超聲輔助酶解制備草魚鱗膠原肽及其理化特性評價

趙鈺，余小月，熊喆，秦子波，王希搏，榮建華,，熊善柏,，胡楊,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北武漢 430070）

（2.生物活性肽技術(shù)湖北省工程研究中心，湖北荊州 434000）

草魚作為四大家魚之一，是我國主要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚種，2020年我國淡水養(yǎng)殖草魚產(chǎn)量為5.57×106t，位于四大家魚之首[1]。在草魚加工過程中，會產(chǎn)生大量的加工副產(chǎn)物，這些加工副產(chǎn)物除了少部分被制成了魚粉或一些低附加值的產(chǎn)品外，絕大多數(shù)被掩埋或者丟棄，同時也導(dǎo)致了環(huán)境污染的問題。草魚鱗含有豐富的蛋白質(zhì)，是一種良好的膠原肽制備原料。膠原肽是膠原經(jīng)適度水解后得到的單條肽鏈組成在兩個氨基酸以上，且90%以上的分子量小于10 000 u的產(chǎn)品，其在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域均有著廣闊的應(yīng)用前景。

酶解法因具有安全、環(huán)保、易控制等優(yōu)點，是制備草魚鱗膠原肽的主流方法[2,3]。目前已有不少學(xué)者通過單酶酶解[4]或多酶酶解[5]的方法酶解青魚魚鱗、羅非魚魚鱗、草魚魚鱗等制備了一系列魚鱗膠原肽產(chǎn)品[6-8]。當(dāng)前為了進(jìn)一步提高酶解效果，加快酶解進(jìn)程，利用一些物理化學(xué)的加工手段輔助酶解受到了很多研究學(xué)者的關(guān)注。其中，超聲處理是一種行之有效的催化方法和技術(shù)手段，由于其具有環(huán)保和操作方便的特點，被廣泛用于食品中蛋白質(zhì)或多糖的分離提取[9,10]。一般超聲輔助酶解的作用模式可以分為超聲對原料改性模式、超聲對酶改性模式和超聲作用酶解過程模式。目前大部分的超聲輔助酶解工藝中，采用的模式多為超聲對原料改性模式，即超聲僅作為了一種預(yù)處理的方式。也有學(xué)者通過這種超聲預(yù)處理的方式制備了草魚鱗膠原肽[11]。然而采用超聲作用酶解過程的模式，使超聲同時作用于原料底物和酶以及酶解過程，并考察處理條件對產(chǎn)品得率及品質(zhì)影響的研究缺乏深入探索。

本課題旨在以草魚鱗為原料，基于實驗室的基礎(chǔ)工藝條件[12]，在堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶三種單酶酶解以及堿性蛋白酶、風(fēng)味酶分步酶解的過程中施加超聲，其中超聲以短時（10 min）多次的形式分布在酶解過程中，探究超聲時間和超聲功率對酶解效果的影響。以水解度和氮收率為指標(biāo)，確定不同的單酶以及分步酶解制備膠原肽的最佳工藝條件，并對產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行評價，為生產(chǎn)魚鱗膠原肽產(chǎn)品提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚鱗，于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場收集。堿性蛋白酶（200 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、風(fēng)味酶（20 U/mg）等，上海源葉生物科技有限公司。甲醛、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、甲酸、乙二胺四乙酸二鈉、辛酸、碳酸氫鈉、乙酸鎂、十二烷基磺酸鈉等為分析純，乙腈、三氟乙酸為色譜純，國藥化學(xué)試劑有限公司。大豆油，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)中百超市。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市科瑞儀器有限公司；KDE-08型定氮儀，上海精隆科學(xué)有限公司；超聲細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；818型pH計，ORINO公司；IKA2000型高速分散均質(zhì)機(jī)，德國IKA公司；攪拌式超濾杯，美國密理博公司；A300型氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司；18角度激光光散射儀，美國懷雅特技術(shù)公司。

