生姜提取物抑制培根風(fēng)干成熟過程中的亞硝化反應(yīng)

顧如霞，葛鳳芹，劉步云，李鋒，王永麗

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

亞硝酸鹽是在腌臘肉制品加工過程中被廣泛使用的添加劑，能抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，有利于保護(hù)肉色，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的腌臘肉風(fēng)味，并可延緩脂質(zhì)氧化。但是，在肉制品加工過程中，亞硝酸鹽、硝酸鹽會(huì)和肉中蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物氨基酸、胺類物質(zhì)發(fā)生亞硝基化反應(yīng)生成N-亞硝胺[1]。攝入含過量亞硝胺的食物，會(huì)引起肝臟、腎臟及血小板的的損傷，誘發(fā)食道癌等惡性消化系統(tǒng)疾病[2]。我國(guó)對(duì)食品中亞硝胺殘留有嚴(yán)格的限制，GB 7677-1998規(guī)定肉制品中N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）最高不超過3 μg/kg，N-亞硝胺總含量不得超過10 μg/kg。美國(guó)食藥局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定零售食品中總N-亞硝胺含量不得超過10 μg/kg[3]。因此，研究控制腌臘肉制品生產(chǎn)過程中亞硝基化水平，降低亞硝酸鹽和亞硝胺含量的生產(chǎn)工藝技術(shù)對(duì)于提高腌臘肉的安全品質(zhì)具有重要意義。

酚類化合物具有清除自由基、抗炎癥、抗氧化、螯合金屬離子、抗癌和抗突變等作用[4,5]。富含多酚的果蔬成分或提取物，如葡萄籽提取物[6]、茶葉提取物[7]、漿果類[8]等在肉制品加工中已經(jīng)廣泛應(yīng)用。生姜是一種藥食兩用的植物，也是重要的香辛調(diào)味料，其主要活性成分姜辣素和黃酮等都屬于酚類化合物，可以通過清除自由基和螯合金屬離子，起到抗菌、消炎、抑制氧化活性的功效[9]。在前期研究[10]中發(fā)現(xiàn)生姜提取物能有效抑制亞硝胺的前體物-生物胺的累積，本文以生姜提取物為原料，以DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力為抗氧化指標(biāo)，研究生姜提取物的體外抗氧化能力及總酚含量，并以干腌培根為研究對(duì)象，研究不同添加量（0.15%、0.30%、0.45%和0.75%）的生姜提取物對(duì)中式培根風(fēng)干成熟過程中亞硝酸鹽、3-NT和亞硝胺的抑制效應(yīng)。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法鑒定生姜提取物中的成分，以期獲得抑制亞硝酸鹽和亞硝胺累積的有效成分，為降低風(fēng)干發(fā)酵肉制品有害成分形成，提高肉品品質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮五花肉，購(gòu)于泰安大潤(rùn)發(fā)超市雙匯肉食專柜；永康黃姜由山東省萊蕪市農(nóng)科院提供。

N-二甲基亞硝胺（NDMA），美國(guó)Sigma公司；Folin-酚和1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH），北京索萊寶科技有限公司；四氫姜黃素（Tetrahydrocurcumin，≥96%）、沒食子酸、6-姜酚（6-gingerol，≥98%）、4-姜酚（4-gingerol，≥98%）和1-脫氫-6-姜二酮（1-dehydro-6-gingerdione，≥98%），上海源葉生物科技有限公司；姜酮（Zingerone，≥98%）和6-姜烯酚（6-shogaol，≥98%），南京澤朗生物科技有限公司；食品級(jí)亞硝酸鈉（≥99%）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），青島正業(yè)試劑有限公司；碳酸鈉、乙酸鋅、鹽酸納乙二胺、鹽酸、氫氧化鈉、二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉和亞鐵氰化鉀等為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司；CTHI-250B型恒溫恒濕箱，STIK儀器設(shè)備(上海)有限公司；7890A/5975C三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；LC-LTQ Orbitrap XL MS/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；IKAT18basic型高速分散機(jī)，德國(guó)IKA公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；Turbo Vap LV全自動(dòng)濃縮工作站，美國(guó)Caliper公司；LGJ-22D冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生姜提取物的制備

