miR-132對新生小鼠認知功能障礙的預防作用及其機制

韓玉琴，蘇鳳龍，關海飛，繆凡

1 承德市婦幼保健院麻醉科，河北 承德 067000；2 承德醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院麻醉科

七氟醚是一種手術麻醉中常用的揮發(fā)性麻醉劑，其特點是起效快、氣道刺激性低、血液/氣體分配系數(shù)低，因此臨床上廣泛應用于嬰幼兒及兒童麻醉［1］。既往研究［2-4］證據(jù)表明，嬰幼及兒童長時間接觸七氟醚會對中樞神經系統(tǒng)有一定的毒性作用，產生神經認知功能障礙，影響其空間記憶以及學習能力。但目前關于七氟醚造成嬰幼兒及兒童神經認知功能障礙的機制尚不完全清楚，并且缺乏有效的干預方法。微小RNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，由22～25個核苷酸組成，在機體細胞生命活動中起著重要的調控作用［5］。miRNA在神經系統(tǒng)中表達豐富，在調控神經認知功能障礙中起重要作用［6-7］。miR-132是在哺乳動物腦組織，尤其是海馬區(qū)組織高表達的miRNA之一，參與神經元生長、樹突生長調控過程，與神經認知功能具有相關性［8］。miR-132對七氟醚誘導的新生小鼠神經認知功能障礙是否有影響尚未可知。本研究通過觀察七氟醚誘導的新生小鼠海馬區(qū)miR-132的表達，探討miR-132對七氟醚誘導的新生小鼠神經認知功能障礙的預防作用及其可能的機制，為兒童神經認知功能障礙機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器6日齡SPF級健康雄性C57BL/6小鼠64只，體質量3～5 g，購自北京維通利華實驗動物公司。七氟醚購自上海恒瑞醫(yī)藥公司；TRIzol mRNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司；所有PCR引物、miRNA模擬物陰性對照agomir-NC和miR-132模擬物agomir-132購自上海吉瑪制藥公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-6檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司；一抗高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、Bax、Bcl-2、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；二抗購自英國Abcam公司。麻醉機、氣體監(jiān)測儀購自德國Draeger公司；PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Morris水迷宮購自北京智鼠多寶生物科技公司；電泳儀、轉膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 動物分組及干預措施所有小鼠采用數(shù)字表法隨機分為4組：正常對照組（A組）、七氟醚組（B組）、七氟醚+agomir-NC組（C組）、七氟醚+agomir-132組（D組），每組16只。A組小鼠給予吸入30%氧氣和空氣的混合氣體共4 h，其他三組小鼠給予4%七氟醚和30%氧氣共4 h。C組和D組在造模前分別給予側腦室注射agomir-NC（100 nmol）和agomir-132（100 nmol），A組和B組給予側腦室注射注射等體積生理鹽水。待七氟醚誘導麻醉干預結束24 h后，在各組小鼠中隨機選擇8只處死，冰上取得海馬組織，-80℃冰箱保存待檢。

1.3 小鼠海馬組織中miR-132的檢測采用qRTPCR法檢測。利用TRIzol試劑提取小鼠海馬組織中的總RNA，逆轉錄成cDNA。加入PCR引物，進行qPCR擴增反應。反應中所需引物的系列：miR-132上 游引 物5′-GCGCGTAACAGTCTACAGCCA-3′，下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6上游引 物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下 游 引 物5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′。反 應 條 件：94℃、10 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、2 min，共35個循環(huán)，用2-ΔΔCt法計算海馬組織中miR-132的相對表達量。

1.4 小鼠海馬組織中HMGB1、Bax、Bcl-2蛋白的檢測采用Western blotting法。用RIPA裂解液提取小鼠海馬組織總蛋白，BCA法定量蛋白。各組取50 μg蛋白樣本行10% SDS-PAGE，將凝膠蛋白半干法轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2.5 h，分別加入 一抗（HMGB1稀 釋度1∶500，Bax稀 釋度1∶1 000，Bcl-2稀釋度1∶1 000，GAPDH稀釋度1∶2 000），室溫搖晃2 h，4℃冰箱孵育過夜，TBST液洗膜3次，加入二抗后室溫搖晃2 h，TBST液洗膜3次，ECL發(fā)光，Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度，計算目標蛋白相對表達水平。