1.3 魚鱗基本成分測定

參考國標(biāo)GB 5009.3-2016[13]，采用直接干燥法測定草魚鱗中水分含量。

參考國標(biāo)GB 5009.6-2016[14]，采用索氏抽提法測定草魚鱗中脂肪含量。

參考國標(biāo)GB 5009.5-2016[15]，采用凱氏定氮法測定草魚鱗中粗蛋白含量。

參考國標(biāo)GB 5009.4-2016[16]，測定草魚鱗中總灰分含量。

1.4 魚鱗的預(yù)處理

參照吳瀟揚(yáng)等[17]的方法，取烘干后的草魚鱗200 g，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液（料液比為1:10），在室溫下攪拌4 h后用蒸餾水洗至中性。隨后加入0.5 mol/L鹽酸溶液，在同樣液比下室溫脫鈣1.5 h，再用蒸餾水沖洗至中性。最后，采用0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液，于室溫下脫脂8 h（料液比為1:10），并用蒸餾水沖洗至中性備用。酶解前將魚鱗在85 ℃的熱水中浸泡1.5 h，并用料理機(jī)攪碎[12]。

1.5 草魚魚鱗膠原肽的制備工藝

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量預(yù)處理過的草魚鱗，加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度，用1 mol/L磷酸或2 g/L氫氧化鈣調(diào)節(jié)起始pH值，加酶后混勻并在磁力攪拌器中水解一定時間，取出后高溫水浴滅酶，離心，取上清液過3 000 u超濾膜，收集濾液真空濃縮后經(jīng)噴霧干燥得到膠原肽。噴霧干燥條件為進(jìn)風(fēng)溫度200 ℃，出風(fēng)溫度90 ℃，進(jìn)樣量200 mL/h。

參考本研究室前期基礎(chǔ)工藝[12]，分別采用堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和分步酶解的方式制備膠原肽，料液比均為1:17。其中，堿性蛋白酶用量為420 U/g，酶解溫度為60 ℃，初始pH值為8.0～8.5，酶解時間為4 h；復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶用量均為450 U/g，酶解溫度為50 ℃，初始pH值為7.0～7.5，酶解時間為4 h；分步酶解過程中，第一步酶解的堿性蛋白酶用量為420 U/g，酶解溫度為60 ℃，初始pH值為8.0～8.5，酶解時間為3 h，第二步酶解的風(fēng)味酶用量為420 U/g，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2 h。在單酶酶解過程中施加不同條件的超聲處理，超聲處理時間范圍為0～40 min、超聲功率為0～600 W。分步酶解過程中施加超聲的功率為300 W，時間為20 min。

1.6 草魚鱗水解產(chǎn)物的指標(biāo)測定

采用甲醛滴定法[18]測定水解液的水解度。

采用凱氏定氮法[19]測定水解液的氮收率。

1.7 草魚鱗膠原肽的功能特性

1.7.1 乳化性

將10.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的膠原肽溶液中加入4.0 mL精制大豆油，在室溫下用均質(zhì)機(jī)10 000 r/min高速均質(zhì)1 min，然后用渦旋振蕩器震蕩10 s，從底部取樣0.1 mL加入到20 mL 0.1%（m/V）的十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液中[20]。以0.1% SDS溶液為空白，測定500 nm處的吸光度A500，以乳化活力指數(shù)表示乳化性。

1.7.2 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

取1.0%（m/V）的膠原肽溶液25 mL，高速均質(zhì)1 min，記錄均質(zhì)停止時和10 min后泡沫的體積，用于表征起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

式中：

F1——起泡性，%；

F2——泡沫穩(wěn)定性，%

V1——均質(zhì)停止時泡沫體積，mL；

V2——10 min后泡沫體積，mL。

1.8 草魚鱗膠原肽的分子量分布

參照GB 31645-2018中的方法[21]，采用高效液相排阻色譜法測定，并略做修改。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品（四聚甘氨酸，Gly-Gly-Tyr-Arg，血管緊張素Ⅱ，蜂毒明肽，甘丙肽）保留時間與分子量對數(shù)關(guān)系做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-0.1598x+4.6484（R2=0.9967）。標(biāo)準(zhǔn)品的上樣濃度為2 mg/mL，樣品的上樣濃度為5 mg/mL。根據(jù)樣品出峰時間和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品分子量分布。