樣品洗凈去皮、晾干后切成絲狀，按料液比（1:10，m/V）用無(wú)水乙醇于45 ℃恒溫水浴中浸提5 h。收集濾液后再用無(wú)水乙醇重復(fù)提取三次，合并所有濾液。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成膏狀，然后將浸膏溶于水中，加入等體積的乙酸乙酯充分震蕩分層，收集乙酸乙酯層，重復(fù)3次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙酸乙酯有機(jī)層去除，得到膏狀生姜提取物。生姜提取物通過NKA-9 D101大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，冷凍干燥后最終得到純化的生姜提取物。準(zhǔn)確稱量100 mg純化生姜提取物，用甲醇定容至5 mL，配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的儲(chǔ)備液。

1.3.2 生姜提取物中總酚含量的測(cè)定

參照Magalhaes等[11]的方法，將2 mL福林酚試劑加入20 mL比色管中，再加入2 mL溶有0.1 g生姜提取物的乙醇溶液，旋渦震蕩后靜置3 min，再加入2 mL 10%（m/V）Na2CO3溶液，混合均勻后在室溫下放置1 h，在760 nm下測(cè)定吸光值。按照上述方法測(cè)定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液不同濃度梯度的吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由測(cè)得樣品的吸光度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總酚的沒食子酸當(dāng)量濃度（mg/g）。

1.3.3 生姜提取物清除ABTS+自由基能力的測(cè)定

按照Robert等[12]的方法。將儲(chǔ)備液配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL的生姜提取物溶液，精確吸取10 μL不同質(zhì)量濃度的提取物溶液樣品，與290 μL ABTS+自由基溶液混合均勻，避光條件下反應(yīng)15 min，在734 nm處測(cè)定其吸光值。根據(jù)下式計(jì)算樣品對(duì)ABTS+自由基的清除率。

式中：

F——ABTS+自由基清除率，%；

A1——ABTS+和樣品在734 nm處的吸光值；

A0——ABTS+和蒸餾水在734 nm處的吸光值；

A2——樣品和蒸餾水在734 nm處的吸光值。

1.3.4 生姜提取物清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參照Yang等[13]的方法略做修改。將儲(chǔ)備液配制成濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL的生姜提取物溶液，精確吸取10 μL不同梯度的提取物溶液樣品，加290 μL 0.1 mmol/L DPPH自由基甲醇溶液，在37 ℃水浴鍋中保溫30 min，以290 μL DPPH溶液和10 μL蒸餾水的混合溶液為對(duì)照樣品，于517 nm處分別測(cè)定吸光值A(chǔ)1和A0。根據(jù)下式計(jì)算生姜提取液對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：

P——DPPH自由基清除率，%；

A1——DPPH和樣品在517 nm處的吸光值；

A0——DPPH和蒸餾水在517 nm處的吸光值；

A2——樣品和蒸餾水在517 nm處的吸光值。

1.3.5 培根的制作及取樣

將新鮮五花肉分割成25 cm×15 cm×5 cm長(zhǎng)方塊，將肉塊隨機(jī)分成5組，每組15塊。在腌制階段，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的食鹽、150 mg/kg的亞硝酸鈉及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、0.15%、0.30%、0.45%和0.75%（m/m）冷凍干燥后得到的生姜提取物混合均勻，均勻涂抹于肉塊表面，于4 ℃、相對(duì)濕度85%～95%條件下腌制2 d。腌制結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕箱中進(jìn)行風(fēng)干成熟操作，其間溫濕度程序?yàn)椋浩鹗紲囟?3 ℃、環(huán)境濕度85%，然后按照每天溫度升高1.5 ℃、相對(duì)濕度每天降低0.5%進(jìn)行風(fēng)干成熟12 d。以不添加黃姜提取物為樣品對(duì)照，每個(gè)工藝點(diǎn)3個(gè)重復(fù)。

在培根加工過程中的主要工藝點(diǎn)（原料、腌制后、風(fēng)干4 d、風(fēng)干8 d和風(fēng)干12 d）隨機(jī)抽取3塊肉塊，然后將其切碎，將表面和內(nèi)部肉塊混勻即為樣品，用不透光真空袋真空包裝，-20 ℃條件下凍藏備用。

