，放入事先準(zhǔn)備好的小紙袋中，標(biāo)上名稱。隨后，將母本材料優(yōu)異單株枝條上已開(kāi)過(guò)的花序和冠<萼的花蕾摘除，選擇冠>萼、冠=萼的花序。授粉時(shí)輕輕將母本花序旗瓣或龍骨瓣劃破,露出柱頭；拿出一朵父本的花序，撕下花龍骨瓣處的萼片，從兩龍骨瓣之間分開(kāi)花冠，露出黃色的花藥；將花粉團(tuán)整個(gè)夾出，對(duì)準(zhǔn)母本柱頭，輕輕摩擦一兩下，隨后將花粉團(tuán)放在柱頭上，完成授粉(見(jiàn)圖4)。

圖4 雜交步驟Fig.4 Hybrid steps

授粉完成后，在花朵下方系上紅繩作為標(biāo)記，套上授粉袋子。在所作組合的枝條掛上標(biāo)簽，注明父母本編號(hào)和名稱，以及授粉日期和雜交人員信息。授粉1周后，檢查雜交莢是否成活。

2.6 雜交組合配制

以HQHY-3×HQWT-6、HQWT-6×HQHY-3分別配置100個(gè)組合。

從表2可以看出，HQHY-3親本材料單獨(dú)種植時(shí)，100個(gè)果莢，空莢率17%，以1莢1粒、1莢3粒占比較高，占比分別為42%、20%。其次為1莢4粒，占比12%，1莢2粒，占比7%，偶有1莢5粒，占比2%。 HQHY-6親本材料單獨(dú)種植時(shí)，100個(gè)果莢，空莢率10%，1莢1粒、1莢3粒均占比28%，1莢2粒占比23%，1莢4粒和1莢5粒占比較低，分別為10%和1%。

HQHY-3和HQWT-6雜交，HQHY-3為母本時(shí)有32個(gè)組合結(jié)實(shí)，以1莢2粒結(jié)實(shí)最多，占比20%，其次為1莢3粒，占比5%，1莢1粒、1莢4粒和1莢5粒較為均勻，均占比2%，偶有1莢6粒，占比1%。HQWT-6為母本時(shí)有33個(gè)組合結(jié)實(shí)，也以1莢2粒結(jié)實(shí)最多，占比18%，其余與HQHY-3為母本時(shí)區(qū)別不明顯，趨勢(shì)基本一致。

3 討論與結(jié)論

種質(zhì)資源是藥用植物進(jìn)行優(yōu)良個(gè)體篩選的物質(zhì)基礎(chǔ), 也是品種改良的源泉。我國(guó)的藥用植物資源是長(zhǎng)期自然選擇和人工選擇的產(chǎn)物,在漫長(zhǎng)的歷史長(zhǎng)河中，由于天然雜交造成的基因重組、分離、基因漂變或突變, 蘊(yùn)藏著豐富的已知或未知的有用基因,使其具有獨(dú)特的優(yōu)良性狀以及抗御自然災(zāi)害的特性，尤其是野生親緣植物和古老的地方種。藥用植物的育種目標(biāo)不僅是提高入藥部位的生物產(chǎn)量，更要提高該部位藥用成分的相對(duì)含量[19-20]。目前，我國(guó)在藥用植物良種選育方面的研究表明，較大規(guī)模人工栽培的中藥材植物中，僅有40%的藥用植物進(jìn)行了良種選育工作，選育出了225個(gè)新品種[21]。在選育的225 個(gè)新品種中，雜交育種僅占育成品種的10.1%，選育法獲得品種占育成品種的71.2%。石斛[22]、天麻[23]、柴胡[24]、半夏[25]，幾種藥用植物都進(jìn)行過(guò)雜交育種研究，但未見(jiàn)育成品種的報(bào)道。綜上所述，中藥材的雜交育種仍處于初級(jí)探索階段。

黃芪作為傳統(tǒng)補(bǔ)氣藥材中的“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”，由于所含的化學(xué)成分多樣，功能強(qiáng)大，藥理作用顯著等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于保健品、食品、飲料等領(lǐng)域[26]。我國(guó)是世界上唯一的黃芪藥材產(chǎn)地和出口國(guó)[27]，面對(duì)國(guó)內(nèi)巨大的市場(chǎng)需求量，我國(guó)野生黃芪種質(zhì)資源被過(guò)度采挖，面臨枯竭[28-29]，黃芪藥材資源供應(yīng)從野生為主轉(zhuǎn)變至栽培為主，蒙古黃芪主產(chǎn)區(qū)逐漸南移，從山西、內(nèi)蒙古轉(zhuǎn)移至陜西、甘肅、寧夏等地。但在黃芪栽培中存在著種質(zhì)混亂混雜的情況，種植基地相互調(diào)換種質(zhì)、冒名使用的問(wèn)題。市場(chǎng)上高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的黃芪品種缺乏，甘肅和山東有選育的黃芪品種，山西和內(nèi)蒙古主產(chǎn)區(qū)尚無(wú)品種選育報(bào)道。建立高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的黃芪種質(zhì)資源庫(kù)以及開(kāi)展黃芪品種選育工作，具有十分重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

蒙古黃芪種植于山西省呂梁市汾陽(yáng)市經(jīng)作所試驗(yàn)田，處于低緯度區(qū)域，花期較早，4月中下旬到6月下旬陸續(xù)開(kāi)放,持續(xù)2個(gè)月之久。為了提高雜交成活率，在蒙古黃芪花期，保證雜交圃的小環(huán)境空氣濕度較高，特別是母本區(qū)域的土壤有充足的水分，若遇干旱要及時(shí)澆水；干旱不嚴(yán)重時(shí)每天傍晚向雜交圃噴水。蒙古黃芪花冠長(zhǎng)度大于或者等于花萼時(shí)，表明其柱頭和花粉均已成熟，與徐昭璽和王麗華[30]的研究結(jié)果一致。由于蒙古黃芪是自花不孕或自交不親和的異花授粉植物[4-5]，因此父本的最佳選擇是冠大于或等于萼的花瓣尚未開(kāi)放,花粉沒(méi)有散掉的小花。編號(hào)為HQWT-3 和HQHY-6的黃芪材料在葉形和花色上差異顯著，遵循優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)原則，進(jìn)行有性雜交，能夠在后代中明顯辨別真假雜交種。