米曲霉谷氨酰胺酶在黑曲霉中的重組表達(dá)與酶學(xué)特性

陳穎，王斌，潘力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

谷氨酰胺酶（L-谷氨酰胺水解酶，EC 3.5.1.2）可以催化谷氨酰胺脫氨生成谷氨酸，屬于絲氨酸依賴性β-內(nèi)酰胺酶和青霉素結(jié)合蛋白的超家族[1]。谷氨酰胺酶廣泛分布在細(xì)菌[2]、放線菌[3]、真菌[4]以及動物[5]中。由于L-谷氨酰胺酶可以水解谷氨酰胺增加風(fēng)味氨基酸谷氨酸的含量，L-谷氨酰胺酶已被廣泛用于增強(qiáng)發(fā)酵食品的風(fēng)味[6]。Wakayama等[7]將來自嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的耐鹽谷氨酰胺酶添加到醬油發(fā)酵模擬體系中，證明了該谷氨酰胺酶可用于醬油發(fā)酵過程以提升風(fēng)味。真菌是L-谷氨酰胺酶的重要來源[6]。真菌谷氨酰胺酶主要由曲霉屬、木霉屬及酵母生產(chǎn)[8-10]，部分真菌谷氨酰胺酶也已通過了生物安全性評估[11,12]，但有關(guān)真菌來源的谷氨酰胺酶表達(dá)與性能的報道仍然很少[13]。

黑曲霉（Aspergillus niger）屬于絲狀真菌，具有強(qiáng)大的蛋白分泌表達(dá)能力以及成熟的蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)，并被認(rèn)為是GRAS（Generally Regarded as Safe）安全菌株，在工業(yè)上已被應(yīng)用于食品級酶制劑的生產(chǎn)宿主[14-16]。并且近年來，黑曲霉的基因組編輯技術(shù)已成功建立[17-21]，促進(jìn)了在黑曲霉中利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行遺傳操作。其次，將工程菌表達(dá)與傳統(tǒng)育種方法如常壓室溫等離子體誘變技術(shù)（ARTP誘變技術(shù)）結(jié)合，可進(jìn)一步提高工程菌的蛋白產(chǎn)量[22-24]。

米曲霉RIB40是應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造的模式菌株，對米曲霉谷氨酰胺酶基因gahB的重組表達(dá)，有助于進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì)，并為將gahB應(yīng)用于醬油釀造及增加醬油的風(fēng)味物質(zhì)成分奠定基礎(chǔ)。本研究以低蛋白背景的無孢黑曲霉HL-1為宿主，表達(dá)米曲霉RIB40（Aspergillus oryzaeRIB40）來源的谷氨酰胺酶基因gahB，建立了谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株通量鑒定篩選方法，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及ARTP誘變技術(shù)進(jìn)一步提高谷氨酰胺酶的表達(dá)量并研究了重組酶gahB的酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（E. coli）Match1T1感受態(tài)購自美國Invitrogen公 司；米 曲 霉RIB40（Aspergillus oryzaeRIB40，A.oryzaeRIB40）菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏；黑曲霉（Aspergillus niger，A.niger）菌株HL-1（?kusA、?pyrG、?glaA、?TEG、?aamA）、通用質(zhì)粒UEV、質(zhì)粒pFC332-amyA由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保藏。