1.3.6 亞硝化影響

1.3.6.1 亞硝酸鹽含量的測(cè)定

按照AOAC:1995[14]方法進(jìn)行。

1.3.6.2 3-硝基酪氨酸含量的測(cè)定

參照Feng等[15]的方法，提取肌原纖維蛋白（MP），用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH值6.25）將MP蛋白膏稀釋到20 mg/mL。取處理好的肌原纖維蛋白溶液100 μL，加入0.36 mL乙腈、0.04 mL 1 mol/L的NBD-F、0.5 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液，混勻在60 ℃水浴2 min。冷卻后過0.45 μm濾膜，進(jìn)液相色譜分析。色譜柱為250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相為磷酸氫鉀-磷酸緩沖液/乙腈（20 mmol/L，pH值3.0），流速為1.0 mL/min，上樣量為10 μL。

1.3.6.3N-二甲基亞硝胺含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取切碎的樣品10.0 g放入離心管中，加入80 mL重蒸二氯甲烷用高速分散機(jī)勻漿30 s，勻漿后超聲提取15 min，經(jīng)10 g無(wú)水硫酸鈉過濾脫水后，收集二氯甲烷有機(jī)相。每個(gè)樣品重復(fù)超聲3次，合并二氯甲烷到平底燒瓶，在50 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL左右，再用氮吹儀濃縮近干，用色譜二氯甲烷定容至1.0 mL，過0.45 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)定[16]。

色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至150 ℃，保持5 min，然后以20 ℃/min升至250 ℃，保持2 min；載氣流速為1 mL/min；電子轟擊（EI）離子源；電離電壓70 eV；電子倍增器電壓1301 eV；進(jìn)樣口溫度為230 ℃，不分流進(jìn)樣；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為250 ℃；測(cè)定采用SIM/全掃描（SCAN）采集模式，掃描質(zhì)量范圍：m/z30～150，溶劑延遲時(shí)間2.5 min，進(jìn)樣量為1 μL。采用外標(biāo)法對(duì)NDMA定量計(jì)算，每次測(cè)定重復(fù)3次。

1.3.7 生姜提取物成分的鑒定

色譜條件：色譜柱Waters XTerra MS C18（4.6×150 mm，5 μm），柱溫30 ℃，樣品是生姜提取物的甲醇溶液，上樣體積為10 μL，二極管陣列檢測(cè)器（掃描波長(zhǎng)200～600 nm），洗脫流量為0.4 mL/min。洗脫劑為乙腈（A）和水（含體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸，B），采用梯度洗脫：0～5 min，3% A；5～30 min，3%～30%A；30～40 min，30%～95% A；40～45 min，95% A；45～48 min，95%～3% A；48～53 min，3% A。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧（ESI）負(fù)離子模式掃描，毛細(xì)管溫度為300 ℃，噴霧電壓為4.5 kV，鞘氣壓力300 kPa，輔助氣壓力34 kPa。一級(jí)質(zhì)譜采用高分辨傅里葉（FT）全掃描采集，掃描范圍m/z：50～1 200 ku，分辨率為60 000，二級(jí)質(zhì)譜采用二維線性離子阱（LTQ）采集，采用碰撞誘導(dǎo)解離（CID）裂解，碰撞能量為35 eV。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行不同處理間單因素方差分析（one-way ANOVA analysis），指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；當(dāng)p＜0.05時(shí)，表示均值間差異顯著，p＜0.01時(shí)，表示均值間差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 生姜提取物中總酚含量的測(cè)定

本課題前期研究測(cè)定了32種生姜提取物中總酚的含量，結(jié)果顯示永康黃姜的總酚含量最高[17]，因此本研究選取永康黃姜為原料。經(jīng)測(cè)定永康黃姜提取物的總酚含量是66.46 mg/g，在腌制階段按照永康黃姜提取物0.15%（m/m）添加量計(jì)算相當(dāng)于99.69 mg/kg總酚，0.30%生姜提取物添加量相當(dāng)于199.38 mg/kg總酚，0.45%提取物添加量相當(dāng)于299.07 mg/kg總酚，0.75%生姜提取物添加量相當(dāng)于498.45 mg/kg總酚含量。