1.9 草魚鱗膠原肽的氨基酸組成

參考GB 5009.124-2016中的方法[22]。

1.10 羥脯氨酸含量測定

參考國標(biāo)GB/T 9696.23-2008中的方法[23]，并略做修改。稱取0.1 g膠原肽，放入具塞試管中，加入6 mol/L HCl 10 mL，于105 ℃烘箱中水解16 h。趁熱過濾，將水解產(chǎn)物過濾至250 mL容量瓶中，用蒸餾水沖洗具塞試管、濾紙3次，定容。吸取10 mL上述水解產(chǎn)物于250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。取4 mL水解液于10 mL試管中，加入2 mL氯胺T溶液，混合后于25 ℃放置20 min，加入2 mL顯色劑，混合后，于60 ℃避光水浴30 min，同時用4 mL蒸餾水代替工作液，重復(fù)上述步驟。于560 nm處測定吸光值。膠原蛋白含量（記為P）和羥脯氨酸含量（記為S）的換算系數(shù)為11.1，計算公式如下：

1.11 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行分析處理，使用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚鱗基本成分分析

由表1中可知，草魚鱗的主要成分為蛋白質(zhì)和灰分，含量分別為62.30%和32.23%，經(jīng)過預(yù)處理后，蛋白含量可達(dá)97.43%，脫灰率可達(dá)95.72%，表明前處理效果良好。

表1 預(yù)處理前后草魚鱗的基本成分表Table 1 Basic components of grass carp scales before and after pretreatment

2.2 超聲輔助酶解制備草魚鱗膠原肽的工藝條件比較

由圖1可知，酶解液的水解度和氮收率在一定范圍內(nèi)與超聲功率或超聲時間成正比。其中堿性蛋白酶酶解在超聲條件為功率300 W、時間20 min時酶解液的水解度達(dá)到最大值7.27%，氮收率達(dá)到最大值33.09%；復(fù)合蛋白酶酶解在超聲條件為功率500 W、時間20 min時酶解液的水解度達(dá)到最大值6.65%，此時的氮收率為25.14%；中性蛋白酶在超聲條件為功率500 W、時間20 min時酶解液的水解度達(dá)到最大值4.85%、此時的氮收率為27.49%；對于分步酶解，超聲時間分布的不同會對草魚鱗酶解液的水解度和氮收率產(chǎn)生顯著的影響（p＜0.05）。當(dāng)超聲方式為J10時，酶解液的水解度和氮收率會同時達(dá)到最大值，此時的水解度為11.05%，氮收率為31.69%，顯著高于其它組別（p＜0.05）。采用堿性蛋白酶水解魚鱗得到的酶解液的水解度最大，復(fù)合蛋白酶次之，中性蛋白酶最小。該結(jié)果與已有文獻(xiàn)報道[24]結(jié)果一致。這可能是酶作用的特異性所致。

對于三種單酶酶解進(jìn)程，在一定的超聲條件范圍內(nèi)，水解度和氮收率均與超聲條件成正比，即超聲的確可以在一定程度上提高酶解效率，但并非超聲功率越大或者超聲時間越長越好。這或許可以從超聲對原料中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和酶活的影響兩個層面進(jìn)行解釋。對于原料而言，超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用會改變或者破壞原料中蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu)，暴露出更多的疏水活性中心，進(jìn)而改變其與酶的接觸機(jī)率，提高酶解效率[25]，若超聲功率過低，或者時間過短時，超聲提供的空化能量不足以使蛋白質(zhì)充分展開，則不利于酶解效果的提升。但當(dāng)超聲強(qiáng)度過大時，蛋白質(zhì)的酶切位點可能會被包埋，這是因為結(jié)構(gòu)已展開的蛋白質(zhì)分子可能會重新聚集形成較大的聚集體，此時蛋白質(zhì)與酶的接觸機(jī)會也隨之降低[26]。另一方面，當(dāng)超聲強(qiáng)度不太高時，酶會表現(xiàn)出較高的催化活性，這可能是因為此時酶分子能量增加、結(jié)構(gòu)更具有柔性。當(dāng)超聲功率過高或者時間過長時，酶的活力會下降，這是因為此時超聲產(chǎn)生的瞬態(tài)空化作用，會釋放出高溫高壓氣流或者強(qiáng)大沖擊波，從而導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)改變，影響酶的催化活性[27]。值得關(guān)注的是，分步酶解的水解度顯著大于單酶酶解的組別，這是因為分步酶解過程中，第二步酶解可以進(jìn)一步減小肽鏈的長度，提高水解度。