1.1.2 工具酶、試劑盒和試劑

快速限制性內(nèi)切酶ApaI、EcoRV、DreamTaq Green PCR Master Mix，美國ThermoFisher Scientific公司；PCR反應(yīng)預(yù)混酶Prime STAR HS（premix），日本TaKaRa公司；HiFi DNA Assembly Cloning Kit，美國NEB公司；谷氨酸（Glu）含量檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、質(zhì)粒大量提取試劑盒，廣州捷倍斯生物科技有限公司；其他試劑均為為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：1%胰蛋白胨、1%氯化鈉、0.5%酵母提取物（固體含2%瓊脂，液體含0.05%瓊脂）；CD培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：2%葡萄糖、0.3%NaNO3、0.2% KCl、0.05% MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、0.001% FeSO4·7H2O，pH值5.5（固體含2%瓊脂，液體含0.05%瓊脂）；表型鑒定培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：2%葡萄糖、1%谷氨酰胺、0.3% NaNO3、0.2% KCl、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、0.0015%酚紅、0.001% FeSO4·7H2O、2%瓊脂，pH值5.5；蔗糖高滲培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：40%蔗糖、0.3% NaNO3、0.2%KCl、0.05% MgSO4·7H2O、0.1% KH2PO4、0.001%FeSO4·7H2O，pH值5.5；發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：5%玉米淀粉（需沸水浴加淀粉酶液化）、3%玉米漿、2%豆粕粉。

1.1.4 引物

實(shí)驗(yàn)中所使用的引物如表1所示。

1.2 儀器

Veriti 96-Well Thermal CyclerPCR儀，美國Applied Biosystems公司；浸入式水平電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；M200多功能酶標(biāo)儀，德國TECAN公司；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)AKTA purifier與His TrapTMHP層析柱，美國GE Healthcare（通用電氣）公司；ARTP-M誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酰胺酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建

在基因表達(dá)框前加上黑曲霉糖化酶基因glaA的信號肽，并在N端加上6×His-Tag標(biāo)簽序列。以引物對PnaII-F和PnaII-R擴(kuò)增得到雜合啟動子片段；以A. oryzaeRIB40基因組為模板，引物對gahB-F和gahB-R擴(kuò)增得到基因gahB。利用EcoRV將通用質(zhì)粒UEV進(jìn)行線性化。利用NEBuilder HiFi DNA連接酶對線性化質(zhì)粒UEV、雜合啟動子PnaII片段和米曲霉谷氨酰胺酶基因gahB片段進(jìn)行連接，并將連接液轉(zhuǎn)化E. coliMatch1T1感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)過氨芐抗性標(biāo)記篩選、菌液電泳驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證以及測序最終確定序列正確的谷氨酰胺酶重組表達(dá)載體，并將其命名為UEV-gahB。

表1 引物Table 1 Primer

1.3.2 谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

取無孢黑曲霉A.nigerHL-1的CD菌液接種于加有尿嘧啶核苷的液體DPY培養(yǎng)基中，于250 r/min，30 ℃條件培養(yǎng)72 h。將谷氨酰胺酶重組表達(dá)載體UEV-gahB擴(kuò)大培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒后酶切純化，并將獲得的片段利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至作為宿主的無孢黑曲霉A. nigerHL-1原生質(zhì)體中[25]。當(dāng)CD平板上的菌落長成較為堅(jiān)實(shí)的單菌落時提取轉(zhuǎn)化子基因組，使用 引 物 對gahB-up-F和gahB-up-R、引 物 對gahB-down-F和gahB-down-R對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR上游與下游鑒定。用PCR反應(yīng)鑒定目的基因是否成功整合進(jìn)宿主的基因組。篩選得到構(gòu)建成功的谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株，并將其命名H-gahB。

1.3.3 谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株通量鑒定篩選方法的建立

（1）表型板鑒定：在CD固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1%（m/V）谷氨酰胺，0.001 5%（m/V）酚紅可得到表型鑒定培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至鑒定培養(yǎng)基，若轉(zhuǎn)化子具有谷氨酰胺酶活性，則可以分解培養(yǎng)基中的谷氨酰胺生成氨，使得培養(yǎng)基pH值升高，而酚紅在堿性條件下會變紅，可根據(jù)菌落是否變紅、變紅的快慢及變色圈的大小初步確定陽性轉(zhuǎn)化子。

（2）孔板發(fā)酵篩選：將經(jīng)過表型板鑒定的轉(zhuǎn)化子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板?？装逵?50 r/min、30 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)，在菌體開始裂解時取樣，之后每隔24 h取樣，測定谷氨酰胺酶酶活力。