2.2 生姜提取物的抗氧化能力分析

不同濃度生姜提取物對(duì)ABTS+和DPPH自由基的清除能力如圖1所示。不同濃度的生姜提取物對(duì)ABTS+和DPPH自由基均具有較強(qiáng)的清除效果。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，生姜提取物DPPH自由基的清除能力從13.33%增加到了67.34%。當(dāng)DPPH自由基的清除率達(dá)到50%時(shí)，生姜提取物質(zhì)量濃度為0.79 mg/mL。ABTS在氧化劑的作用下可以生成綠色的ABTS+自由基，該自由基在734 nm下有最大吸收；在抗氧劑存在時(shí)，會(huì)抑制ABTS+自由基的產(chǎn)生，通過測(cè)定734 nm下自由基的吸光值變化來(lái)反映樣品的抗氧化能力。生姜提取物質(zhì)量濃度與自由基清除率成正相關(guān)，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS+自由基的清除效能也不斷增加。同等質(zhì)量濃度下，生姜提取物對(duì)ABTS+自由基的清除作用較DPPH自由基清除作用強(qiáng)。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，生姜提取物對(duì)ABTS+自由基清除能力從16.00%增加到了72.67%。當(dāng)ABTS+自由基清除率為50%時(shí)，生姜提取物質(zhì)量濃度為0.63 mg/mL。

在這兩種自由基清除體系中，ABTS+和DPPH自由基的清除能力與姜酚含量呈極顯著相關(guān)性（p＜0.01），表明姜酚能夠通過提供電子和氫，直接消除自由基，因此具有較好的抗氧化效果。Stoilova等[9]研究了生姜提取物的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)姜粉提取物中含有870.10 mg/g的酚類化合物，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到90.10%。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)姜酚中脫氧姜酮和姜酮能有效清除DPPH和ABTS+自由基，且DPPH和ABTS+自由基清除率有一定相關(guān)性，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 生姜提取物對(duì)ABTS+自由基和DPPH自由基清除率Fig.1 ABTS+ and DPPH free radical scavenging activity of ginger extracts

2.3 不同生姜提取物添加量對(duì)培根風(fēng)干成熟過程中亞硝酸鹽殘留量的影響

表1為不同生姜提取物添加量對(duì)培根風(fēng)干過程中亞硝酸鹽殘留量的影響。原料中亞硝酸鹽含量最低，各處理組樣品腌制后亞硝酸鹽殘留量顯著升高（p＜0.05），0.75%添加量處理組中亞硝酸鹽為67.84 mg/kg，為所有處理組中最低。隨著風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組樣品中亞硝酸鹽殘留量都呈逐漸降低的趨勢(shì)（p＜0.05）。添加生姜提取物能顯著降低（p＜0.05）培根風(fēng)干過程中亞硝酸鹽含量，風(fēng)干結(jié)束時(shí)0.45%和0.75%添加量處理組的亞硝酸鹽殘留量分別為17.00 mg/kg和15.91 mg/kg，分別比對(duì)照組降低了37.55%和41.55%（p＜0.05）。風(fēng)干4 d開始，隨著生姜提取物添加量增加，其對(duì)亞硝酸鹽清除效果也逐漸增加。

Li等[7]報(bào)道葡萄籽提取物和茶多酚能顯著降低亞硝酸鹽的殘留量（p＜0.05），亞硝酸鹽的殘留量可能與初始亞硝酸鹽的水平及多酚含量有關(guān)，且亞硝酸鹽在發(fā)酵香腸中的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)與本研究一致。陳冬麗等[19]研究發(fā)現(xiàn)南姜提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率達(dá)53.12%。Riel等[20]報(bào)道西芹提取粉添加到香腸中對(duì)亞硝酸鹽殘留的影響，與對(duì)照組相比可以使亞硝酸鹽殘留量顯著降低40%，指出亞硝酸鹽在多酚還原劑存在下顯著影響其轉(zhuǎn)化和降解速度。在培根風(fēng)干成熟過程中亞硝酸鹽殘留量逐漸降低，可能與微生物代謝產(chǎn)生的外源酶與肌肉中存在的內(nèi)源酶有關(guān)[21]，亞硝酸鹽在這些酶的作用下分解成NO和亞硝酸，轉(zhuǎn)變產(chǎn)物通過和內(nèi)源物反應(yīng)降低亞硝酸鹽含量[22]。生姜提取物具有多個(gè)酚羥基，還原力較強(qiáng)，亞硝酸鹽在酸性環(huán)境中轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的亞硝酸，隨后與酚羥基反應(yīng)生成氮?dú)?，達(dá)到顯著降低風(fēng)干培根中亞硝酸鹽的含量[23]。