圖1 不同超聲條件對草魚鱗酶解液水解度和氮收率的影響Fig.1 Effects of different ultrasonic conditions on the hydrolysis and nitrogen yield of grass carp scales enzymatic solution

2.3 膠原肽的乳化性

由圖2可知，在一定的超聲功率或超聲時間范圍內(nèi)，膠原肽的乳化性與超聲功率或超聲時間成正比。其中堿性蛋白酶酶解在超聲條件為功率300 W、時間20 min時膠原肽的乳化活力指數(shù)達(dá)到最大值65.74 m2/g；復(fù)合蛋白酶酶解在超聲條件為功率300 W、時間20 min時膠原肽的乳化活力指數(shù)達(dá)到最大值84.98 m2/g；中性蛋白酶在超聲條件為功率500 W、時間30 min時膠原肽的乳化活力指數(shù)達(dá)到最大值118.93 m2/g。對于分步酶解，超聲時間分布的不同會對草魚鱗膠原肽的乳化活力指數(shù)產(chǎn)生顯著的影響（p＜0.05）。當(dāng)超聲方式為F20時，膠原肽的乳化性達(dá)到最大值60.55 m2/g，顯著高于其它組別（p＜0.05）。采用中性蛋白酶水解魚鱗得到膠原肽的乳化性最大，復(fù)合蛋白酶次之，堿性蛋白酶最小。即水解度不同，膠原肽的乳化性也存在差異，這與張繼磊等[28]分析不同蛋白酶酶解魚蛋白乳化性的結(jié)果一致。

圖2 不同超聲條件對草魚鱗膠原肽乳化性的影響Fig.2 Effects of different ultrasonic conditions on the emulsification of grass carp scales peptides

乳化性是指蛋白質(zhì)與油和水作用形成乳濁液的能力，蛋白質(zhì)的乳化性取決于親水和親油之間的平衡。本研究表明適宜的超聲條件可以在一定程度上提高膠原肽的乳化性。蛋白質(zhì)表面基團(tuán)和水解度均會對其乳化性產(chǎn)生影響。不同的超聲功率或者超聲時間處理后所制得的膠原肽的表面基團(tuán)不同，其乳化性也存在差異。隨著超聲條件的增強(qiáng)，蛋白質(zhì)先展開后聚集，表面基團(tuán)不同，因此乳化性也存在差異。對比不同的工藝條件，分步酶解的乳化性要低于單酶酶解的乳化性。這可能是因為膠原肽的乳化性質(zhì)還與水解度有關(guān)，一般隨著水解度的增加，乳化性先升高后降低[29]，在合適的水解度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)暴露，有利于乳化性，但當(dāng)水解度較高時，蛋白質(zhì)的分子量降低，此時肽分子不能像完整蛋白質(zhì)分子一樣在界面展開和定向，無法減少界面張力，乳化能力下降[12]。

2.4 膠原肽的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

由圖3可知，在一定的超聲功率和超聲時間范圍內(nèi)，酶解液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性與超聲時間和超聲功率成正比。其中堿性蛋白酶酶解在超聲條件為功率500 W、時間20 min時膠原肽的起泡性達(dá)到最大值23.50%，泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最大值21.60%；復(fù)合蛋白酶酶解在超聲條件為功率500 W、時間20 min時膠原肽的起泡性達(dá)到最大值28.33%，泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最大值24.33%；中性蛋白酶在超聲條件為功率600 W、時間20 min時酶解液的起泡性達(dá)到最大值51.33%、泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最大值43.33%；對于分步酶解，超聲時間分布的不同會對草魚鱗酶解液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著的影響（p＜0.05）。當(dāng)超聲方式為F20時，膠原肽的起泡性和泡沫穩(wěn)定性會同時達(dá)到最大值，此時的起泡性為28.33%，泡沫穩(wěn)定性為19.17%。采用中性蛋白酶水解魚鱗得到膠原肽的起泡性和泡沫穩(wěn)定性最大，復(fù)合蛋白酶次之，堿性蛋白酶最小。

圖3 不同超聲條件對草魚鱗膠原肽起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of different ultrasonic conditions on the foaming property and foam stability of grass carp scales peptides