1.5 小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平的檢測采用ELISA法檢測。取小鼠海馬組織，應用勻漿器研磨成漿，4℃、12 000 r/min離心15 min收集上清液，應用ELISA檢測試劑盒測定上清液IL-1β、TNF-α和IL-6。

1.6 小鼠海馬組織SOD、MDA及GSH-PX等氧化應激指標的檢測取小鼠海馬組織，加入預冷的PBS勻漿，4℃、12 000 r/min離心15 min收集上清液，應用SOD、MDA及GSH-PX檢測試劑盒測定上清液SOD、MDA及GSH-PX。

1.7 小鼠神經認知功能的檢測采用Morris水迷宮實驗檢測。每組8只小鼠于七氟醚誘導麻醉干預結束后繼續(xù)培養(yǎng)至出生后第60天（性成熟期）行Morris水迷宮實驗。取性成熟期（出生后第60 d）的各組剩余小鼠進行Morris水迷宮實驗，Morris水迷宮為水池底面直徑150 cm，高30 cm的黑色圓柱形水池，將直徑10 cm，高25 cm的可移動圓形平臺置入水池底第I象限，向水池內注入室溫水，加入氧化鈦使水變成不透明的乳白色，控制水位高于圓形平臺1 cm。實驗分為學習能力檢測（定位航行實驗）和記憶能力檢測（空間探索實驗）。①定位航行實驗：在水池不同象限的中點將小鼠面向池壁放入水池，讓小鼠自由游泳，檢測時間為60 s，記錄小鼠自入水找到平臺并爬上平臺所需時間作為逃避潛伏期（如小鼠入水后一直未能找到平臺或未能爬上平臺，則記錄逃避潛伏期為60 s）以及在此時間內小鼠游泳活動的距離作為游泳距離。每只小鼠進行連續(xù)5 d的實驗，每天實驗4次；②空間探索實驗：定位航行實驗結束后的第2天，撤去隱藏在水面下方可移動圓形平臺，任選1個入水點將小鼠面向池壁放入水池，記錄小鼠120 s時間內穿越原平臺位置的次數(shù)及在原平臺所在象限的停留時間。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)采用±s表示，比較應用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠腦海馬組織中miR-132相對表達量比較A組、B組、C組和D組腦海馬組織miR-132相對表 達量 分 別為1.05±0.09、0.45±0.16、0.49±0.18、0.72±0.12。與A組相比，B、C、D組腦海馬組織miR-132相對表達量均降低（P均＜0.05），B、C組腦海馬組織miR-132相對表達量比較，P＞0.05，與B、C組相比，D組腦海馬組織miR-132相對表達量升高（P均＜0.05）。

2.2 小鼠認知功能的比較 與A組相比，B組、C組和D組逃避潛伏期和游泳距離均明顯增加（P均＜0.05），在原平臺象限的停留時間和穿越原平臺位置的次數(shù)均減少（P均＜0.05）。B組和C組在逃避潛伏期、游泳距離、原平臺象限的停留時間及穿越原平臺位置的次數(shù)等方面比較，P＞0.05。與B組和C組相比，D組逃避潛伏期和游泳距離明顯縮短（P均＜0.05），在原平臺象限的停留時間和穿越原平臺位置的次數(shù)均明顯增多（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠認知功能的比較（±s）

注：與A組比較，△P＜0.05；與B組比較，&P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05。

組別A組B組C組D組n 8 8 8 8逃避潛伏期（s）35.3±2.9 57.2±5.8△56.2±4.9△43.1±3.2△&#游泳距離（cm）116.3±9.7 289.6±22.1△285.2±23.4△165.7±11.6△&#穿越原平臺位置次數(shù)6.0±1.3 1.9±1.2△1.8±1.0△3.7±1.3△&#原平臺象限停留時間（s）38.0±4.8 19.2±5.7△20.2±5.1△27.6±5.9△&#

2.3 小鼠腦海馬組織促炎因子HMGB1蛋白表達及炎性因子水平比較 與A組相比，B組、C組和D組腦海馬組織HMGB1蛋白、IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子水平均升高（P均＜0.05）。B組和C組腦海馬組織HMGB1蛋白、IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子水平比較，P均＞0.05。與B組和C組相比，D組腦海馬組織HMGB1蛋白表達、IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子水平降低（P均＜0.05）。詳見表2。