表1 不同生姜提取物添加量對(duì)干腌培根加工過程中亞硝酸鹽殘留量的影響Table 1 The residual nitrite contents during dry-cured processing of bacons treated with different levels of ginger extracts

表2 不同生姜提取物添加量對(duì)干腌培根加工過程中3-硝基酪氨酸的影響Table 2 The 3-nitrotyrosine contents during dry-cured processing of bacons treated with different levels of ginger extracts

2.4 不同生姜提取物添加量對(duì)培根加工過程中3-硝基酪氨酸的影響

表2為不同生姜提取物添加量對(duì)培根加工過程中3-硝基酪氨酸（3-NT）的影響。隨著風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組3-NT含量都顯著升高（p＜0.05）。在風(fēng)干過程中，亞硝酸鹽可以產(chǎn)生活性氮，如NO能進(jìn)一步與超氧化物自由基反應(yīng)形成過氧硝酸鹽，過氧硝酸鹽可以啟動(dòng)蛋白質(zhì)的亞硝化作用，產(chǎn)生3-NT[15]。風(fēng)干12 d對(duì)照組中3-NT含量最高為16.72 nmol/mg，當(dāng)生姜提取物添加量為0.45%時(shí)，顯著抑制3-NT生成（p＜0.05），比對(duì)照組降低了8.55%（m/m）。本研究發(fā)現(xiàn)添加生姜提取物能顯著降低蛋白亞硝基化水平，這與Villaverde等[24]發(fā)現(xiàn)抗壞血酸可以有效降低肌原纖維蛋白3-NT的形成，抑制亞硝基化進(jìn)程結(jié)論一致。生姜提取物抑制亞硝基化作用可能與其對(duì)羥基自由基等活性物質(zhì)的清除作用有關(guān)。

2.5 不同生姜提取物添加量對(duì)培根加工過程中亞硝胺的影響

表3為不同生姜提取物添加量對(duì)培根加工過程中亞硝胺的影響。原料和腌制后肉樣中均無(wú)N-二甲基亞硝胺（NDMA）檢出，對(duì)照組和生姜提取物添加組在風(fēng)干4 d后（0.15%、0.30%、0.45%、0.75%，m/m）開始有N-二甲基亞硝胺檢出，此時(shí)對(duì)照組中NDMA含量最高為0.54 μg/kg，0.75%添加量處理組為0.39 μg/kg。在整個(gè)風(fēng)干成熟過程中，NDMA含量在所有處理組中均隨著加工時(shí)間顯著增加（p＜0.05），0.75%添加量處理組NDMA檢出量最低，風(fēng)干結(jié)束時(shí)達(dá)到最大值，對(duì)照組、0.15%、0.30%、0.45%和0.75%處理組NDMA含量分別達(dá)到了1.03、0.97、0.83、0.70和0.65 μg/kg，其中0.75%添加量處理組比對(duì)照組降低了36.89%，而0.75%與0.45%添加量處理組間無(wú)顯著差異（p＞0.05）。