起泡性是指攪打蛋白質(zhì)產(chǎn)品時捕捉氣體形成泡沫的能力，泡沫穩(wěn)定性是指泡沫間液膜保持液體不析出的能力。超聲作為一種對蛋白質(zhì)進(jìn)行改性處理的方式，可以作為一種輔助手段用于在實際生產(chǎn)中改善蛋白質(zhì)的起泡性。從本研究中可以看出，適宜的超聲條件可以提高膠原肽的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。這可能是由于在超聲的作用下，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得松散，更多的疏水基團(tuán)會暴露出來，繼而有利于蛋白質(zhì)在界面上的擴(kuò)散和聚集。而當(dāng)超聲功率過大或者超聲時間過長時，分散的蛋白質(zhì)又會重新聚集，暴露的疏水基團(tuán)又會被重新掩埋，這不利于蛋白質(zhì)在界面上的擴(kuò)散和聚集[30]。

圖4 不同超聲功率對膠原肽表面疏水性的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic power on the surface hydrophobicity of peptides

從圖4中可以看出隨著超聲功率的增加，膠原肽的表面疏水性先增加后減小，這與起泡性和泡沫穩(wěn)定性的變化趨勢大體相當(dāng)，且可以看出在單酶酶解組別中，表面疏水性最大的中性蛋白酶酶解組的起泡性和泡沫穩(wěn)定性最高。對不同酶解工藝的起泡性和泡沫穩(wěn)定性進(jìn)行比較可知分步酶解的起泡能力與單酶酶解相比較差，這可能是因為水解程度也會對起泡性產(chǎn)生一定的影響[31]。酶解的過程可以使蛋白質(zhì)中被掩埋的疏水基團(tuán)暴露出來，增強(qiáng)蛋白質(zhì)對氣液界面處的吸附，降低表面張力，從而改善起泡性。但起泡能力并不是隨著水解程度的增加而持續(xù)增加，因為當(dāng)水解程度過大時肽鏈會逐漸變短或者會生成氨基酸，而這不利于氣液界面形成穩(wěn)定的薄膜，對起泡性存在負(fù)面影響。

2.5 膠原肽的氨基酸組成

由表2可知，不同的酶解條件下制備的膠原肽的氨基酸含量存在一定差別，其中堿性蛋白酶酶解制備的膠原肽的總氨基酸含量最高，其次是分步酶解制備的膠原肽，中性蛋白酶酶解和復(fù)合蛋白酶酶解組的氨基酸含量差異不大。對超聲后的組別進(jìn)行比較，可以看出超聲輔助堿性蛋白酶制備的膠原肽總氨基酸含量最高，超聲輔助分步酶解次之，超聲輔助復(fù)合蛋白酶酶解的含量最低?？傮w看來，無論是每種氨基酸的含量還是總氨基酸含量，超聲后的膠原肽均略高于未超聲的組別。超聲前后堿性蛋白酶酶解制備的膠原肽的氨基酸含量分別為66.30 g/100 g和73.75 g/100 g；超聲前后復(fù)合蛋白酶酶解的氨基酸含量分別為64.00 g/100 g和65.65 g/100 g；超聲前后中性蛋白酶酶解的氨基酸含量分別為61.50 g/100 g和65.90 g/100 g；超聲前后分步酶解的氨基酸含量分別為66.05 g/100 g和70.70 g/100 g。膠原的氨基酸種類和含量與其他的蛋白質(zhì)相比存在一定的差異。膠原中具有絕大多數(shù)蛋白質(zhì)中不具有的羥脯氨酸，同時羥脯氨酸也是膠原的特征氨基酸。在膠原蛋白中甘氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸的含量較高，其中甘氨酸的含量最高，且膠原蛋白中芳香族氨基酸和半胱氨酸含量較少[32]。由表2可知，在所有的膠原肽中含量最高的氨基酸均為甘氨酸。在所有的膠原肽中谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸的含量較高，而組氨酸、酪氨酸的含量較低，且都含有膠原的特征氨基酸羥脯氨酸，符合膠原蛋白的氨基酸特征。

表2 魚鱗膠原肽的氨基酸組成表Table 2 Amino acid composition of grass carp scale collagen peptides

圖5 魚鱗膠原肽的分子量分布圖譜Fig.5 Molecular weight distribution of grass carp scales peptides