表2 各組小鼠腦海馬組織炎性因子水平比較（±s）

表2 各組小鼠腦海馬組織炎性因子水平比較（±s）

注：與A組比較，△P＜0.05；與B組比較，&P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05。

組別A組B組C組D組n 8 8 8 8 HMGB1 0.14±0.06 0.82±0.17 0.88±0.14 0.29±0.13 IL-1β（ng/g）2.36±0.82 6.22±1.87△6.30±2.03△4.11±0.93△&#TNF-α（ng/g）5.87±2.01 14.99±4.97△14.37±5.14△9.16±3.19△&#IL-6（ng/g）3.78±1.56 11.32±2.89△11.79±3.03△6.77±2.01△&#

2.4 小鼠腦海馬組織氧化應激指標（SOD、GSHPX、MDA）及細胞凋亡指標（Bax和Bcl-2蛋白）比較與A組相比，B組、C組和D組腦海馬組織SOD、GSH-PX水平及Bcl-2蛋白表達水平降低（P均＜0.05），而MDA水平及Bax蛋白表達水平升高（P均＜0.05）。B組和C組腦海馬組織SOD、GSH-PX、MDA水 平 及Bax和Bcl-2表 達 水 平 比 較，P均＞0.05。與B組和C組相比，D組腦海馬組織SOD、GSH-PX水平及Bcl-2蛋白表達水平升高（P均＜0.05），而MDA水平及Bax蛋白表達水平降低（P均＜0.05）。詳見表3。

表3 各組小鼠腦海馬組織氧化應激水平及細胞凋亡水平比較（±s）

表3 各組小鼠腦海馬組織氧化應激水平及細胞凋亡水平比較（±s）

注：與A組比較，△P＜0.05；與B組比較，&P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05。

組別A組B組C組D組n 8 8 8 8 SOD（U/g）102.11±9.59 28.23±3.75△29.70±3.02△49.56±5.37△&#GSH-PX（U/g）77.40±2.91 18.18±3.58△19.09±3.90△38.50±4.36△&#MDA（nmol/g）14.10±1.97 72.32±3.68△73.94±3.99△48.45±3.14△&#Bax 0.75±0.10 1.56±0.21△1.62±0.19△0.98±0.22△&#Bcl-2 0.97±0.08 0.20±0.10△0.19±0.09△0.45±0.13△&#

3 討論

近年來，麻醉藥物在胎兒和兒童應用中的安全性和風險性引起了各國學者的關注。動物研究［9-10］表明，各種全身麻醉劑均可能對發(fā)育期大腦產生神經毒性，引發(fā)神經元的凋亡性退變。七氟醚是廣泛應用于兒科麻醉的吸入性麻醉劑。研究［11-12］發(fā)現(xiàn)，胎兒或嬰幼兒早期暴露于高濃度的七氟醚可能導致神經炎癥、神經元凋亡以及神經傳導抑制，影響學習記憶，從而造成神經認知功能障礙。海馬區(qū)是參與認知記憶功能的重要腦區(qū)，研究［13］顯示，吸入性七氟醚造成的小鼠海馬區(qū)有關基因的改變是其造成發(fā)育期小鼠大腦神經認知障礙的重要原因。