（3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將孔板發(fā)酵篩選得到的酶活力最高的轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)接到液體CD培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接入盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件為5%（V/V）接種量，250 r/min，30 ℃。共培養(yǎng)7 d，每24 h取一次樣，測定谷氨酰胺酶酶活力。

1.3.4 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株

取無孢黑曲霉A. nigerHL-1的CD菌液于加有尿嘧啶核苷的DPY中培養(yǎng)，用于制備原生質(zhì)體。將谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株UEV-gahB擴(kuò)大培養(yǎng)，同時將含有CRISPR/Cas9基因編輯工具的質(zhì)粒pFC332-amyA擴(kuò)大培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒并進(jìn)行濃縮。將獲得的質(zhì)粒UEV-gahB與質(zhì)粒pFC332-amyA共同轉(zhuǎn)化至作為宿主的無孢黑曲霉HL-1中。將篩選得到的谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株命名為C-gahB。

1.3.5 谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株的ARTP誘變篩選

選取谷氨酰胺酶酶活力最高的一株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行ARTP誘變。將待誘變轉(zhuǎn)化子接至內(nèi)孢子誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后過濾收集孢子，使用ARTP-M誘變育種儀進(jìn)行誘變。具體參數(shù)為功率120 W、氣量10.0 SLM，時間分別設(shè)為0、30、60、90、120、150、180、210、240和270 s。將誘變處理完畢的載片洗脫后涂布在表型鑒定培養(yǎng)基上。將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)。制作致死率曲線，確定最佳誘變時間后進(jìn)行誘變處理，將篩選得到的谷氨酰胺酶表達(dá)菌株命名為A-gahB。

1.3.6 谷氨酰胺酶酶活力測定

取待測轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液用于酶活力的測定，測定酶活力的方法參照Wael等[8]的方法并做適當(dāng)改變。實(shí)驗(yàn)組為700 μL pH值為7.0的磷酸緩沖液、50 μL轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液和250 μL 0.04 mol/L谷氨酰胺溶液混勻后放置于37 ℃水浴鍋反應(yīng)30 min，反應(yīng)完成后加入250 μL 1.5 mol/L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。而后使用谷氨酸含量檢測試劑盒檢測其谷氨酸的含量。對照組為將實(shí)驗(yàn)組中三氯乙酸溶液與谷氨酰胺溶液加入順序調(diào)換，其余不變。谷氨酰胺酶的酶活定義為：在37 ℃，pH值為7.0的條件下，每分鐘催化L-谷氨酰胺生成1 μmol/L L-谷氨酸所需的酶量為一個酶活力單位，以U/mL表示。

1.3.7 重組谷氨酰胺酶純化

在構(gòu)建谷氨酰胺酶基因重組表達(dá)載體時，將6×His-tag的組氨酸標(biāo)簽序列加在了目的基因表達(dá)框的C端。根據(jù)組氨酸標(biāo)簽的對鎳離子的特異親和性，使用鎳柱親和層析的方法對谷氨酰胺酶進(jìn)行純化。將谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d取發(fā)酵上清液，過濾后使用HisTrapTMHP層析柱進(jìn)行純化。上樣體積為15 mL，上樣流量為1 mL/min。采用梯度洗脫法（洗脫液咪唑濃度為0～0.5 mol/L）收集洗脫峰純化液，記錄各個純化液樣品的體積，并進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE蛋白電泳檢測、蛋白含量測定以及酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.3.8 谷氨酰胺酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.8.1 溫度對純化gahB酶活力的影響

最適溫度的測定：在pH值為7.0的條件下，將純化得到的蛋白酶液分別在20、30、37、40、50、60、70、80 ℃條件下反應(yīng)30 min，測定不同溫度條件下谷氨酰胺酶酶活力的變化，以最適溫度下得到的酶活力為100%。溫度穩(wěn)定性的測定：將純化酶液在上述溫度下保溫處理2 h，測定剩余的酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