我國(guó)規(guī)定肉制品中NDMA最高檢出不得超過3 μg/kg，風(fēng)干結(jié)束對(duì)照組中NDMA最大含量為1.03 μg/kg，未超過國(guó)家規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)，且0.45%和0.75%添加量能顯著降低亞硝胺的含量（p＜0.05）。加工過程中NDMA檢出量的升高可能與培根風(fēng)干成熟過程中微生物代謝及生物胺累積有關(guān)，腌制階段添加的亞硝酸鹽與亞硝胺前體物-生物胺反應(yīng)生成亞硝胺[25,26]。Xiao等[27]在發(fā)酵香腸中接種戊糖乳桿菌對(duì)亞硝胺的影響，研究發(fā)現(xiàn)通過降低亞硝胺的前體物質(zhì)（亞硝酸鹽、生物胺）可以抑制亞硝胺的生成。結(jié)合表1結(jié)果可知，0.75%添加量能顯著降低亞硝酸鹽殘留量（p＜0.05），亞硝酸鹽是亞硝胺的前體物質(zhì)，亞硝酸鹽和肌肉中二級(jí)胺反應(yīng)生成亞硝胺，可能是導(dǎo)致0.75%生姜提取物處理組亞硝胺含量降低的原因。生姜提取物具有酚羥基，能與亞硝酸根進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，抑制亞硝基化試劑如NO2、N2O3、ONOOH生成[22]，降低亞硝胺前體物濃度，從而降低培根中亞硝胺的積累。

表3 不同生姜提取物添加量對(duì)干腌培根加工過程中亞硝胺的影響Table 3 NDMA content during dry-cured processing of bacons treated with different levels of ginger extracts

表4 生姜提取物L(fēng)C-LTQ Orbitrap MS/MS鑒定結(jié)果Table 4 Identification of ginger extract by LC-LTQ Orbitrap MS/MS

2.6 生姜提取物的成分鑒定

為進(jìn)一步確定生姜提取物對(duì)亞硝酸鹽及亞硝胺抑制作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本試驗(yàn)對(duì)生姜提取物的主要活性成分進(jìn)行了鑒定。生姜提取物活性成分鑒定總離子流圖見圖2。根據(jù)總離子流圖2中的保留時(shí)間、質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)從生姜提取物中共檢測(cè)鑒定出13種主要成分（見表4）。生姜提取物具有抗腫瘤、降低膽固醇和抗炎癥等作用[28,29]，本研究結(jié)果表明生姜提取物還能有效清除ABTS+和DPPH自由基。生姜提取物中富含酚羥基，羥基上的活潑氫能捕捉自由基，從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[30,31]，H+消耗亞硝酸根，進(jìn)而降低亞硝胺累積。由鑒定結(jié)果得知生姜提取物中大多是姜酚類物質(zhì)，包括姜酮、姜黃素、6-姜烯酚、6-姜酚、8-姜酚、4-姜酚、四氫姜黃素和去甲氧基姜黃素等，說(shuō)明姜酚類物質(zhì)有潛在的清除亞硝酸鹽及降低亞硝胺累積的能力，是有效抑制亞硝胺累積的天然提取物。

圖2 生姜提取物總離子流圖Fig.2 The total ion chromatogram of ginger extract

3 結(jié)論

亞硝胺的致癌性、致畸和致突變性與氧化損傷有密切聯(lián)系，酚類物質(zhì)因其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其酚類結(jié)構(gòu)能清除生物體內(nèi)羥基自由基和超氧自由基。生姜提取物能顯著清除ABTS+和DPPH自由基（p＜0.05），風(fēng)干結(jié)束時(shí)，0.75%生姜提取物添加量處理組中亞硝酸鹽殘留量、3-NT和NDMA含量分別比對(duì)照組降低了41.55%、11.72%和36.89%（p＜0.05）。研究結(jié)果表明生姜提取物能清除亞硝酸鹽殘留，顯著降低3-硝基酪氨酸和亞硝胺的累積。最后采用LC-LTQ Orbitrap MS/MS技術(shù)從永康黃姜提取物中共鑒定到13種成分，大多是姜酚類物質(zhì)，分別是甲氧基-4-姜酚、姜酮、姜黃素、甲基-4-姜酚、四氫姜黃素、去甲氧基姜黃素、6-姜二醇、1-脫氫-6-姜二酮、6-脫氫-6-姜酚、4-姜酚、6-姜烯酚、6-姜酚和8-姜酚，研究結(jié)果將為開發(fā)以生姜為原料的功能食品降低發(fā)酵肉制品中有毒有害物質(zhì)提供技術(shù)參考。