2.6 膠原肽的分子量分布

由圖5可知，不同的魚鱗膠原肽的峰形沒有太大的差異，但是出峰時間存在差異。分步酶解的膠原肽的出峰時間要晚于單酶酶解的膠原肽，這是因為在超聲和第二步酶解的雙重作用下酶解過程中生成了更多的小分子肽段；由超聲輔助酶解制得的膠原肽的出峰時間要晚于傳統(tǒng)的酶解方式制得的樣品，這是因為在超聲的作用下酶解過程中生成了更多的小分子肽段。無論超聲與否，所有蛋白酶水解產(chǎn)物分子量均呈現(xiàn)為連續(xù)分布，且較為集中。

由圖6可知，不同蛋白酶的水解產(chǎn)物的分子量分布存在著一定的差異。因為超濾膜的截留率并不能達(dá)到100%，故雖然酶解液均通過了3 000 u的超濾膜，但水解產(chǎn)物還是有小部分大于3 000 u，且所有水解產(chǎn)物的分子量分布主要集中在500 u～1 ku之間。同時可以看出經(jīng)過超聲處理后，膠原肽的分子量分布會向小分子量的范圍偏移。對于堿性蛋白酶，其分子量在500 u～1 ku的范圍內(nèi)占比為24.26%，經(jīng)過超聲處理后該范圍內(nèi)的含量為33.99%；對于復(fù)合蛋白酶；其分子量在500 u～1 ku的范圍內(nèi)占比為28.39%，經(jīng)過超聲處理后該的范圍內(nèi)的含量為32.98%；對于中性蛋白酶；其分子量在500 u～1 ku的范圍內(nèi)占比為20.73%，經(jīng)過超聲處理后該范圍內(nèi)的含量為29.22%；對于分步酶解，其分子量在500 u～1 ku的范圍內(nèi)占比為31.99%，經(jīng)過超聲處理后，該范圍內(nèi)的含量為39.28%。這與張杰等[33]研究超聲對木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布的影響的結(jié)果一致，即超聲后，肽段中小分子量段比例增加。

圖6 魚鱗膠原肽的分子量分布范圍Fig.6 The molecular weight distribution range of grass carp scale peptides

分子量分布是衡量膠原肽品質(zhì)的一個重要特性指標(biāo)[34]。可以看出，不同的酶的種類以及超聲與否均會對膠原肽的分子量分布產(chǎn)生一定的影響。因為在酶法水解蛋白質(zhì)的過程中，酶的作用位點，會影響水解產(chǎn)物分子量的分布范圍，故不同酶解方法制得的膠原肽的分子量分布存在一定的差異。同時有研究表明，酶解液的水解度與其分子量分布相關(guān)[35]，水解度越高，產(chǎn)物小分子量范圍占比越高。在本研究中，分步酶解的水解度最高，堿性蛋白酶次之，中性蛋白酶酶解最低，這與膠原肽分子量分布的范圍基本一致。由于超聲的空化作用可以提高酶解過程的效率，進(jìn)而提高水解度，故超聲輔助酶解制得的膠原肽在小分子量范圍內(nèi)的含量會略高于傳統(tǒng)酶解方法制得的膠原肽。

3 結(jié)論

超聲功率和超聲時間均是超聲輔助酶解制備膠原肽時的重要參數(shù)。本研究采用超聲輔助酶解法制備草魚鱗膠原肽，確定了最佳工藝條件并對所制備的膠原肽的理化特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

超聲可以通過對原料結(jié)構(gòu)和酶活的影響進(jìn)而影響產(chǎn)物得率以及理化特性。超聲輔助單酶酶解的最佳工藝為堿性蛋白酶酶解過程中施加功率300 W，時間20 min的超聲；超聲輔助分步酶解的最佳工藝條件為在堿性蛋白酶酶解過程中施加功率300 W、時間10 min的超聲；在風(fēng)味酶酶解過程中施加的功率300 W、時間10 min的超聲。

超聲后膠原肽的分子量分布會向小分子量的范圍偏移，且分子量主要集中在500 u～1 ku。超聲后膠原肽的總氨基酸含量略有提高，同時超聲對膠原肽的起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性影響顯著。

超聲輔助酶解法可以提高酶解效率，改善膠原肽產(chǎn)品的品質(zhì)，具有較好的應(yīng)用前景。