1.3.8.2 pH對純化gahB酶活力的影響

最適pH的測定：配制不同pH值（4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，在最適溫度下，測定不同pH值條件的谷氨酰胺酶酶活力的變化，以最適pH值條件下測定的酶活力為100%。pH穩(wěn)定性的測定：將純化酶液在上述pH的緩沖液中保溫處理2 h，測定酶液剩余的酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

1.3.8.3 金屬離子對純化gahB酶活力的影響

金屬離子穩(wěn)定性的測定：在標(biāo)準(zhǔn)的酶反應(yīng)體系下，加入不同的金屬離子（Ba2+、Mn2+、K+、Mg2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Na+、Zn2+、Cu2+），在反應(yīng)體系中每種離子的終濃度為5.0 mmol/L，測定酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

1.3.8.4 鹽濃度對純化gahB酶活力的影響

耐鹽性的測定：在標(biāo)準(zhǔn)的酶反應(yīng)體系下，加入不同質(zhì)量的NaCl使得反應(yīng)體系中NaCl的終濃度為0%、5%、10%、15%、18%，測定酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三個平行重復(fù)，取平均值，采用標(biāo)準(zhǔn)差的方式進(jìn)行誤差分析；使用軟件Origin繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株的構(gòu)建與通量鑒定篩選方法的建立

為構(gòu)建谷氨酰胺酶重組表達(dá)載體，以相應(yīng)的引物對擴(kuò)增得到雜合啟動子片段及基因gahB片段（圖1a）。利用連接酶對線性化質(zhì)粒UEV、雜合啟動子片段和基因gahB片段進(jìn)行連接（圖1b），并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中。經(jīng)測序最終得到序列正確的谷氨酰胺酶重組表達(dá)載體UEV-gahB。

圖1 谷氨酰胺酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant vector UEV-gahB

圖2 谷氨酰胺酶基因重組表達(dá)的轉(zhuǎn)化子的表型板鑒定Fig.2 The screening plate identification of transformants for glutaminase gene recombinant expression

為獲得谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株，將表達(dá)載體UEV-gahB轉(zhuǎn)化至無孢黑曲霉A. nigerHL-1中。將PCR鑒定成功的轉(zhuǎn)化子挑取至表型鑒定板并進(jìn)行孔板發(fā)酵（圖2）。圖2a為宿主A. nigerHL-1，其由于其沒有分泌谷氨酰胺酶而沒有在培養(yǎng)基上形成變色圈；圖2b為轉(zhuǎn)化株H-gahB，從圖中可以看出部分轉(zhuǎn)化子形成了較為明顯的變色圈，部分轉(zhuǎn)化子形成了較小的變色圈。挑取變紅的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行孔板發(fā)酵，根據(jù)孔板發(fā)酵酶活成功篩選得到酶活最高的谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株H-gahB-20，酶活力達(dá)到1.34 U/mL。

將孔板發(fā)酵篩選得到的酶活力最高的轉(zhuǎn)化株H-gahB-20轉(zhuǎn)接到液體CD培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，30 ℃靜置培養(yǎng)5～6 d后接入盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件為5%（V/V）接種量，250 r/min，30 ℃。共培養(yǎng)7 d，每24 h取一次樣，用于谷氨酰胺酶酶活力測定與蛋白電泳分析。

谷氨酰胺酶基因重組表達(dá)株H-gahB-20發(fā)酵24 h到168 h的酶活力測定結(jié)果如圖3a所示。由圖可知，H-gahB從24 h時酶活力開始上升，至第96 h時酶活力達(dá)到最大值，最高酶活力為1.35 U/mL，隨后酶活力開始下降。表達(dá)株H-gahB-20發(fā)酵24 h到168 h的蛋白電泳分析如圖3b所示。泳道C為宿主發(fā)酵第96 h上清蛋白條帶，與宿主對照可知H-gahB-20表達(dá)的目的蛋白位于紅框內(nèi)所在位置，大小與目的蛋白預(yù)測大小72.93 ku一致，96 h的目的蛋白條帶最為明顯這與酶活力測定結(jié)果一致。