miRNA是一種小的、內源性的非編碼RNA分子（長度為19～25 bp），通過特異性調節(jié)靶基因表達，控制一系列包括細胞增殖、凋亡、分化等細胞活動過程。研究［14］發(fā)現(xiàn)七氟醚誘導的認知障礙新生小鼠海馬區(qū)腦組織有較多miRNA的異常改變。miR-132定位于染色體17p13.3，是高度保守的miRNA之一，其在神經系統(tǒng)尤其是海馬區(qū)中高表達，具有明顯的組織特異性，參與神經元細胞的增殖、分化、遷移以及軸突生長。動物實驗［15］證實在小鼠出生后7～21 d，其海馬組織中miR-132表達水平逐漸升高，與神經突觸的活躍期明顯相關。研究認為，海馬區(qū)腦組織miR-132表達水平是確保正常學習和記憶的重要因素，其表達缺失能夠導致認知功能障礙。在對阻塞性睡眠呼吸暫停伴認知障礙和缺血性腦卒中后認知障礙的研究［15］中均發(fā)現(xiàn)miR-132表達異常。但至今miR-132對七氟醚誘導的新生小鼠神經認知障礙的影響及機制尚不清楚。本研究中，Morris水迷宮實驗結果顯示七氟醚組小鼠逃避潛伏期和游泳距離均明顯增加，在原平臺象限的停留時間和穿越原平臺位置的次數(shù)均明顯減少，提示七氟醚誘導造成新生小鼠的認知功能障礙。進一步qRT-PCR結果顯示七氟醚組小鼠腦海馬組織miR-132的表達水平明顯降低，提示七氟醚誘導的新生小鼠神經認知功能障礙可能與其海馬區(qū)腦組織miR-132表達異常降低有關。

七氟醚吸入誘導的新生小鼠認知功能障礙的作用機制復雜。目前研究認為其可能與七氟醚誘導造成的炎性因子過度釋放、組織氧化應激從而造成神經元細胞凋亡有關。組織氧化應激水平升高，氧自由基增多可造成神經元細胞膜損傷，從而引起神經系統(tǒng)功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚吸入誘導的新生小鼠腦海馬組織IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性因子水平明顯增高，氧化應激相關指標GSH-PX、SOD水平明顯降低，MDA水平明顯升高，凋亡促進因子Bax蛋白水平升高，凋亡抑制因子Bcl-2蛋白水平降低，提示七氟醚吸入誘導的新生小鼠腦海馬組織炎性因子釋放增多、氧化應激水平升高以及細胞凋亡增多。為了證實海馬區(qū)腦組織miR-132表達水平對七氟醚吸入誘導的新生小鼠認知功能障礙的影響，本研究別給予小鼠側腦室注射miR-132模擬物agomir-132，成功升高了七氟醚吸入誘導的新生小鼠腦海馬組織中miR-132的表達水平，結果顯示小鼠逃避潛伏期和游泳距離均明顯減少，在原平臺象限的停留時間和穿越原平臺位置的次數(shù)均明顯增多，提示agomir-132能夠減輕七氟醚誘導造成新生小鼠的認知功能障礙。并且研究進一步發(fā)現(xiàn)，升高七氟醚誘導新生小鼠腦海馬組織miR-132水平后，其IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性因子水平明顯降低，Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，腦海馬組織MDA水 平 降 低，GSH-PX和SOD水 平 升 高，提 示agomir-132減輕七氟醚誘導造成新生小鼠的認知功能障礙的作用機制可能與其減輕炎性因子釋放、氧化應激以及細胞凋亡有關。

HMGB1是目前發(fā)現(xiàn)的一種重要的促炎因子，胞外HMGB1能與細胞膜上Toll樣受體特異性結合，導致IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性因子大量釋放，而這些炎性因子又能夠激活單核巨噬細胞分泌HMGB1形成正反饋，從而誘發(fā)炎性細胞因子風暴，出現(xiàn)嚴重的炎性反應，加重氧化應激損傷，造成相關器官功能障礙。在動物實驗中已經發(fā)現(xiàn)麻醉可引起認知功能障礙，并伴隨HMGB1表達的增加，抑制HMGB1表達能夠減輕麻醉后小鼠認知功能障礙。近期研究［16］發(fā)現(xiàn)，miR-132能夠靶向調控HMGB1參加機體細胞生命活動。本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚誘導新生小鼠腦海馬組織HMGB1蛋白的表達明顯升高，但miR-132能夠明顯降低七氟醚誘導新生小鼠腦海馬組織HMGB1蛋白的表達水平，提示miR-132對七氟醚誘導新生小鼠認知功能障礙的影響可能與其對HMGB1蛋白的調控有關。

綜述所述，miR-132在七氟醚誘導的認知功能障礙小鼠腦海馬組織中升高。miR-132能夠減輕七氟醚誘導的新生小鼠的認知功能障礙，其機制可能與miR-132抑制HMGB1基因的表達，從而抑制炎癥反應、應激反應及神經元凋亡有關。