圖3 H-gahB-20不同發(fā)酵時間的酶活力測定和SDS-PAGE分析Fig.3 Enzyme activity and SDS-PAGE analysis of H-gahB-20 at different fermentation times

2.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)優(yōu)化谷氨酰胺酶的重組表達(dá)

CRISPR/Cas9作為基因編輯技術(shù)，可將目的基因表達(dá)框定點(diǎn)整合到基因組的靶基因位置來提高目的基因的拷貝數(shù)，從而可能提高基因的表達(dá)量。因此選擇利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)來進(jìn)一步提高谷氨酰胺酶表達(dá)量。將質(zhì)粒UEV-gahB與質(zhì)粒pFC332-amyA共同轉(zhuǎn)化至作為宿主的A. nigerHL-1中，將目的片段整合到基因組中具有雙拷貝的基因amyA上。轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示利用CRISPR/Cas9技術(shù)的重組表達(dá)基因gahB轉(zhuǎn)化株在轉(zhuǎn)化板上成功長出。而后利用先前建立的通量鑒定篩選方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，先挑取轉(zhuǎn)化株C-gahB至表型鑒定培養(yǎng)基上進(jìn)行表型鑒定，之后將表型板上變紅的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行孔板發(fā)酵篩選。酶活測定結(jié)果顯示，篩選酶活力最高的一株為C-gahB-17，其酶活力為3.11 U/mL，為孔板發(fā)酵的H-gahB-20的酶活力的2.32倍。結(jié)果表明利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的米曲霉谷氨酰胺酶基因gahB表達(dá)株具有較高的重組表達(dá)水平。

圖4 利用CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)化子（C-gahB-17）不同發(fā)酵時間的酶活力測定和SDS-PAGE分析Fig.4 Enzyme activity and SDS-PAGE analysis of CRISPR/Cas9-transformant (C-gahB-17) at different fermentation times

將孔板發(fā)酵篩選得到的酶活力最高的轉(zhuǎn)化株C-gahB-17進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，用于谷氨酰胺酶酶活力測定與蛋白電泳分析（圖4）。谷氨酰胺酶基因重組表達(dá)株C-gahB-17發(fā)酵24 h到168 h的酶活力測定結(jié)果如圖4a所示。由圖可知，C-gahB-17從第24 h時酶活力開始上升，且從第48 h開始急劇上升，第96 h時酶活力達(dá)到最大值，最高酶活力為3.56 U/mL，隨后酶活力開始下降。表達(dá)株C-gahB-17發(fā)酵24 h到168 h的蛋白電泳分析如圖4b所示。泳道C為宿主發(fā)酵第96 h上清蛋白條帶，與宿主對照可知C-gahB-17表達(dá)的目的蛋白位于紅框內(nèi)所在位置，目的蛋白從第72 h開始有可目測的條帶，第72 h和第96 h條帶最為明顯，第120 h開始條帶又逐漸變淡，這與酶活力測定結(jié)果一致。圖3與圖4相比，可以明顯看出利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行的黑曲霉轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化株C-gahB比普通方法轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化株H-gahB具有更高的酶活力，且SDS-PAGE蛋白電泳中目的蛋白條帶也更為明顯。

2.3 谷氨酰胺酶重組表達(dá)菌株的ARTP誘變篩選

由于ARTP誘變技術(shù)在最佳誘變條件下可以獲得一定的正突變，因此選取此前獲得的谷氨酰胺酶酶活力最高的轉(zhuǎn)化子C-gahB-17進(jìn)行ARTP誘變，以期獲得具有更高谷氨酰胺酶活力的菌株。使用ARTP-M誘變育種儀進(jìn)行誘變時處理樣品時間分別設(shè)為0、30、60、90、120、150、180、210、240和270 s。待平板上長出單菌落時計算單菌落數(shù)，制作致死率曲線（圖5）。隨著誘變時間的增加，黑曲霉致死率升高，在0～60 s之間致死率上升較快，60 s時的致死率超過了50%；當(dāng)誘變時間為150～180 s時，致死率達(dá)到90%～95%之間，當(dāng)誘變時間為270 s時，致死率接近100%。由于當(dāng)致死率在90%～95%之間時可能有最多的正突變，因此確定150 s為最終誘變時間。誘變處理后稀釋梯度涂布平板。最終，挑取變紅最快或最明顯的單菌落至孔板進(jìn)行發(fā)酵。酶活力測定結(jié)果顯示，突變株A-gahB具有谷氨酰胺酶活力，不同突變株之間酶活力有一定差別，其中酶活力最高的一株為A-gahB-7，其酶活力為4.16 U/mL，比出發(fā)菌株C-gahB-17的酶活力提高了0.17倍。結(jié)果表明，利用ARTP誘變技術(shù)可以獲得具有更高酶活力的米曲霉谷氨酰胺酶gahB重組表達(dá)菌株。

圖5 ARTP誘變育種的致死率曲線Fig.5 The lethality rate curve of ARTP

2.4 重組表達(dá)谷氨酰胺酶的純化

根據(jù)組氨酸標(biāo)簽的對鎳離子的特異親和性使用鎳柱親和層析的方法對谷氨酰胺酶gahB進(jìn)行純化。將轉(zhuǎn)化株H-gahB-20以及轉(zhuǎn)化株C-gahB-17進(jìn)行發(fā)酵，并進(jìn)行鎳柱親和層析柱純化谷氨酰胺酶gahB（表2）。經(jīng)過鎳柱親和層析純化的谷氨酰胺酶gahB的比酶活達(dá)到了40.63 U/mg。回收率為31.98%。轉(zhuǎn)化株H-gahB-20與轉(zhuǎn)化株C-gahB-17發(fā)酵第96 h純化前后的SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果見圖6。從圖中可以看出，轉(zhuǎn)化株H-gahB-20純化后的目的條帶十分淡。而轉(zhuǎn)化株C-gahB-17純化前后的 SDS-PAGE蛋白電泳目的蛋白條帶均十分明顯。通過對比純化前后的蛋白條帶，可以確定通過鎳柱親和層析純化得到了單一的目的蛋白重組gahB。

圖6 谷氨酰胺酶gahB的純化Fig.6 The purification of glutaminase gahB

表2 谷氨酰胺酶gahB發(fā)酵上清液的純化Table 2 Purification of gahB from culture supernatant

2.5 重組谷氨酰胺酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 溫度對gahB酶活力的影響

隨著溫度的升高，重組gahB的酶活力先升高，直至最適溫度37 ℃時達(dá)到最高，隨后重組gahB的酶活力便隨著溫度的升高而下降（圖7a）。重組gahB在20 ℃至60 ℃區(qū)間內(nèi)相對酶活力在60%以上，而在70 ℃時相對酶活迅速下降至30%以下。說明重組gahB對高溫敏感。隨后將純化谷氨酰胺酶gahB在上述溫度下保溫處理2 h后測定剩余酶活力，得到重組gahB的溫度穩(wěn)定性曲線（圖7b）。由圖可以看出重組gahB在20 ℃至40 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)穩(wěn)定性較好，保存2 h后可以保持80%以上的相對酶活。而當(dāng)溫度升至50 ℃時相對酶活迅速下降至0，說明重組gahB對高溫十分敏感。

圖7 溫度對gahB酶活力的影響Fig.7 Effects of temperature on the activity of gahB

2.5.2 pH對gahB酶活力的影響

隨著pH的升高，重組gahB的酶活力先升高，直至最適pH值7.0時達(dá)到最高，隨后重組gahB的酶活力便隨著pH的升高而下降（圖8）。重組gahB在pH值5.0至pH值9.0區(qū)間內(nèi)相對酶活力在60%以上，說明重組谷氨酰胺酶gahB為中性酶，在中性條件下酶活力表現(xiàn)最好。由圖可以看出重組gahB在pH值5.5～8.0之間穩(wěn)定性較好，保存2 h后可以保持70%以上的相對酶活力。在pH值4.0～9.0之間可以保持50%以上的相對酶活力，說明重組gahB的pH穩(wěn)定性較好。

圖8 pH對gahB酶活力的影響Fig.8 Effects of pH on the activity of gahB

2.5.3 金屬離子對gahB酶活力的影響

在標(biāo)準(zhǔn)的酶反應(yīng)體系下，加入5.0 mmol/L不同的金屬離子（Ba2+、Mn2+、K+、Mg2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Na+、Zn2+、Cu2+），測定金屬離子穩(wěn)定性（表3）。結(jié)果表明，K+對gahB的酶活力表現(xiàn)具有激活作用，能提升約20%的相對酶活力。其余金屬離子對gahB的酶活力均有不同強(qiáng)度的抑制作用，其中Zn2+和Mn2+的抑制作用最為顯著。

表3 金屬離子對純化gahB酶活力的影響Table 3 Effect of metal ions on the activity of purified gahB

2.5.3 鹽濃度對gahB酶活力的影響

在標(biāo)準(zhǔn)的酶反應(yīng)體系下，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl使得反應(yīng)體系中NaCl的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、5%、10%、15%、18%，測定純化gahB的耐鹽性（圖9）。結(jié)果表明，隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升，gahB的酶活力逐漸下降，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時gahB仍有80%以上的相對酶活力，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升至15%時，相對酶活力降至50%左右，而當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)18%時，gahB僅剩有35.38%的相對酶活力。

圖9 gahB的耐鹽性Fig.9 Salt tolerance of gahB

3 結(jié)論

黑曲霉作為良好的蛋白表達(dá)宿主，具有強(qiáng)大的蛋白分泌表達(dá)能力以及成熟的蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)，已被應(yīng)用于多種酶制劑的生產(chǎn)。黑曲霉菌株HL-1（?kusA、?pyrG、?glaA、?TEG、?aamA）是本實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的高效表達(dá)菌株，由于敲除了多個表達(dá)量高的內(nèi)源蛋白如糖化酶glaA、淀粉酶aamA，使得該菌株在表達(dá)外源基因的能力有顯著提高。利用該宿主，本研究實(shí)現(xiàn)了谷氨酰胺酶基因g a h B在A. nigerHL-1中的重組表達(dá)，所得轉(zhuǎn)化子H-gahB的最高酶活力達(dá)到1.35 U/mL，并通過表型鑒定板以及孔板發(fā)酵建立了通量鑒定篩選方法。通過CRISPR/Cas9優(yōu)化谷氨酰胺酶的重組表達(dá)，其酶活力達(dá)到3.56 U/mL，約為H-gahB的2.64倍。利用ARTP誘變技術(shù)對重組菌株進(jìn)行誘變篩選得到谷氨酰胺酶重組菌株的突變株A-gahB，其發(fā)酵酶活力達(dá)到4.16 U/mL，比出發(fā)菌株C-gahB的酶活力提高了0.17倍。純化后的重組gahB的比酶活達(dá)到40.63 U/mg。重組gahB的最適溫度為37 ℃，最適pH值為7.0，其在20～40 ℃及pH值5.5～8.0之間穩(wěn)定性較好。當(dāng)酶反應(yīng)體系中金屬離子濃度為5 mmol/L時，K+對gahB的酶活力表現(xiàn)具有激活作用，Zn2+和Mn2+則對gahB的酶活力表現(xiàn)有較為強(qiáng)烈的抑制作用。當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時，gahB仍有35.38%的相對酶活力。綜上所述，本研究第一次在黑曲霉中實(shí)現(xiàn)了來源于米曲霉RIB40的谷氨酰胺酶gahB的分泌表達(dá)，為此后對米曲霉谷氨酰胺酶的研究提供了基礎(chǔ)。